وقد تم تمويل هذا العمل من قبل مؤسسة البحوث الألمانية (الألمانية للبحوث).

1. إعداد الحمض النووي وزجاج بال micropipettes للحقن <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نوعية جيدة بال micropipettes الزجاج ضرورية للحد من ارتفاع نسبة الإجهاض الأولي بسبب فقدان السائل الذي يحيط بالجنين. الإجراء لسحب بال micropipettes الزجاج تم توثيقه جيدا 13،18،25. استخدام 1.2 مم قطر الشعيرات الدموية سحبت في سوتر التقليدية P-97 جهاز مع الإعدادات P = 500؛ الحرارة = 300؛ سحب = 40؛ السرعة = 50؛ الوقت = 50. تناسب ساحبة مع 3 ملم خيوط &quot;الحوض الصغير&quot; (سوتر الصك FT330B). وقد أسفرت خيوط حجم 2 مم بالنسبة لنا نتائج مرضية أقل. من ناحية أخرى، الميلا من micropipette نصائح لا يبدو لتحسين النتائج بالنسبة لنا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حل تنقيته، DNA البلازميد خالية من الذيفان الداخلي في برنامج تلفزيوني (الصف خلية الثقافة) تحتوي على 0.1٪ سريع الأخضر إلى تركيز النهائي من 1-2 ميكروغرام / ميكرولتر. سوف الأخضر سريعة تجعل من حل حقن مرئية في البطين الدماغ الجنينية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحميل 10 ميكرولتر من الحل الحمض النووي في micropipette الزجاج. </lI&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> ربط micropipette الزجاج لنظام حقن (مضخة بيكو) أو ماصة الفم. </li></ol> 2. خدر إعداد جداول التشغيل مع وسادة التدفئة والأدوات الجراحية. بدوره على مصادر الباردة ضوء لتسهيل التصور من الأجنة. تطهير الأدوات الجراحية باستخدام على سبيل المثال حبة تعقيم الزجاج. ثلاثة إجراءات التخدير مختلفة ممكنة لهذا البروتوكول (انظر المناقشة). هنا سوف نقوم بوصف واحد ونحن نعتبر أفضل، وذلك باستخدام استنشاق isoflurane ولتحريض التخدير (معدل تدفق 0.5 لتر / دقيقة)، وكذلك صيانة (معدل التدفق 1 لتر / دقيقة). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أعرض الماوس الحوامل في وعاء صغير شفاف (بحيث يبقى الماوس مرئية) متصلا Komesaroff مارك 5 جهاز التخدير من قبل طول قصيرة من الأنابيب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ملء مع المرذاذ isoflurane و، ثم فتح زجاجة الأكسجين تعلق على الجهاز. ضربة واحدة أو اثنين من البقول isoflurane / الأكسجين (0.5 لتر / دقيقة) في وعاء الضغط على الماوس ووتش للتخدير لتعيين فيها </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خذ الماوس خارج، وتغطية عينيه مع مرهم لمنعهم من التجفيف وتناسب قناع التخدير تدفق رأسا على عقب على الفور. </li></ol> 3. البطن <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضع الماوس البطن حتى على وسادة التدفئة (وإلا درجة حرارة جسمها سوف تنخفض سريع جدا مما يقلل فرص الشفاء) وتأمين جسمها في مكانها عن طريق تحديد أربع أرجل لها على الجانبين مع الشريط. تقييم عمق التخدير عن طريق التحقق من فقدان استجابة لتحفيز رد الفعل (على سبيل المثال اصبع القدم أو قرصة الذيل مع الضغط الثابت). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حلق سطح البطن وتعقيمها مع iodophorpovidone-اليود (Braunoderm). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إجراء شق طولي (1-1،5 سنتيمترا) على الجلد في منطقة البطن. ثم قطع الصفاق. وضع الشاش والقطن حول شق. جعل قرن الرحم واحدة مرئية وتخلعها بعناية مع ملقط حادة على PBS-تشطف gauzه. شطف الرحم مع برنامج تلفزيوني في كثير من الأحيان للحفاظ على ترطيبها دائما (أرقام 2A و 2B). أثناء الإجراء بأكمله تجنب سحب مسراق الرحم أو الرحم ضيق، منذ ارتفاع الضغط داخل الرحم وسوف تحيل إلى الجنين يزيد من فرص فقدان السوائل على حقن مما أدى إلى الإجهاض. </li></ol> 4. حقن الحمض النووي في البطين الدماغ <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عقد الرحم في مثل هذه الطريقة التي البطينين الدماغ يمكن تصور. لا إعادة على نطاق واسع الجنين الذي يكمن في وضع غير موات - وهذا يزيد من فرص الإجهاض. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أبحث في رأس الجنين من أعلى، توطين بصريا الفجوة أو الشق بين نصفي الكرة الأرضية القشرية اليسار واليمين. نصفي الكرة الأرضية سهلة للتمييز وعادة ما يمكن أن ينظر إليها البطينين الوحشي داخلها (وينبغي عدم استهداف) كأشكال أكثر قتامة نوعا ما. إذا تم العثور على الجنين لتكون موجهة تماما لحقن الحمض النووي (الارقام ..ES 2C و 2D)، فمن الممكن أن تخترق جدار الرحم وأدخل البطين الثالث في آن واحد. عقد micropipette الزجاج في 45 ° إلى جدار الرحم وثقب في نهاية منقاري من الفجوة بين نصفي الكرة الأرضية القشرية، اختراق لحوالي 1 مم. وبهذه الطريقة غيض من الزجاج micropipette ستدخل البطين الثالث من الدماغ (وليس البطين الجانبي) (أرقام 2C و 2D). في الأجنة أقل المنحى بشكل إيجابي ومن المفيد لأول اختراق جدار الرحم (دائما عند 45 درجة) على مقربة من الرأس جنينية، ضع رأس micropipette في المكان المناسب بين نصفي الكرة الأرضية القشرية، وعندها فقط خرم الدماغ. حقن حوالي 1 ميكرولتر من محلول الحمض النووي في البطين الثالث (حقنة جيدة يملأ البطين بسائل أخضر). كرر نفس الإجراء مع كل الأجنة من الرحم واحد القرن. هذا يسمح لبعض الوقت من أجل حل الحمض النووي لخلط بالتساوي مع السائل البطين والوصول إلى entirه الظهارة العصبية. </li></ol> 5. استهداف المهاد ل electroporation <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تبديل electroporator على وضبط إعدادات وفقا لعمر الجنينية (لE12.5 نستخدمها 5 البقول مربع موجة، 50 V، 50 ميللي ثانية ON/950 ميللي ثانية OFF). كما استخدم القطب الموجب الفولاذ المقاوم للصدأ القطب إبرة (CUY550-10)، وكما القطب السالب القطب شقة جولة (CUY700P4L). (ومن المهم أن الأقطاب الكهربائية هي أصغر من الجنين، منذ وإلا فإن التدفقات الحالية قاب الجنين ولكن ليس من خلال ذلك.) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حدد ل electroporation تلك الأجنة التي ظهري الجانب متروك (أي تحول نحو مجرب) (حيث أن معظم منهم)، وتجاهل أولئك الذين توجه ليست مواتية. هي عليه الآن آمنة للمس أصابع الرحم مع الايثانول تطهيرها أو مع قفازات. عقد الرحم بالملقط، ومع ذلك، من شأنها أن تتداخل مع تدفق التيار خلال electroporation. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخترق جدار الرحم بواسطة رأس الجنين بين الامنSAC iotic والمشيمة من خلال دفع إلى أسفل من خلال ذلك مع غيض من القطب إبرة. استخدام السبابة من اليد الأخرى وكتلة التوجه. حوالي 5 ملم من طرف القطب يجب أن يكون الآن بين الكيس الذي يحيط بالجنين وجدار الرحم، عند حوالي مستوى الدماغ المتوسط ​​(أرقام 2E و2F). تذكر أن هذا هو &quot;استهداف القطب&quot;، لذلك سوف تحدد موقفها الذي هو الأكثر احتمالا للحصول على transfected جزء من الظهارة العصبية طائي. الجنين يجب أن يكون بلطف جدا &quot;تقلص&quot; بين الأقطاب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مع من ناحية أخرى، موقف القطب شقة جولة خارج جدار الرحم على الجانب الآخر من رأس الجنين (أرقام 2E و 2G). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام دواسة التبديل إلى تطبيق الجهد (V 50، 50 ميللي ثانية ON، 950 ميللي ثانية OFF، 5 البقول مربع موجة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> سحب ببطء القطب إبرة للخروج من الرحم في حين تحجم الرحم مع السبابة من اليد الأخرى - إذا السلىيتم فقدان عرة السائل من خلال ثقب الجدار، وعادة ما تجري عملية إجهاض الجنين. كرر الإجراء مع كل الأجنة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> العودة قرن الرحم في البطن وتكرار الحقن و electroporation في القرن بقية. </li></ol> 6. الانتهاء من الجراحة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد الحقن و electroporation من جميع الأجنة، وضع الرحم مرة أخرى في البطن بعناية فائقة، وضعه تماما كما كانت عليه من قبل ورطبة التجويف البريتوني مع المياه المالحة قبل إغلاقه. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خياطة البريتوني مع الخيوط الجراحية (VICRYL Polyglactin 910، 5-0، [إثيكن V4914). لإغلاق استخدام الجلد &quot;توقف غرزة&quot; methodwith خياطة أكثر مقاومة (Supramid نايلون، 6-0، سراج يسنر TO 07171L). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطهير سطح البطن مع بوفيدون اليود (Braunoderm) وحقن غير الستيرويدية المضادة للالتهابات تحت الجلد (على سبيل المثال 100 ميكرولتر من محلول 01:10 من Rimadyl في 0.9٪ كلوريد الصوديوم)، أو حتى أفضل، وهو الأفيونية مثل بوprenorphine (Temgesic، 0.05 و 0.1 مغم / كغم من وزن الجسم في 0.9٪ كلوريد الصوديوم) لتخفيف الألم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الأم من الجهاز مخدر ووضعه في قفص الذي يتم تسخينه بواسطة وسادة التدفئة. رصد الماوس باستمرار حتى يتم استرداد تماما من التخدير. في وقت لاحق، والتحقق من الحيوانات يوميا لضمان أنهم يتماثلون للشفاء من الإجراء دون أي علامة على الإصابة أو الألم. </li></ol> 7. تحليل النتائج <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حصاد الأجنة (أو postnatals) وفقا إلى اليوم المطلوب من التحليل. وقتل الفئران بعد الولادة (1-2 يوم من العمر) بواسطة قطع الرأس. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فصل كل الجنين وفقا لهذا الشرح electroporation السابقة. تشريح الدماغ تحت stereomicroscope والاختيار تحت المجهر للإشارة الفلورية الخضراء (GFP من مراسل) في المنطقة المناسبة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الدماغ اختيارها يمكن تحليلها &quot;جديدة&quot;: إصلاح الأنسجة لفترة قصيرة في بارافورمالدهيد 4٪ وتغرس في الاغاروز 4٪ أو الجيلاتين في واحدlbumin، ثم قسم على جهاز vibratome من نوع (الشكل 3). لمزيد من التحليل المناعى مفصلة (الشكل 4)، البرد حماية المخ في 30٪ من محلول السكروز، تغرس في أكتوبر تصاعد المتوسطة (الأنسجة تيك) ثم قص المقاطع 20 ميكرون في ناظم البرد. </li></ol>

