وأيد هذا العمل من المنح المقدمة من مؤسسة إيف لا Cotrel DE L&#39;معهد فرنسا، باريس، فرنسا (للدكتور مورو)، والمعاهد الكندية لأبحاث الصحة (منح PP2-99466 للدكتور مورو) والرابعة من العمود الفقري البعد LLC ، نيويورك، الولايات المتحدة الأمريكية (منحة أبحاث للدكتور مورو).

يتم تنفيذ الإجراء بأكمله من تحت غطاء محرك السيارة البيولوجية العقيمة وجميع الحلول والمعدات ملامسة الخلايا يجب أن تكون معقمة. 1. إعداد حلول الأساسية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الحلول وفقا للجدول 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحفاظ على محلول ملحي متوازن (BSS) في درجة حرارة الغرفة وجميع الحلول الأخرى في 4 درجات مئوية حتى وقت الاستخدام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وسائل الاعلام الباردة الحارة إلى 37 درجة مئوية في حمام مائي لبضع دقائق قبل استخدام. </li></ol> 2. إعداد وتخزين PBMCs <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع 10 مل من الدم الكامل في أنابيب جمع المعالجة EDTA لإعداد اثنين مأخوذة من PBMCs باستخدام 5 مل لكل قسامة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل 5 مل من الدم الكامل من أنبوب جمع المعالجة EDTA إلى أنبوب 50 مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة حجم مساو من BSS وخلط عينة من قبل pipetting طيف صعودا وهبوطا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع 3 مل من Ficoll في اثنين من 15 مل أنابيب فالكون. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> طبقة بعناية 4.5 ملمن المخفف خليط الدم خلال Ficoll في كل أنبوب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> السماح للأنابيب راحة لمدة تصل إلى 5 دقائق لصالح فصل واضح من الدم وFicoll. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أنابيب الطرد المركزي في 400 x ج لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة مع عدم وجود الفرامل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة بعناية الأنابيب من جهاز الطرد المركزي وذلك لعدم تعكير صفو طبقات. وPBMCs مرئية في واجهة BSS / Ficoll. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حصاد طبقة غائم من PBMCs في واجهة كل من أنابيب مع ماصة ونقل إلى أنبوب جديد 50 مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 20 مل من وسائل الإعلام كاملة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي في أنبوب 288 x ج لمدة 7 دقائق في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة طاف بواسطة الطموح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> resuspend الكرية خلية في 500 ميكرولتر من وسائل الإعلام التكميلية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة حجم مساو من وسائل الإعلام التجميد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل تعليق خلية إلى cryovial. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع cryovial في وعاء cryofreezing مع الأيزوبروبانول. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخزين الحاوية تجميد في -80 درجة مئوية خلال الليل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> آرansfer في PBMCs المجمدة قسامة إلى النيتروجين السائل لتخزين على المدى الطويل. </li></ol> 3. الفحص وظيفية 1. يوم 1 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع قسامة من النيتروجين السائل في حمام الماء عند 37 درجة مئوية لمدة دقيقة أو حتى مطلق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل تعليق الخلية إلى أنبوب 50 مل مع ماصة معقمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 15 مل من وسائل الإعلام كاملة وتدور أسفل الخلايا في 200 x ج لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة طاف بواسطة الطموح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعليق بلطف بيليه خلية في 1 مل من PHA سائل الإعلام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استكمال وحدة التخزين إلى 20 مل مع وسائل الإعلام نفسها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غطاء الأنبوب فضفاضة للسماح للهواء بالدخول. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ترك الأنبوب بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية في حاضنة CO 2 للسماح الخلايا الليمفاوية هادئة للتحول إلى الابيضاض اللمفاوي تنتشر بسرعة. </li></ol> 2. يوم 2 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اتخاذ أنبوب للخروج من الحاضنة، المسمار قبعات تماما وتدور أسفل الخلايا في 200 x ج لمدة 5 دقائقفي درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة طاف بواسطة الطموح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعليق بلطف بيليه خلية في 1 مل من وسائل الإعلام كاملة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استكمال وحدة التخزين إلى 20 مل مع وسائل الإعلام نفسها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غطاء الأنبوب فضفاضة للسماح للهواء بالدخول. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ترك الأنبوب بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية في حاضنة CO 2 لتوسيع أعداد الخلايا. </li></ol> 3. يوم 3 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحصول على أنبوب للخروج من الحاضنة، المسمار قبعات تماما وتدور أسفل الخلايا في 200 x ج لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة طاف بواسطة الطموح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الخلايا مرتين مع 10 مل من RPMI-1640 بواسطة الطرد المركزي في 200 x ج لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> resuspend بلطف بيليه خلية في 600 ميكرولتر من RPMI-1640. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قياس تركيز الخلية وقدرتها على البقاء، وذلك باستخدام عداد الخلايا الآلي وقابلية محلل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة حجم مناسب من RPMI-1640 للتكيف مع تركيز خلية من 1.5 × 10 5 cells/20 ميكرولتر. </lط&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> علاج الخلايا مع المؤتلف OPN (rOPN) أو مركبة (PBS) في 1.5 مل من أنابيب إيبندورف. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل 100 ميكرولتر من تعليق خلية إلى اثنين العقيمة 1.5 مل أنابيب إيبندورف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة rOPN في أنبوب واحد لتركيز النهائي من 0.5 ميكروغرام / مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة حجم مساو من برنامج تلفزيوني في أنبوب الثانية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مزيج بلطف كل شرط من قبل pipetting صعودا وهبوطا مرتين باستخدام مجموعة ماصة معقمة في 100 ميكرولتر. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحضير عينة صغيرة 96 صفيحة ميكروسكوبية جيدا. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 5 ميكرولتر من RPMI-1640 إلى كل بئر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي لوحة في 200 x ج لمدة 3 دقائق لإزالة أي فقاعات الهواء. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> البذور الخلايا غير المعالجة وكذلك الخلايا تعامل مع rOPN أو برنامج تلفزيوني. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل نقل الخلايا من أنبوب إلى صفيحة ميكروسكوبية، ماصة بلطف صعودا وهبوطا مرة واحدة لضمان تعليق موحدة من الخلايا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 40 ميكرولتر من تعليق خلية لكل بئر في quadruplicate عن الخلايا غير المعالجة، في نسختين لrOPN أو برنامج تلفزيوني تعامل الخلايا. إعادةفر إلى الشكل 1 لتصميم. هذا التصميم يسمح 12 مريضا لفحصها على نفس صفيحة ميكروسكوبية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ترك لوحة الخلايا تحت غطاء محرك السيارة عقيمة لمدة 5 دقائق للسماح للخلايا للراحة وتسوية بالتساوي على قاع البئر قبل وضع في الحاضنة. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان لوحة لمدة 18 ساعة عند 37 درجة مئوية في حاضنة CO 2 لتحسين تأثير OPN. </li></ol> 4. اليوم 4 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تشغيل لوحة مع المركبات. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تأخذ لوحة من الحاضنة ونترك الامر عند RT لحوالي 30 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد 1 مل من 100 ميكرومتر من السوماتوستاتين وايزوبروتيرينول في RPMI-1640 بإضافة 10 ميكرولتر من محلول المخزون (10 ملم) في 990 ميكرولتر من RPMI-1640. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ملء لوحة مركب من قبل الاستغناء عن 20 ميكرولتر في الآبار المناسب كما هو مبين في الشكل 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغطية لوحة المركبة بختم قبل القطع pierceable لتجنب التغير في تركيز مركب بسبب التبخر قبلأو أثناء الحضانة في نظام قائم CDS-. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لوحة تحميل الخلية، نصائح ماصة، والمركب إلى لوحة النظام القائم CDS-. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اسم لوحة في البرنامج أداة تستند CDS-. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حدد البروتوكول المناسب. يسمى بروتوكول تحريرها لتصنيف PBMCs مع &#39;خلايا ناهض غير ملتصقة عينة صغيرة لوحة RT 15 دقيقة. انتقل إلى مربع البروتوكول وحدد هذا البروتوكول في قائمة البروتوكولات </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدء بروتوكول بالضغط على &#39;ابدأ&#39;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نظام متكامل FLUIDICS يضيف في وقت واحد مركبات لجميع الآبار عن طريق حقن 5 ميكرولتر لكل بئر لتحقيق تركيز النهائي من 10 ميكرومتر في الحجم الكلي لل50 ميكرولتر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نظام يستند CDS-تلقائيا بجمع البيانات لمدة 15 دقيقة بعد إضافة مركب. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحليل البيانات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد نطاقات المنخفضة والعالية من الترددات لاستخدامها عند حساب القيم المستخرجة للغيرالخلايا الملتصقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حدد تصحيح الانحراف لتصحيح التغيير في القياسات الخطية مقاومة خط الأساس مع مرور الوقت. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حدد تصفية البيانات لتقليل الاختلافات في قياس الاستجابة الحركية بسبب الضوضاء الإلكترونية وبالإضافة إلى ذلك المجمع. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حدد أسلوب ماكس مين للمرة تحليل كامل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تصدير البيانات إلى Excel تحت خيار شكل لوحة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حساب دلتا G (ΔG) وذلك بطرح متوسط ​​حجم استجابة لغي التحفيز (RmGi) من متوسط ​​حجم استجابة لع التحفيز (RmGs) باستخدام الصيغة التالية: ΔG = RmGi - RmGs </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حساب النسبة المئوية لتأثير أضعاف (الحديد) من OPN على استجابة غي بوساطة بقسمة متوسط ​​حجم الاستجابة لتحفيز غي بحضور OPN (RmGiOPN) مع متوسط ​​حجم استجابة لGI التحفيز في وجود برنامج تلفزيوني ( RmGiPBS) باستخدام الصيغة التالية: الحديد = 100 × (RmGiOPN / RmGiPBS) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الرجوع إلى T2 قادرة على تصنيف المرضى. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Kane, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevalence:+a+call+for+a+statement+of+terms.">Prevalence: a call for a statement of terms.</a> Clin Orthop. Relat Res. 126, 43-46 (1977).</li><li>Bunnell, W. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+screening+for+scoliosis.">Selective screening for scoliosis.</a> Clin Orthop Relat Res. 434, 40-45 (2005).</li><li>Asher, M. A., Burton, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adolescent+idiopathic+scoliosis:+natural+history+and+long+term+treatment+effects.">Adolescent idiopathic scoliosis: natural history and long term treatment effects.</a> Scoliosis. 1 (1), 2 (2006).</li><li>Fong, D. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+meta-analysis+of+the+clinical+effectiveness+of+school+scoliosis+screening.">A meta-analysis of the clinical effectiveness of school scoliosis screening.</a> Spine (Phila Pa 1976). 35 (10), 1061-1071 (2010).</li><li>Chowanska, J., Kotwicki, T., Rosadzinski, K., Sliwinski, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=School+screening+for+scoliosis:+can+surface+topography+replace+examination+with+scoliometer?.">School screening for scoliosis: can surface topography replace examination with scoliometer?.</a> Scoliosis. 7 (9), 1748-7161 (2012).</li><li>Kim, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scoliosis+imaging:+what+radiologists+should+know.">Scoliosis imaging: what radiologists should know.</a> Radiographics. 30 (7), 1823-1842 (2010).