<ol>
	<li>Itasaki, N., Bel-Vialar, S., Krumlauf, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shocking'+developments+in+chick+embryology:+electroporation+and+in+ovo+gene+expression.">Shocking' developments in chick embryology: electroporation and in ovo gene expression.</a> Nat. Cell Biol. 1, E203-E207 (1999).</li><li>Miyasaka, N., Arimatsu, Y., Takiguchihayashi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Foreign+gene+expression+in+an+organotypic+culture+of+cortical+anlage+after+in+vivo+electroporation.">Foreign gene expression in an organotypic culture of cortical anlage after in vivo electroporation.</a> Neuroreport. 10, 2319-2323 (1999).</li><li>Saito, T., Nakatsuji, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+gene+transfer+into+the+embryonic+mouse+brain+using+in+vivo+electroporation.">Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation.</a> Dev. Biol. 240, 237-246 (2001).</li><li>Tabata, H., Nakajima, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+in+utero+gene+transfer+system+to+the+developing+mouse+brain+using+electroporation:+visualization+of+neuronal+migration+in+the+developing+cortex.">Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: visualization of neuronal migration in the developing cortex.</a> Neuroscience. 103, 865-872 (2001).</li><li>Fukuchi-Shimogori, T., Grove, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neocortex+patterning+by+the+secreted+signaling+molecule+FGF8.">Neocortex patterning by the secreted signaling molecule FGF8.</a> Science. 294, 1071-1074 (2001).</li><li>Tabata, H., Nakajima, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurons+tend+to+stop+migration+and+differentiate+along+the+cortical+internal+plexiform+zones+in+the+Reelin+signal-deficient+mice.">Neurons tend to stop migration and differentiate along the cortical internal plexiform zones in the Reelin signal-deficient mice.</a> J. Neurosci. Res. 69, 723-730 (2002).</li><li>Fukuchi-Shimogori, T., Grove, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emx2+patterns+the+neocortex+by+regulating+FGF+positional+signaling.">Emx2 patterns the neocortex by regulating FGF positional signaling.</a> Nat. Neurosci. 6, 825-831 (2003).</li><li>Shimogori, T., Banuchi, V., Ng, H. Y., Strauss, J. B., Grove, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+signaling+centers+expressing+BMP,+WNT+and+FGF+proteins+interact+to+pattern+the+cerebral+cortex.">Embryonic signaling centers expressing BMP, WNT and FGF proteins interact to pattern the cerebral cortex.</a> Development. 131, 5639-5647 (2004).</li><li>Shimogori, T., Grove, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblast+growth+factor+8+regulates+neocortical+guidance+of+area-specific+thalamic+innervation.">Fibroblast growth factor 8 regulates neocortical guidance of area-specific thalamic innervation.</a> J. Neurosci. 25, 6550-6560 (2005).</li><li>Saito, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+electroporation+in+the+embryonic+mouse+central+nervous+system.">In vivo electroporation in the embryonic mouse central nervous system.</a> Nat. Protoc. 1, 1552-1558 (2006).</li><li>Dixit, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+Gene+Delivery+into+Multiple+CNS+Territories+Using+In+Utero+Electroporation.">Efficient Gene Delivery into Multiple CNS Territories Using In Utero Electroporation.</a> J. Vis. Exp. (52), e2957 (2011).</li><li>Rice, H., Suth, S., Cavanaugh, W., Bai, J., Young-Pearse, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+utero+Electroporation+followed+by+Primary+Neuronal+Culture+for+Studying+Gene+Function+in+Subset+of+Cortical+Neurons.">In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons.</a> J. Vis. Exp. (44), e2103 (2010).</li><li>Walantus, W., Castaneda, D., Elias, L., Kriegstein, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Utero+Intraventricular+Injection+and+Electroporation+of+E15+Mouse+Embryos.">In Utero Intraventricular Injection and Electroporation of E15 Mouse Embryos.</a> J. Vis. Exp. (6), e239 (2007).</li><li>Walantus, W., Elias, L., Kriegstein, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Utero+Intraventricular+Injection+and+Electroporation+of+E16+Rat+Embryos.">In Utero Intraventricular Injection and Electroporation of E16 Rat Embryos.</a> J. Vis. Exp. (6), e236 (2007).</li><li>Borrell, V., Yoshimura, Y., Callaway, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+gene+delivery+to+telencephalic+inhibitory+neurons+by+directional+in+utero+electroporation.">Targeted gene delivery to telencephalic inhibitory neurons by directional in utero electroporation.</a> J. Neurosci. Methods. 143, 151-158 (2005).</li><li>Haddad-Tovolli, R., Heide, M., Zhou, X., Blaess, S., Alvarez-Bolado, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+thalamic+differentiation:+gli-dependent+pattern+and+gli-independent+prepattern.">Mouse thalamic differentiation: gli-dependent pattern and gli-independent prepattern.</a> Front Neurosci. 6, 27 (2012).</li><li>Kataoka, A., Shimogori, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fgf8+controls+regional+identity+in+the+developing+thalamus.">Fgf8 controls regional identity in the developing thalamus.</a> Development. 135, 2873-2881 (2008).</li><li>Matsui, A., Yoshida, A. C., Kubota, M., Ogawa, M., Shimogori, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+in+Utero+Electroporation:+Controlled+Spatiotemporal+Gene+Transfection.">Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection.</a> J. Vis. Exp. (54), e3024 (2011).</li><li>Vue, T. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sonic+hedgehog+signaling+controls+thalamic+progenitor+identity+and+nuclei+specification+in+mice.">Sonic hedgehog signaling controls thalamic progenitor identity and nuclei specification in mice.</a> J. Neurosci. 29, 4484-4497 (2009).</li><li>Tanaka, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+regulation+of+the+hypocretin/orexin+gene+by+NR6A1.">Transcriptional regulation of the hypocretin/orexin gene by NR6A1.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 403, 178-183 (2010).</li><li>Tsuchiya, R., Takahashi, K., Liu, F. C., Takahashi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aberrant+axonal+projections+from+mammillary+bodies+in+Pax6+mutant+mice:+possible+roles+of+Netrin-1+and+Slit+2+in+mammillary+projections.">Aberrant axonal projections from mammillary bodies in Pax6 mutant mice: possible roles of Netrin-1 and Slit 2 in mammillary projections.</a> J. Neurosci. Res. 87, 1620-1633 (2009).</li><li>Canteras, N. S., Watson, C., Paxinos, G., Puelles, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Mouse Nervous System. , 539-562 (2011).</li><li>Caqueret, A., Yang, C., Duplan, S., Boucher, F., Michaud, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Looking+for+trouble:+a+search+for+developmental+defects+of+the+hypothalamus.">Looking for trouble: a search for developmental defects of the hypothalamus.</a> Horm. Res. 64, 222-230 (2005).</li><li>Petros, T. J., Rebsam, A., Mason, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+utero+and+ex+vivo+Electroporation+for+Gene+Expression+in+Mouse+Retinal+Ganglion+Cells.">In utero and ex vivo Electroporation for Gene Expression in Mouse Retinal Ganglion Cells.</a> J. Vis. Exp. (31), e1333 (2009).</li><li>Nijagal, A., Le, T., Wegorzewska, M., Mackenzie, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Mouse+Model+of+in+Utero+Transplantation.">A Mouse Model of in Utero Transplantation.</a> J. Vis. Exp. (47), e2303 (2011).</li><li>Altman, J., Bayer, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Development+of+the+Rat+Hypothalamus.">The Development of the Rat Hypothalamus.</a> Adv. Anat. Embryol. Cell Biol. 100, 1-178 (1986).</li><li>Clancy, B., Darlington, R. B., Finlay, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translating+developmental+time+across+mammalian+species.">Translating developmental time across mammalian species.</a> Neuroscience. 105, 7-17 (2001).</li><li>Clancy, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Web-based+method+for+translating+neurodevelopment+from+laboratory+species+to+humans.">Web-based method for translating neurodevelopment from laboratory species to humans.</a> Neuroinformatics. 5, 79-94 (2007).</li><li>Ishii, Y., Bouret, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+birthdate+of+hypothalamic+leptin-activated+neurons+in+mice.">Embryonic birthdate of hypothalamic leptin-activated neurons in mice.</a> Endocrinology. 153, 3657-3667 (2012).</li><li>Karim, M. A., Sloper, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histogenesis+of+the+supraoptic+and+paraventricular+neurosecretory+cells+of+the+mouse+hypothalamus.">Histogenesis of the supraoptic and paraventricular neurosecretory cells of the mouse hypothalamus.</a> J. Anat. 130, 341-347 (1980).</li><li>Shimada, M., Nakamura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time+of+neuron+origin+in+mouse+hypothalamic+nuclei.">Time of neuron origin in mouse hypothalamic nuclei.</a> Exp. Neurol. 41, 163-173 (1973).</li><li>Alvarez-Bolado, G., Paul, F. A., Blaess, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sonic+hedgehog+lineage+in+the+mouse+hypothalamus:+from+progenitor+domains+to+hypothalamic+regions.">Sonic hedgehog lineage in the mouse hypothalamus: from progenitor domains to hypothalamic regions.</a> Neural. Dev. 7, 4 (2012).</li><li>Vann, S. D., Aggleton, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mammillary+bodies:+two+memory+systems+in+one.">The mammillary bodies: two memory systems in one.</a> Nat. Rev. Neurosci. 5, 35-44 (2004).</li><li>Gratsch, T. E., De Boer, L. S., O'Shea, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+inhibition+of+BMP-4+gene+expression+in+postimplantation+mouse+embryos.">RNA inhibition of BMP-4 gene expression in postimplantation mouse embryos.</a> Genesis. 37, 12-17 (2003).</li><li>Wu, N., Yu, A. B., Zhu, H. B., Lin, X. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effective+silencing+of+Sry+gene+with+RNA+interference+in+developing+mouse+embryos+resulted+in+feminization+of+XY+gonad.">Effective silencing of Sry gene with RNA interference in developing mouse embryos resulted in feminization of XY gonad.</a> J. Biomed. Biotechnol. 2012, 343891 (2012).</li><li>Kikuchi, N., Nakamura, S., Ohtsuka, M., Kimura, M., Sato, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Possible+mechanism+of+gene+transfer+into+early+to+mid-gestational+mouse+fetuses+by+tail+vein+injection.">Possible mechanism of gene transfer into early to mid-gestational mouse fetuses by tail vein injection.</a> Gene Ther. 9, 1529-1541 (2002).</li><li>Foust, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravascular+AAV9+preferentially+targets+neonatal+neurons+and+adult+astrocytes.">Intravascular AAV9 preferentially targets neonatal neurons and adult astrocytes.</a> Nat. Biotechnol. 27, 59-65 (2009).</li><li>Xin, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+brain+targeting+mechanism+of+Angiopep-conjugated+poly(ethylene+glycol)-co-poly(epsilon-caprolactone)+nanoparticles.">The brain targeting mechanism of Angiopep-conjugated poly(ethylene glycol)-co-poly(epsilon-caprolactone) nanoparticles.</a> Biomaterials. 33, 1673-1681 (2012).</li><li>Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+selection+for+high-expression+transfectants+with+a+novel+eukaryotic+vector.">Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector.</a> Gene. 108, 193-199 (1991).</li><li>Kaufman, R. J., Davies, M. V., Wasley, L. C., Michnick, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+vectors+for+stable+expression+of+foreign+genes+in+mammalian+cells+by+use+of+the+untranslated+leader+sequence+from+EMC+virus.">Improved vectors for stable expression of foreign genes in mammalian cells by use of the untranslated leader sequence from EMC virus.</a> Nucleic Acids Res. 19, 4485-4490 (1991).</li><li>Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+green+fluorescent+protein.">The green fluorescent protein.</a> Annu. Rev. Biochem. 67, 509-544 (1998).</li><li>Londrigan, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+promoters+for+driving+efficient+transgene+expression+in+neonatal+porcine+islets.">Evaluation of promoters for driving efficient transgene expression in neonatal porcine islets.</a> Xenotransplantation. 14, 119-125 (2007).</li></ol>

يعلن الكتاب أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.

حول التخدير: منذ electroporation في الرحم في منطقة ما تحت المهاد يمكن أن تكون شاقة تقنيا وتتطلب مرات الخدر لفترة أطول، ونحن نفضل للحث والحفاظ على التخدير من خلال الإدارة من خليط من الأكسجين وisoflurane و. في تجربتنا، ويمكن أن تبقى الحيوانات مخدرة بشكل مناسب في هذه الطريقة لفترات تصل إلى ساعة واحدة على الأقل، واستعادة الأم هو سريع جدا، وتحسين بقاء الجنين. مناهج أخرى للتخدير وتتوفر أيضا. يتكون الإجراء الأكثر بسيطة على إحداث وصيانة الخدر عن طريق الحقن داخل الصفاق من 2.5 مل / كجم من وزن الجسم من خليط من الكيتامين (25 ملغ / مل)، Xylazin (1.2 ملغ / مل)، وAcepromazin (0.35 ملغ / مل) في 0.9 ٪ العقيمة كلوريد الصوديوم (&quot;التحرير والسرد الثلاثي&quot;). مع هذا الخليط وحدها، في الجرعات الموصى بها هنا، هو فعل والخدر من حوالي 30 دقيقة (تصل إلى 45 دقيقة في بعض الحالات). هذا هو عادة ما يكفي لelectroporation في الرحم في اللحاء في E12.5 (من خلال ينجection في البطين الجانبي). وميزة هذا الأسلوب هو أنه يتجنب تماما الحاجة إلى الجهاز الخدر وغيرها من المعدات. ومع ذلك، فإن هذا النوع من التخدير داخل الصفاق غير مستحسن إذا مرات أطول من الجراحة ضرورية، لأن غالبا ما يتم اتباع المزيد من الحقن في تخدير الحيوان من أجل إطالة فترة التخدير عليها بالإعدام. ومن الممكن أيضا أن الجمع بين داخل الصفاق والتخدير عن طريق الاستنشاق بواسطة الأول باستخدام حقنة من &quot;التحرير والسرد الثلاثي&quot; (على النحو الوارد أعلاه) من أجل حمل الخدر، ثم الحفاظ عليه عن طريق استنشاق isoflurane و/ الأكسجين. على الرغم من أن مع هذا الأسلوب سيما الخدر لا يمكن الحفاظ عليه طالما هناك حاجة إليها، فإن الانتعاش من الفأرة الحوامل بعد العملية ليست جيدة كما مع استنشاق وحدها. الى جانب ذلك، كلما نستخدم &quot;التحرير والسرد الثلاثي&quot; الحقن داخل الصفاق، وبقاء الجنين النقصان. تحديد المواقع من الأقطاب الكهربائية على رأس الجنين كما هو مبين في <stرونغ&gt; الشكل 2 أمر بالغ الأهمية. لاحظ أنه ليس من الضروري وضع قطب كهربائي &quot;تحت عنوان&quot; في الدماغ البيني (والتي سيكون من الصعب جدا)، ولكن على الجانب منه. القطب إبرة لديه معلومات سرية حادة، ولكن من المفيد أن يكون ذلك شحذ بالإضافة إلى ذلك (وهذا يمكن أن تزيد من فرص ولكن لتجرح الكيس الذي يحيط بالجنين). حاولنا أيضا تلميع كامل يتعرض 10 مم جزء من-10 CUY550 إلى سلك رفيع جدا. ولكن هذا انخفضت بشكل كبير من فرص الحصول على ترنسفكأيشن. في البطن واضح وصريح بما فيه الكفاية. ومع ذلك، فإن المجرب تصل إلى مستوى من المهارة التي تسمح لنسبة البقاء على قيد الحياة عالية من الأجنة (بعد الحقن داخل البطيني الذي اتبعته الإدارة من نبضات كهربائية) بعد منحنى التعلم مسطحة. مهارة الفرد هو عامل مهم بحيث في الرحم electroporation بشكل عام وتطبيقه على منطقة ما تحت المهاد في خاصة يمكن أن يثبت غير عملي تماما بالنسبة لبعض الطلاب<html> . لتقصير فترة التعلم، فضلا عن زيادة التكاثر والتحليل الإحصائي وجدنا أنه من المفيد لملء بروتوكول مفصلة بما في ذلك معلومات عن عدد وموقف الأجنة، والمظهر، ونوعية الحقن وموقف تقريبي من الأقطاب الكهربائية لل الأجنة الفردية. وقد ثبت مقارنة هذه البيانات عن التجربة مع النتائج النهائية، على أساس الجنين تلو الجنين مفيدة لفهم وتحسين إجراءات. تقارير أخرى 20،21 استهدفت منطقة ما تحت المهاد مع Nepagene الملقط من نوع الأقطاب. نحن باستمرار الحصول على نتائج أفضل مع تطبيق واحد إبرة قطب كهربائي واحد مسطح غطاء كهربائي من نفس الشركة المصنعة. في تجربتنا، واستخدام هذا الأسلوب يجعل rostro-الذيلية استهداف أسهل. يبدو أقطاب الملقط تتطلب إما أكثر خبرة / مهارة أو عدد أكبر بكثير من التجارب من أجل تحقيق نتائج مفيدة. jove_content &quot;&gt; اثنين على الأقل من المناهج الأخرى ل transfect بنيات الحمض النووي في منطقة ما تحت المهاد الماوس النامية يمكن مقارنة في الرحم electroporation. ويستند أول واحد أيضا على البطن وحقنها في البطين الدماغ الجنينية، والفرق بينهما أن الحمض النووي من الفائدة التي تحملها الجسيمات الفيروسية الفيروس يصيب الخلايا الظهارية العصبية وبهذه الطريقة transfects بناء لدينا التجريبية - ليس هناك حاجة إلى electroporation المزايا:. الإجراء يتجنب النبضات الكهربائية اللازمة ل electroporation، وبالتالي بقاء الجنين يحسن ربما أهم عيوب هذا الأسلوب. هي: 1) العمل مع الفيروسات يتطلب احتياطات خاصة ومرافق S2، 2) الاستهداف هو وارد على الإطلاق، لأن الجسيمات الفيروسية سوف تنتشر خلال البطين كامل مما يجعله من حيث المبدأ المحتمل أيضا أن بالنقل أي منطقة عصبية ظهارية (طبعا بعض درجة من ترنسفكأيشن في المنطقة ذات الاهتمام هو على الأرجح)، وبطبيعة الحال، في الرحم </eم&gt; التسليم من الفيروسات يطرح أساسا نفس المشكلة كما في الرحم electroporation، أي إجراء جراحة صعبة نسبيا، مع منحنى التعلم مدى اعتمادا قويا على المهارات الفردية للمجرب. المجموعة الأخرى من النهج يتجنب الجراحة تماما، لأنها مبنية على حقن من بنيات ل transfect في مجرى الدم من الفأرة الحوامل. الذيل الوريد (الوريد الذيلية) حقن shRNA 34،35 أو 36 البلازميدات لديه القدرة على التلاعب وراثيا الأجنة في وقت مبكر جدا، على الرغم من استهداف منطقة محددة غير ممكن مع هذا الأسلوب. لا يبدو هذا النهج واعدة مستعدة بعد للتطبيق العام. الجسيمات الفيروسية (الغدة المرتبطة الفيروسات) حقن في الوريد الوجهي من الفئران حديثي الولادة (ولكن ليس الفئران الأكبر سنا) قادر على بالنقل الخلايا العصبية في الدماغ 37. وأخيرا، يمكن أن الجسيمات النانوية، والتي يمكن في نهاية المطاف أن تستخدم ناقلات الحمض النووي، وتصل إلى المخ بعد الذيل الخامسحقن عين في الفئران البالغة 38. هاتين الطريقتين، التي تفتح إمكانية transfecting الأجنة في وقت مبكر جدا، وعلى حد علمنا لم تستخدم حتى الآن على الفئران الحوامل. عمر ترنسفكأيشن وجمع: لتعلم الإجراء، وربما هو أفضل لمحاولة بالنقل E14.5 الأجنة، ومن ثم تخرج إلى وقت سابق، الأعمار الجنينية أكثر صعوبة. في تجربتنا، GFP التعبير مرئيا تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية بالفعل 24 ساعة بعد ترنسفكأيشن. بعد E12.5 ترنسفكأيشن، GFP التعبير على E18.5 قوية جدا. لقد electroporated في E12.5، E13.5، E14.5، وE15.5 وتحليلها في E17.5، E18.5، وP0 P1 التمكن من العثور على التعبير مراسل قوية في جميع الحالات. عندما يسمح الأجنة التي تم transfected في الرحم العقول للوصول إلى مصطلح (لجمع البيانات بعد الولادة)، وأحيانا تؤكل بشكل انتقائي من قبل الأم. وهذا يشير إلى التغييرات الطفيفة في المظهر أو السلوك الجرو الناجمة عن التلاعب الدماغ (درجة حرارة بهمتلح يمكن أن يكون أقل، أو ربما أنها لا تتسبب في انبعاث إشارات الصوت اليمين). في تلك الحيوانات بعد الولادة أن البقاء على قيد الحياة إعدام الأمهات، لاحظنا التعبير مراسل حتى P1 على الأقل. تقارير في الأدب المعرض التعبير عن بنيات transfected حتى بعد مرور أربعة أشهر الميلاد 10. ناقلات ل electroporation: نحن نستخدم bicistronic البلازميدات مراسل مدفوعا المروج CAG 39، تليها [كدنا] من الجينات في المصالح، مفصولة موقع الريبوسوم دخول الداخلي (IRES) 40، من [كدنا] من مراسل الفلورسنت، على سبيل المثال تعزيز بروتين الفلورية الخضراء 41. المروج CAG قوي جدا في الخلايا العصبية التي يمكن أن تنتج مستويات الحمض النووي عالية جدا لالخلايا transfected، قتلهم. على الرغم من أننا لاحظنا أبدا موت الخلايا المبرمج الضخمة بعد ترنسفكأيشن، حلا ممكنا، يجب أن تظهر المشكلة، سيكون استخدام المروج أقل كفاءة، مثل EF1 ألفا 42.

التلاعب الجيني للدماغ الفأر الجنينية هو النهج المفضل لمعرفة المزيد عن تنظيم التنموية. الجيل من خطوط الماوس متحولة ولكن هو بطيئة ومكلفة. واحد طريقة قوية لإدخال تغييرات جينية محددة في تطوير الخلايا العصبية للدماغ الثدييات هو electroporation في الرحم. أساسا، تتكون هذه التقنية من transfecting الحمض النووي في الظهارة العصبية الجنينية الدماغ عن طريق نبضات كهربائية، ثم السماح الجنين إلى البقاء على قيد الحياة لفترة معينة من الزمن، وجمع الدماغ ودراستها لرواية ممكن، الظواهر غنية بالمعلومات. في هذه الطريقة، يمكن للمجرب اختبار الفرضيات على الفور تقريبا دون فترات انتظار طويلة اللازمة لإنتاج المسوخ الماوس. التي ترنسفكأيشن من الحمض النووي في الأجنة النامية مع electroporation في البيضة على افراخ الدجاج 1. تم إجراء إثبات صحة مفهوم أساسي للماوس في الثقافة <sتصل&gt; 2. وسرعان ما أعقب ذلك الأوصاف الأولى من هذه التقنية علي الفار في الرحم 3،4. والمشكلة الرئيسية هي لبالنقل دماغ الأجنة النامية في الرحم دون قتلهم أو الأم. تعلم لإجراء الجراحة اللازمة (البطن، والحقن، electroporation) يتطلب فترة تدريب طويلة. بمجرد يتقن عملية جراحية لنقطة حيث نسبة البقاء على قيد الحياة الجنين غير مقبول، فإن السؤال الرئيسي التالي هو: ما هي هياكل الدماغ يمكن الوصول إليها؟ ليس من المستغرب، أول الأبحاث المنشورة تظهر النتائج التي تم الحصول عليها مع electroporation في الرحم تركز على التنمية القشرية 5-9. هذا لا يزال صحيحا بالنسبة لمعظم المنشورات باستخدام هذه التقنية، منذ المنطقة من الدماغ الماوس النامية الأكثر متناول العمليات الجراحية هي القشرة (الشكل 1). وقد وصفت الإجراء لelectroporation في الرحم في اللحاءفي الطباعة 10 و 11-14 في الفيديو. وهناك تعديل لهذه التقنية يمكن استخدامها لاستهداف جزء البطنية من الدماغ الانتهائي، والعقد القاعدية 15. ما وراء الدماغ الانتهائي، والدماغ البيني (مقسمة تقليديا إلى المهاد المهاد و) هي منطقة من الدماغ الأمامي من الصعب الوصول إليها. وهناك عدد قليل من التقارير أوراق استهداف جانبها الظهرية والتي يمكن الوصول إليها، المهاد 16-19. ما تحت المهاد هو الجزء الأكثر البطنية من الدماغ الأمامي، وبالتالي فإن واحدة المترجمة معظم عميق من السطح الظهري (اللحاء) (الشكل 1). لا تزال هذه المنطقة تحديا صعبا للباحثين ملتزمة التلاعب وراثيا مخ الفأر في الرحم. على حد علمنا، يقدم سوى عدد قليل جدا مقالات عن نتائج في ترنسفكأيشن الرحم في منطقة ما تحت المهاد الماوس 20،21. ومع ذلك، فإن أهمية وظيفية من منطقة ما تحت المهاد المدفعر يكون مبالغا فيه، لأنه ينظم السلوكيات مثل الأكل والشرب، والتزاوج والتربية والأبوة والأمومة 22. وعلاوة على ذلك، وتعديلات في التنمية طائي تسهم أن تنشأ لاحقا في ظروف الحياة مثل السمنة وارتفاع ضغط الدم والسكري والبلوغ المبكر 23. سوف تكون قادرة على تغيير وراثيا تحت المهاد خلال تنمية تقدم أداة قوية جدا لفهم ذلك. بروتوكول الجراحية الأساسية لفتح البطن من الفئران الحوامل التي نستخدمها هنا هي مماثلة لتلك المستخدمة في البروتوكولات الأخرى 11،13،14،24. سنقوم بشرح منهم هنا لفترة وجيزة للتأكد من اكتمالها. مفتاح الإجراء لدينا، من ناحية أخرى، هي نوع من التخدير، ومكان الحقن، نوع من الأقطاب الكهربائية والإدراج والموقف من القطب الموجب فيما يتعلق رأس الجنين. ونحن نفضل للحث والحفاظ على التخدير من خلال استنشاق الغاز على تخدير داخل الصفاق بسيطة، منذ السابق يسمح للفترات أطول نوعا من الخدر اللازمة لعملية جراحية صعبة. النتائج استنشاق isoflurane والانتعاش في أسرع من التخدير، منذ يوضح عادة الأم السلوك العادي بالفعل دقائق بعد الجراحة. أسهل نقطة الحقن من الحل DNA مع الزجاج micropipette هو البطين الجانبي، والتي مع ذلك غير مناسب تماما ل electroporation تحت المهاد. حقن مباشرة في البطين الثالث هو في الواقع حاسمة لاستهداف هياكل الدماغ البيني عميق. فمن الممكن لبالنقل منطقة ما تحت المهاد من E12.0 أو E12.5 مع معيار، أقطاب قبالة الجاهزة للاستخدام. لقد تم العثور على بعض من الأقطاب الكهربائية المصنعة من قبل نيبا جين (تشيبا، اليابان) مناسبة خاصة لهذا الغرض. مع إجراءاتنا نحصل على ترنسفكأيشن من الظهارة العصبية طائي كامل أو جزئي ترنسفكأيشن الإقليمية، اعتمادا على اتجاه القطب. نحن هنا لشرح هذه التقنية عليها بنقل الجسم الحلمي، يمكن القولأعمق وأكثر راحة من كل نواة تحت المهاد البصري. بالإضافة إلى ذلك، وتبين لنا التحليل النسيجي مفصل لالخلايا transfected وصولا الى المستوى الخلوي من القرار. مقارنة بين electroporation في الرحم مع المناهج الأخرى لtransfecting البلدان النامية مخ الفأر في الرحم يمكن العثور عليها في الجزء المتعلق بالمناقشة.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>REAGENTS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acepromazine</td>
			<td>Sanofi GmbH</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>anesthetic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Baxter</td>
			<td>HDG9623</td>
			<td>anesthetic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamin</td>
			<td>Pharma GmbH</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>anesthetic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast Green</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>44715</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rimadyl</td>
			<td>Pfizer</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>non-steroidal anti-inflammatory</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Braunoderm</td>
			<td>Braun</td>
			<td>3887138</td>
			<td>povidone-iodine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Saline PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temgesic (buprenorphine)</td>
			<td>Essex Pharma</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>opioid analgesic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eye Ointment</td>
			<td>Pan-Ophtal</td>
			<td>7136926</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td>Bayer</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>EQUIPMENT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anaesthetic Device Komesaroff Mark-5</td>
			<td>Medical Developments Australia</td>
			<td>ACN 004 903 682</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillary puller P-97</td>
			<td>Sutter Instrument Co.</td>
			<td>P-97</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compresstome</td>
			<td>Precisionary Instr.</td>
			<td>VF-300</td>
			<td>Vibratome-type device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>LSM700</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat</td>
			<td>Leica</td>
			<td>CM3050S</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporator</td>
			<td>Nepa Gene Co. Ltd.</td>
			<td>CUY21EDIT</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrode 1</td>
			<td>Nepa Gene Co. Ltd.</td>
			<td>CUY550-10</td>
			<td>Stainless Steel Needle Electrode, 10 mm-Tip, 0. 5 mm diam.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrode 2</td>
			<td>Nepa Gene Co. Ltd.</td>
			<td>CUY700P4L</td>
			<td>Cover Round Platinum Plate 4 mm diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiberoptic cold light source</td>
			<td>Leica</td>
			<td>KL2500 LCD</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass capillaries</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>GC120T-15</td>
			<td>1. 2 mm O.D. x 0. 94 mm I.D.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bead sterilizer</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>FST250</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating pad</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>py872-5272</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injection device</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>Pneumatic Pico Pump PV820</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suture Thread Coated Vicryl</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>V4914</td>
			<td>Peritoneal Suture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suture Thr. Supramid</td>
			<td>Serag Wiessner</td>
			<td>TO07171L</td>
			<td>Skin Suture</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

genetic manipulation of the mouse developing hypothalamus through in utero electroporation

التعديل الوراثي للمناطق معينة من أدمغة الثدييات النامية هو المنهج التجريبي قوية جدا. ومع ذلك، وتوليد المسوخ الماوس الرواية غالبا ما تكون بطيئة بشكل محبط. ولقد ثبت أن الوصول إلى مخ الفأر النامية في الرحم مع بقاء ما بعد الجراحة معقول هو ممكن. ومع ذلك، تم الإبلاغ عن النتائج مع هذا الإجراء على وجه الحصر تقريبا في معظمها سطحية ويمكن الوصول إليها بسهولة من الدماغ النامية، أي القشرة. وقد ثبت المهاد، وهي منطقة أضيق وأكثر وسطي، أكثر صعوبة لهدف. ترنسفكأيشن لتكوين نواة أكثر عمقا، خصوصا تلك من منطقة ما تحت المهاد، وربما تم الإبلاغ عن النتائج الأكثر تحديا، وبالتالي عدد قليل جدا. هنا علينا أن نبرهن إجراء لاستهداف الظهارة العصبية طائي بأكمله أو جزء منه (المناطق طائي) لترنسفكأيشن من خلال electroporation. مفاتيح لنهجنا الأوقات الخدر لفترة أطول، حقن في تيهيرد البطين، ونوع وتحديد المواقع من الأقطاب الكهربائية المناسبة. بالإضافة إلى ذلك، وتبين لنا نتائج الاستهداف والتحليل النسيجي لاحقة من نواة تحت المهاد البصري الأكثر راحة، والجسم الحلمي.

يولد معظم الخلايا العصبية تحت المهاد بين E11.5 إلى E15.2، وفقا لتحليل الميلاد التي يرجع تاريخها في الفئران 26 ترجمتها إلى تطوير الماوس أقصر إلى حد ما 27،28. يتم الوصول إلى الذروة من تكوين الخلايا العصبية طائي في E12.5 29-31. وفقا لذلك، في سن ترنسفكأيشن الذي تم اختياره لهذه الدراسة (E12.5)، يمكن أن توصف نسبة كبيرة من الخلايا العصبية طائي على أي مستوى rostro-الذيلية معين. تحليل في E18.5 على أبواب vibratome من نوع سميك (أرقام 3A و3B) يدل على أن تمديد rostro-الذيلية كامل من الظهارة العصبية طائي هي في متناول electroporation (الشكل 3A). في أي سن معينة، يمكن أن توصف الخلايا العصبية على جميع المستويات MEDIO-الجانبية (الشكل 3B)، في اتفاق مع دراسات النسب 32. الجسم الحلمي (MBO) هو نواة الخلايا العصبية النامية من الظهارة العصبية المبطنة عطلة في معظم ventraL وجزء الذيلية من الدماغ الأمامي. هذا يجعل MBO من حيث المبدأ من الصعب جدا أن هدف. وظيفيا، وMBO هو بنية أساسية لتوطيد الذاكرة ونتائجها المرضية انحطاط في فقدان الذاكرة تقدمي 33. تمكنا ل transfect البلازميدات مراسل تحديدا جدا في هذه النواة (أرقام 3C و 3D). الخلايا العصبية MBO تمديد محاور تشكيل اثنين مساحات هامة مميزة جدا وظيفيا والتي وصفت أيضا بعد ترنسفكأيشن (النصال في الشكل 3C). تظهر المقاطع العرضية أن الخلايا العصبية ولد في E12.5 (عمر ترنسفكأيشن) تشكيل &quot;طبقة&quot; منحني حول كتلة غير المسمى من الخلايا العصبية ولدت في وقت سابق (أي قبل تولي التجربة ترنسفكأيشن مكان) (الشكل 3D). ما وراء أنماط الهجرة العام الذي أبدته الفحص على أبواب سميكة مع مساعدة من البروتينات مراسل فلوري، تحليلا أقرب للنتائج غير POSS<html> إيبل باستخدام أجسام مضادة معينة على المقاطع ناظم البرد (الشكل 4). لتحليل مثال اختاره هنا، MBO، ونحن على استعداد أقسام أفقية موازية لطائرة من العمليات الدبقية شعاعي المنبثقة من العطلة الحلمي (الشكل 4A). نحن ثم حدد الخلايا العصبية MBO لدت من الظهارة العصبية المسمى على E12.5 عن طريق الأجسام المضادة ضد GFP (الشكل 4B). كما هو متوقع، وصفت الضد مجموعة محدودة من الخلايا MBO (رأس السهم في أرقام 4B، 4C، 4D و). وتقع هذه المجموعة بين اثنين غير المسماة المناطق MBO الوحشي والإنسي المقابلة على التوالي إلى الخلايا العصبية MBO ولدوا قبل (الوحشي) وبعد (وسطي) E12.5. وكمثال على ذلك، ونحن هنا المشارك ملطخة الأجسام المضادة ضد nestin (أحمر في أرقام 4C و 4D) من أجل إظهار وضع الهجرة من الخلايا العصبية المسماة بشكل فردي على عمليات الدبقية شعاعي من الظهارة العصبية. المحافظة على together.within الصفحات = &quot;دائما&quot;&gt; <img alt="الشكل 1" fo:content-width="4.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50412/50412fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50412/50412fig1.jpg" /> الشكل 1. الأوضاع النسبية للالمهاد واللحاء في midgestation. سهمي (A) والعرضي (B) الرسوم البيانية من الدماغ من جنين فأر midgestation يبين الهيكل الدماغ الأمامي الظهري الأكثر والأكثر سطحية، والقشرة (CTX، أزرق) وكذلك معظم عميق بنية الدماغ الأمامي وضعت، ما تحت المهاد (HY، أحمر). <img alt="الشكل 2" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50412/50412fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50412/50412fig2.jpg" /> الشكل 2. الرسم التخطيطي لهذا الإجراء. (أ) سد الحوامل هو تخدير والرحم عرضة للخطر. (B) وفي كل تورم الرحم تحديد الإدراج المشيمة (أسود رأس السهم)،المشيمة (PL) والجنين. ME، مسراق الرحم. (ج) تحديد نقطة الحقن في منتصف الكرة الأرضية القشرية اليسار واليمين (أحمر X). (D) حقن محلول الحمض النووي في البطين الثالث. (E) القطب إبرة (إيجابية) يخترق جدار الرحم بين الجنين والمشيمة الإدراج. القطب شقة (سلبي) تقع على الجانب خالية من الرحم. (F) عرض افتراضية من الجانب المشيمة تبين موقف القطب الموجب على طول منطقة ما تحت المهاد. (G) عرض من الجانب خالية من الرحم التي تبين موقف القطب السالب. <img alt="الشكل (3)" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50412/50412fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50412/50412fig3.jpg" /> الشكل (3). Transfecting منطقة ما تحت المهاد بأكمله أو جزء منه. سميكة أقسام تهتز-مشراح من أربعة أنواع مختلفة مننوع البرية E18.5 أدمغة فئران تظهر ما تحت المهاد بعد في الرحم ترنسفكأيشن من الحمض النووي البلازميد تحمل مراسل الفلورسنت الجينات GFP (A، C) أو CFP (B، D) في E12.5. (A) مقطع سهمي (منقاري إلى اليسار) يظهر تحت المهاد transfected من منقاري إلى الذيلية. شريط مقياس 500 ميكرون. (B) المقطع العرضي. على الجانب transfected، الخلايا المسمى ويمكن الاطلاع على جميع المستويات MEDIO الاطراف. (C) مقطع سهمي يظهر الجسم الحلمي transfected على وجه التحديد (خط متقطع، النجمة) ووسم لها محور عصبي شجرة مميزة (السهام). (D) المقطع العرضي من خلال الجسم الحلمي (خط متقطع). على الجانب electroporated (النجمة)، والفرقة المسماة الموافق الخلايا العصبية ولدت في E12.5 يمكن أن يرى. HY، تحت المهاد؛ TH، المهاد <img alt="الشكل 4" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50412/50412fig4highres.jpg" srج = &quot;/ files/ftp_upload/50412/50412fig4.jpg&quot; /&gt; الشكل 4. تحليل خطوات محددة في التنمية طائي. (A) رسم تخطيطي لمقطع أفقي من خلال الدماغ النامية تظهر فيه جثة الحلمي (الحمراء). المنطقة هو مبين في (B) و (C) هو مؤطر. (B) وضع العلامات الضد من GFP على القسم الأفقي من خلال الجسم الحلمي E18.5 بعد ترنسفكأيشن GFP في E12. خلايا ولد في E12.5 تشكيل الفرقة متميزة في النواة (رأس السهم في B، C و D). شريط مقياس 100 ميكرون. (C) وضع العلامات الضد من عصبية ظهارية nestin علامة (الحمراء) فى القسم هو مبين في (B). شريط مقياس 100 ميكرون. (D) ويمكن تحديد الخلايا الفردية في E12.5 الفرقة محددة في الجسم الحلمي تحت التكبير عالية. شريط مقياس 20 ميكرون.

Watch this Scientific Journal Video about Genetic Manipulation of the Mouse Developing Hypothalamus through In utero Electroporation at JoVE.com

Genetic Manipulation of the Mouse Developing Hypothalamus through In utero Electroporation

وعلى الرغم من أهمية وظيفية والطبية من منطقة ما تحت المهاد،<em&gt; في الرحم</emوقد حاول نادرا&gt; التلاعب الجيني من تطورها. نعرض إجراء مفصل ل<em&gt; في الرحم</em&gt; electroporation في منطقة ما تحت المهاد الماوس وتظهر نتائج ممثلة من الكل والجزئي ترنسفكأيشن طائي (الإقليمية).

التلاعب الجيني من الفأرة النامية من خلال المهاد<em&gt; في الرحم</em&gt; Electroporation

Genetic  modification of specific regions of the developing mammalian brain is a very  powerful experimental approach. However, generating novel mouse ...

genetic-manipulation-mouse-developing-hypothalamus-through-utero

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Genetic Manipulation of the Mouse Developing Hypothalamus through In utero Electroporation

15.8K Views.  University of Heidelberg. وعلى الرغم من أهمية وظيفية والطبية من منطقة ما تحت المهاد، في الرحم التلاعب الجيني من تطورها. نعرض إجراء مفصل ل في الرحم electroporation في منطقة ما تحت المهاد الماوس وتظهر نتائج ممثلة من الكل والجزئي ترنسفكأيشن طائي (الإقليمية).

Video: Genetic Manipulation of the Mouse Developing Hypothalamus through In utero Electroporation

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural connectivity form during development. In mice, retinofugal projections are arranged in a topographic manner and form eye-specific layers in the Lateral Geniculate Nucleus (dLGN) of the thalamus and the Superior Colliculus (SC). The development of these precise patterns of retinofugal projections has typically been studied by labeling populations of RGCs with fluorescent dyes and tracers, such as horseradish peroxidase1-4. However, these methods are too coarse to provide insight into developmental changes in individual RGC axonal arbor morphology that are the basis of retinotopic map formation. They also do not allow for the genetic manipulation of RGCs.
Recently, electroporation has become an effective method for providing precise spatial and temporal control for delivery of charged molecules into the retina5-11. Current retinal electroporation protocols do not allow for genetic manipulation and tracing of retinofugal projections of a single or small cluster of RGCs in postnatal mice. It has been argued that postnatal in vivo electroporation is not a viable method for transfecting RGCs since the labeling efficiency is extremely low and hence requires targeting at embryonic ages when RGC progenitors are undergoing differentiation and proliferation6. 
In this video we describe an in vivo electroporation protocol for targeted delivery of genes, shRNA, and fluorescent dextrans to murine RGCs postnatally. This technique provides a cost effective, fast and relatively easy platform for efficient screening of candidate genes involved in several aspects of neural development including axon retraction, branching, lamination, regeneration and synapse formation at various stages of circuit development. In summary we describe here a valuable tool which will provide further insights into the molecular mechanisms underlying sensory map development.

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

We demonstrate an in vivo electroporation protocol for transfecting single or small clusters of retinal ganglion cells (RGCs) and other retinal cell types in postnatal mice over a wide range of ages. The ability to label and genetically manipulate postnatal RGCs in vivo is a powerful tool for developmental studies.

ترنسفكأيشن من خلايا الشبكية بواسطة الماوس العقدة في الجسم الحي Electroporation

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural ...

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge. Gene targeting to generate constitutive or conditional loss of function knockouts remains cost and labor intensive, as well as time consuming. Adding to these challenges, retina expressed genes may have essential roles outside the retina leading to unintended confounds when using a knockout approach. Furthermore, the ability to ectopically express a gene in a gain of function experiment can be extremely valuable when attempting to identify a role in cell fate specification and/or terminal differentiation.
We present a method for the rapid and efficient incorporation of DNA plasmids into the neonatal mouse retina by electroporation. The application of short electrical impulses above a certain field strength results in a transient increase in plasma membrane permeability, facilitating the transfer of material across the membrane 1,2,3,4. Groundbreaking work demonstrated that electroporation could be utilized as a method of gene transfer into mammalian cells by inducing the formation of hydrophilic plasma membrane pores allowing the passage of highly charged DNA through the lipid bilayer 5. Continuous technical development has resulted in the viability of electroporation as a method for in vivo gene transfer in multiple mouse tissues including the retina, the method for which is described herein 6, 7, 8, 9, 10. 
DNA solution is injected into the subretinal space so that DNA is placed between the retinal pigmented epithelium and retina of the neonatal (P0) mouse and electrical pulses are applied using a tweezer electrode. The lateral placement of the eyes in the mouse allows for the easy orientation of the tweezer electrode to the necessary negative pole-DNA-retina-positive pole alignment. Extensive incorporation and expression of transferred genes can be identified by postnatal day 2 (P2). Due to the lack of significant lateral migration of cells in the retina, electroporated and non-electroporated regions are generated. Non-electroporated regions may serve as internal histological controls where appropriate. 
Retinal electroporation can be used to express a gene under a ubiquitous promoter, such as CAG, or to disrupt gene function using shRNA constructs or Cre-recombinase. More targeted expression can be achieved by designing constructs with cell specific gene promoters. Visualization of electroporated cells is achieved using bicistronic constructs expressing GFP or by co-electroporating a GFP expression construct. Furthermore, multiple constructs may be electroporated for the study of combinatorial gene effects or simultaneous gain and loss of function of different genes. Retinal electroporation may also be utilized for the analysis of genomic cis-regulatory elements by generating appropriate expression constructs and deletion mutants. Such experiments can be used to identify cis-regulatory regions sufficient or required for cell specific gene expression 11. Potential experiments are limited only by construct availability.

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

A method for the incorporation of plasmid DNA into murine retinal cells for the purpose of performing either gain- or loss of function studies in vivo is presented. This method capitalizes on the transient increase in permeability of cell plasma membranes induced by the application of an external electrical field.

Electroporation في الجسم الحي من الشبكية ماوس النامية

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge.  Gene targeting to generate ...

Efficient Gene Delivery into Multiple CNS Territories Using In Utero Electroporation

The ability to manipulate gene expression is the cornerstone of modern day experimental embryology, leading to the elucidation of multiple developmental pathways. Several powerful and well established transgenic technologies are available to manipulate gene expression levels in mouse, allowing for the generation of both loss- and gain-of-function models. However, the generation of mouse transgenics is both costly and time consuming. Alternative methods of gene manipulation have therefore been widely sought. In utero electroporation is a method of gene delivery into live mouse embryos1,2 that we have successfully adapted3,4. It is largely based on the success of in ovo electroporation technologies that are commonly used in chick5. Briefly, DNA is injected into the open ventricles of the developing brain and the application of an electrical current causes the formation of transient pores in cell membranes, allowing for the uptake of DNA into the cell. In our hands, embryos can be efficiently electroporated as early as embryonic day (E) 11.5, while the targeting of younger embryos would require an ultrasound-guided microinjection protocol, as previously described6. Conversely, E15.5 is the latest stage we can easily electroporate, due to the onset of parietal and frontal bone differentiation, which hampers microinjection into the brain. In contrast, the retina is accessible through the end of embryogenesis. Embryos can be collected at any time point throughout the embryonic or early postnatal period. Injection of a reporter construct facilitates the identification of transfected cells.
To date, in utero electroporation has been most widely used for the analysis of neocortical development1,2,3,4. More recent studies have targeted the embryonic retina7,8,9 and thalamus10,11,12. Here, we present a modified in utero electroporation protocol that can be easily adapted to target different domains of the embryonic CNS. We provide evidence that by using this technique, we can target the embryonic telencephalon, diencephalon and retina. Representative results are presented, first showing the use of this technique to introduce DNA expression constructs into the lateral ventricles, allowing us to monitor progenitor maturation, differentiation and migration in the embryonic telencephalon. We also show that this technique can be used to target DNA to the diencephalic territories surrounding the 3rd ventricle, allowing the migratory routes of differentiating neurons into diencephalic nuclei to be monitored. Finally, we show that the use of micromanipulators allows us to accurately introduce DNA constructs into small target areas, including the subretinal space, allowing us to analyse the effects of manipulating gene expression on retinal development.

Efficient Gene Delivery into Multiple CNS Territories Using In Utero Electroporation

In utero electroporation allows for rapid gene delivery in a spatially- and temporally-controlled manner in the developing central nervous system (CNS). Here we describe a highly adaptable in utero electroporation protocol that can be used to deliver expression constructs into multiple embryonic CNS domains, including the telencephalon, diencephalon and retina.

كفاءة توصيل الجينات في الجهاز العصبي المركزي متعددة باستخدام الأراضي في الرحم Electroporation

The ability to manipulate gene expression is the cornerstone of modern day experimental embryology, leading to the elucidation of multiple developmental ...

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

In order to understand the function of genes expressed in specific region of the developing brain, including signaling molecules and axon guidance molecules, local gene transfer or knock- out is required. Gene targeting knock-in or knock-out into local regions is possible to perform with combination with a specific CRE line, which is laborious, costly, and time consuming. Therefore, a simple transfection method, an in utero electroporation technique, which can be performed with short time, will be handy to test the possible function of candidate genes prior to the generation of transgenic animals 1,2. In addition to this, in utero electroporation targets areas of the brain where no specific CRE line exists, and will limit embryonic lethality 3,4. Here, we present a method of in utero electroporation combining two different types of electrodes for simple and convenient gene transfer into target areas of the developing brain. First, a unique holding method of embryos using an optic fiber optic light cable will make small embryos (from E9.5) visible for targeted DNA solution injection into ventricles and needle type electrodes insertion to the targeted brain area 5,6. The patterning of the brain such as cortical area occur at early embryonic stage, therefore, these early electroporation from E9.5 make a big contribution to understand entire area patterning event. Second, the precise shape of a capillary prevents uterine damage by making holes by insertion of the capillary. Furthermore, the precise shape of the needle electrodes are created with tungsten and platinum wire and sharpened using sand paper and insulated with nail polish 7, a method which is described in great detail in this protocol. This unique technique allows transfection of plasmid DNA into restricted areas of the brain and will enable small embryos to be electroporated. This will help to, open a new window for many scientists who are working on cell differentiation, cell migration, axon guidance in very early embryonic stage. Moreover, this technique will allow scientists to transfect plasmid DNA into deep parts of the developing brain such as thalamus and hypothalamus, where not many region-specific CRE lines exist for gain of function (GOF) or loss of function (LOF) analyses.

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

A gene transfer method into the developing mouse brain is described by using a unique surgical method and special shape of electrodes. This unique technique allows transfection of plasmid DNA temporally and spatially, which will aid many neuroscientists in studying brain development.

فأر في الرحم Electroporation : الشواهد ترنسفكأيشن جين Spatiotemporal

In order to understand the function of genes expressed in specific region of the developing brain, including signaling molecules and axon guidance ...

Gene Transfer to the Developing Mouse Inner Ear by In Vivo Electroporation

The mammalian inner ear has 6 distinct sensory epithelia: 3 cristae in the ampullae of the semicircular canals; maculae in the utricle and saccule; and the organ of Corti in the coiled cochlea. The cristae and maculae contain vestibular hair cells that transduce mechanical stimuli to subserve the special sense of balance, while auditory hair cells in the organ of Corti are the primary transducers for hearing 1. Cell fate specification in these sensory epithelia and morphogenesis of the semicircular canals and cochlea take place during the second week of gestation in the mouse and are largely completed before birth 2,3. Developmental studies of the mouse inner ear are routinely conducted by harvesting transgenic embryos at different embryonic or postnatal stages to gain insight into the molecular basis of cellular and/or morphological phenotypes 4,5. We hypothesize that gene transfer to the developing mouse inner ear in utero in the context of gain- and loss-of-function studies represents a complimentary approach to traditional mouse transgenesis for the interrogation of the genetic mechanisms underlying mammalian inner ear development6.
The experimental paradigm to conduct gene misexpression studies in the developing mouse inner ear demonstrated here resolves into three general steps: 1) ventral laparotomy; 2) transuterine microinjection; and 3) in vivo electroporation. Ventral laparotomy is a mouse survival surgical technique that permits externalization of the uterus to gain experimental access to the implanted embryos7. Transuterine microinjection is the use of beveled, glass capillary micropipettes to introduce expression plasmid into the lumen of the otic vesicle or otocyst. In vivo electroporation is the application of square wave, direct current pulses to drive expression plasmid into progenitor cells8-10. 
We previously described this electroporation-based gene transfer technique and included detailed notes on each step of the protocol11. Mouse experimental embryological techniques can be difficult to learn from prose and still images alone. In the present work, we demonstrate the 3 steps in the gene transfer procedure. Most critically, we deploy digital video microscopy to show precisely how to: 1) identify embryo orientation in utero; 2) reorient embryos for targeting injections to the otocyst; 3) microinject DNA mixed with tracer dye solution into the otocyst at embryonic days 11.5 and 12.5; 4) electroporate the injected otocyst; and 5) label electroporated embryos for postnatal selection at birth. We provide representative examples of successfully transfected inner ears; a pictorial guide to the most common causes of otocyst mistargeting; discuss how to avoid common methodological errors; and present guidelines for writing an in utero gene transfer animal care protocol.

Gene Transfer to the Developing Mouse Inner Ear by In Vivo Electroporation

The mouse inner ear is a placode-derived sensory organ whose developmental program is elaborated during gestation. We define an in utero gene transfer technique consisting of three steps: mouse ventral laparotomy, transuterine microinjection, and in vivo electroporation. We use digital video microscopy to demonstrate the critical experimental embryological techniques.

نقل الجينات إلى الأذن الداخلية عن طريق تطوير ماوس<em&gt; في الجسم الحي</em&gt; Electroporation

The mammalian inner ear has 6 distinct sensory epithelia: 3 cristae in the ampullae of the semicircular canals; maculae in the utricle and saccule; and ...

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date this tool has been widely used to study the regulation of cellular proliferation, differentiation and neuronal migration especially in the developing cerebral cortex 6-8. Here we detail our protocol to electroporate in utero the cerebral cortex and the hippocampus and provide evidence that this approach can be used to study dendrites and spines in these two cerebral regions.
Visualization and manipulation of neurons in primary cultures have contributed to a better understanding of the processes involved in dendrite, spine and synapse development. However neurons growing in vitro are not exposed to all the physiological cues that can affect dendrite and/or spine formation and maintenance during normal development. Our knowledge of dendrite and spine structures in vivo in wild-type or mutant mice comes mostly from observations using the Golgi-Cox method 9. However, Golgi staining is considered to be unpredictable. Indeed, groups of nerve cells and fiber tracts are labeled randomly, with particular areas often appearing completely stained while adjacent areas are devoid of staining. Recent studies have shown that IUE of fluorescent constructs represents an attractive alternative method to study dendrites, spines as well as synapses in mutant / wild-type mice 10-11 (Figure 1A). Moreover in comparison to the generation of mouse knockouts, IUE represents a rapid approach to perform gain and loss of function studies in specific population of cells during a specific time window. In addition, IUE has been successfully used with inducible gene expression or inducible RNAi approaches to refine the temporal control over the expression of a gene or shRNA 12. These advantages of IUE have thus opened new dimensions to study the effect of gene expression/suppression on dendrites and spines not only in specific cerebral structures (Figure 1B) but also at a specific time point of development (Figure 1C).
Finally, IUE provides a useful tool to identify functional interactions between genes involved in dendrite, spine and/or synapse development. Indeed, in contrast to other gene transfer methods such as virus, it is straightforward to combine multiple RNAi or transgenes in the same population of cells. 
In summary, IUE is a powerful method that has already contributed to the characterization of molecular mechanisms underlying brain function and disease and it should also be useful in the study of dendrites and spines.

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

This article describes in detail a protocol to electroporate in utero the cerebral cortex and the hippocampus at E14.5 in mice. We also show that this is a valuable method to study dendrites and spines in these two cerebral regions.

التصور والتلاعب الجيني من التشعبات والاعمده الفقريه في قشرة الدماغ والحصين ماوس باستخدام<em&gt; في الرحم</em&gt; Electroporation

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date ...

Generation of Topically Transgenic Rats by In utero Electroporation and In vivo Bioluminescence Screening

In utero electroporation (IUE) is a technique which allows genetic modification of cells in the brain for investigating neuronal development. So far, the use of IUE for investigating behavior or neuropathology in the adult brain has been limited by insufficient methods for monitoring of IUE transfection success by non-invasive techniques in postnatal animals. 
 For the present study, E16 rats were used for IUE. After intraventricular injection of the nucleic acids into the embryos, positioning of the tweezer electrodes was critical for targeting either the developing cortex or the hippocampus. 
 Ventricular co-injection and electroporation of a luciferase gene allowed monitoring of the transfected cells postnatally after intraperitoneal luciferin injection in the anesthetized live P7 pup by in vivo bioluminescence, using an IVIS Spectrum device with 3D quantification software. 
 Area definition by bioluminescence could clearly differentiate between cortical and hippocampal electroporations and detect a signal longitudinally over time up to 5 weeks after birth. This imaging technique allowed us to select pups with a sufficient number of transfected cells assumed necessary for triggering biological effects and, subsequently, to perform behavioral investigations at 3 month of age. As an example, this study demonstrates that IUE with the human full length DISC1 gene into the rat cortex led to amphetamine hypersensitivity. Co-transfected GFP could be detected in neurons by post mortem fluorescence microscopy in cryosections indicating gene expression present at &ge;6 months after birth.
 We conclude that postnatal bioluminescence imaging allows evaluating the success of transient transfections with IUE in rats. Investigations on the influence of topical gene manipulations during neurodevelopment on the adult brain and its connectivity are greatly facilitated. For many scientific questions, this technique can supplement or even replace the use of transgenic rats and provide a novel technology for behavioral neuroscience.

Generation of Topically Transgenic Rats by In utero Electroporation and In vivo Bioluminescence Screening

Genes can be manipulated during development of the cortex or the hippocampus of the rat via in utero electroporation (IUE) at E16, to enable fast and targeted modifications in neuronal connectivity for later studies of behavior or neuropathology in adult animals. Postnatal in vivo imaging for control of IUE success is performed by bioluminescence of activating co-transfected luciferase.

جيل من الفئران المعدلة وراثيا من قبل موضعيا<em&gt; في الرحم</em&gt; التثقيب الكهربائي و<em&gt; في الجسم الحي</em&gt; ضوء بارد الفرز

 In utero electroporation (IUE) is a technique which allows genetic modification of cells in the brain for investigating neuronal development. So far, the ...

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow for an in-depth characterization to identify pathways involved in these events. Cerebellar granule neurons (CGNs) that are derived from the developing cerebellum are an ideal model system that allows for morphological analyses. Here, we describe a method of how to genetically manipulate CGNs and how to study axono- and dendritogenesis of individual neurons. With this method the effects of RNA interference, overexpression or small molecules can be compared to control neurons. In addition, the rodent cerebellar cortex is an easily accessible in vivo system owing to its predominant postnatal development. We also present an in vivo electroporation technique to genetically manipulate the developing cerebella and describe subsequent cerebellar analyses to assess neuronal morphology and migration.

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Neuronal morphogenesis and migration are crucial events underlying proper brain development. Here, we describe methods to genetically manipulate cultured cerebellar granule neurons and the developing cerebellum for the assessment of morphology and migratory characteristics of neurons.

التلاعب الجيني للمخيخي الحبيبة الخلايا العصبية<em&gt; في المختبر</em&gt; و<em&gt; في فيفو</em&gt; لدراسة مورفولوجيا الخلايا العصبية والهجرة

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

Live Imaging of Mitosis in the Developing Mouse Embryonic Cortex

Although of short duration, mitosis is a complex and dynamic multi-step process fundamental for development of organs including the brain. In the developing cerebral cortex, abnormal mitosis of neural progenitors can cause defects in brain size and function. Hence, there is a critical need for tools to understand the mechanisms of neural progenitor mitosis. Cortical development in rodents is an outstanding model for studying this process. Neural progenitor mitosis is commonly examined in fixed brain sections. This protocol will describe in detail an approach for live imaging of mitosis in ex vivo embryonic brain slices. We will describe the critical steps for this procedure, which include: brain extraction, brain embedding, vibratome sectioning of brain slices, staining and culturing of slices, and time-lapse imaging. We will then demonstrate and describe in detail how to perform post-acquisition analysis of mitosis. We include representative results from this assay using the vital dye Syto11, transgenic mice (histone H2B-EGFP and centrin-EGFP), and in utero electroporation (mCherry-&#945;-tubulin). We will discuss how this procedure can be best optimized and how it can be modified for study of genetic regulation of mitosis. Live imaging of mitosis in brain slices is a flexible approach to assess the impact of age, anatomy, and genetic perturbation in a controlled environment, and to generate a large amount of data with high temporal and spatial resolution. Hence this protocol will complement existing tools for analysis of neural progenitor mitosis.

Neural progenitor mitosis is a critical parameter of neurogenesis. Much of our understanding of neural progenitor mitosis is based on analysis of fixed tissue. Live imaging in embryonic brain slices is a versatile technique to assess mitosis with high temporal and spatial resolution in a controlled environment.

التصوير حية من الانقسام في تطوير الجنينية الماوس اللحاء

Although of short duration, mitosis is a complex and dynamic multi-step process fundamental for development of organs including the brain. In the ...

Cortex-, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus-, Lateral Septal Nucleus- and Striatum-specific In Utero Electroporation in the C57BL/6 Mouse

In utero electroporation is a widely used technique for fast and efficient spatiotemporal manipulation of various genes in the rodent central nervous system. Overexpression of desired genes is just as possible as shRNA mediated loss-of-function studies. Therefore it offers a wide range of applications. The feasibility to target particular cells in a distinct area further increases the range of potential applications of this very useful method. For efficiently targeting specific regions knowledge about the subtleties, such as the embryonic stage, the voltage to apply and most importantly the position of the electrodes, is indispensable.
Here, we provide a detailed protocol that allows for specific and efficient in utero electroporation of several regions of the C57BL/6 mouse central nervous system. In particular it is shown how to transfect regions the develop into the retrosplenial cortex, the motor cortex, the somatosensory cortex, the piriform cortex, the cornu ammonis 1-3, the dentate gyrus, the striatum, the lateral septal nucleus, the thalamus and the hypothalamus. For this information about the appropriate embryonic stage, the appropriate voltage for the corresponding embryonic stage is provided. Most importantly an angle-map, which indicates the appropriate position of the positive pole, is depicted. This standardized protocol helps to facilitate efficient in utero electroporation, which might also lead to a reduced number of animals.

Cortex-, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus-, Lateral Septal Nucleus- and Striatum-specific In Utero Electroporation in the C57BL/6 Mouse

This protocol describes in detail how to specifically transfect different regions in the C57BL/6 central nervous system via in utero electroporation. Included in this protocol are detailed instructions for transfections of regions that develop into the cortex, hippocampus, thalamus, hypothalamus, lateral septal nucleus and striatum.

Cortex-، Hippocampus-، Thalamus-، Hypothalamus-، الجانبي الحاجزي Nucleus- والمخطط محددة<em&gt; في الرحم</em&gt; Electroporation للفي C57BL / 6 الماوس

In utero electroporation is a widely used technique for fast and efficient spatiotemporal manipulation of various genes in the rodent central nervous ...

التلاعب الجيني من الفأرة النامية من خلال المهاد

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

ترنسفكأيشن من خلايا الشبكية بواسطة الماوس العقدة في الجسم الحي Electroporation

Electroporation في الجسم الحي من الشبكية ماوس النامية

كفاءة توصيل الجينات في الجهاز العصبي المركزي متعددة باستخدام الأراضي في الرحم Electroporation

فأر في الرحم Electroporation : الشواهد ترنسفكأيشن جين Spatiotemporal

نقل الجينات إلى الأذن الداخلية عن طريق تطوير ماوس

التصور والتلاعب الجيني من التشعبات والاعمده الفقريه في قشرة الدماغ والحصين ماوس باستخدام

جيل من الفئران المعدلة وراثيا من قبل موضعيا

التلاعب الجيني للمخيخي الحبيبة الخلايا العصبية

التصوير حية من الانقسام في تطوير الجنينية الماوس اللحاء

Cortex-، Hippocampus-، Thalamus-، Hypothalamus-، الجانبي الحاجزي Nucleus- والمخطط محددة