</li><li>Wong, H. K., Hui, J. H., Rajan, U., Chia, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Idiopathic+scoliosis+in+Singapore+schoolchildren:+a+prevalence+study+15+years+into+the+screening+program.">Idiopathic scoliosis in Singapore schoolchildren: a prevalence study 15 years into the screening program.</a> Spine. 30 (10), 1188-1196 (2005).</li><li>Nachemson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+long+term+follow-up+study+of+non-treated+scoliosis.">A long term follow-up study of non-treated scoliosis.</a> Acta Scand. 39 (4), 466-476 (1968).</li><li>Enneking, W. F., Harrington, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathological+changes+in+scoliosis.">Pathological changes in scoliosis.</a> J. Joint Surg. 51 (1), 165-184 (1969).</li><li>Miller, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cause+and+natural+history+of+adolescent+idiopathic+scoliosis.">Cause and natural history of adolescent idiopathic scoliosis.</a> Orthop. Clin. North Am. 30 (3), 343-3452 (1999).</li><li>Nash, C. L., Gregg, E. C., Brown, R. H., Pillai, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Risks+of+exposure+to+X-rays+in+patients+undergoing+long-term+treatment+for+scoliosis.">Risks of exposure to X-rays in patients undergoing long-term treatment for scoliosis.</a> J. Bone Joint Surg. Am. 61 (3), 371-400 (1979).</li><li>Akoume, M. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-based+screening+test+for+idiopathic+scoliosis+using+cellular+dielectric+spectroscopy.">Cell-based screening test for idiopathic scoliosis using cellular dielectric spectroscopy.</a> Spine. 35 (13), 601-608 (2010).</li><li>Verdonk, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+dielectric+spectroscopy:+a+label-free+comprehensive+platform+for+functional+evaluation+of+endogenous+receptors.">Cellular dielectric spectroscopy: a label-free comprehensive platform for functional evaluation of endogenous receptors.</a> Assay Drug Dev. Technol. 4 (5), 609-6019 (2006).</li><li>Peters, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+cellular+dielectric+spectroscopy,+a+whole-cell,+label-free+technology+for+drug+discovery+on+Gi-coupled+GPCRs.">Evaluation of cellular dielectric spectroscopy, a whole-cell, label-free technology for drug discovery on Gi-coupled GPCRs.</a> J. Biomol. Screen. 12 (3), 312-319 (2007).</li><li>Peters, M. F., Scott, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+cellular+impedance+assays+for+detection+of+GPCR+pleiotropic+signaling+and+functional+selectivity.">Evaluating cellular impedance assays for detection of GPCR pleiotropic signaling and functional selectivity.</a> J. Biomol. Screen. 14 (3), 246-255 (2009).</li><li>Peters, M. F., Vaillancourt, F., Heroux, M., Valiquette, M., Scott, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparing+label-free+biosensors+for+pharmacological+screening+with+cell-based+functional+assays.">Comparing label-free biosensors for pharmacological screening with cell-based functional assays.</a> Assay Drug Dev. Technol. 8 (2), 219-227 (2010).</li><li>Akoume, M. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disrupted+Gi-coupled+receptor+signaling+occurs+in+adolescent+idiopathic+scoliosis.">Disrupted Gi-coupled receptor signaling occurs in adolescent idiopathic scoliosis.</a> J. Clin. Invest. , (2013).</li></ol>

هذا العمل أدى إلى عقد العديد من براءات الاختراع من قبل مستشفى سانت جوستين جامعة وكثير غيرها لا تزال معلقة في عدة بلدان. البعد الرابع هو محور LLC المرخص له الحصري لمستشفى جامعة سانت جوستين.

وصفناها إجراء مفصل لاختبار خلية مقرها النذير لجنف مجهول السبب أن ينطبق على خلايا الدم المحيطية (PBMCs) معزولة طازجة أو مجمدة حفظها لمدة تصل إلى واحد في النيتروجين السائل. منذ استخدام PBMCs المعزولة حديثا مرهقة عند اختبار عدد كبير من الأفراد، وقدم الإجراء مع PBMCs المجمدة التي توفر بديلا أكثر عملية في إعداد سريرية. ومع ذلك، ووجهت مشاكل مع التثاقل الخلية على الذوبان عندما استخدمت في البداية PBMCs المجمدة، مما يؤدي في بعض الأحيان إلى تقلب بين الفحص. لتعظيم فحص استنساخ، نوصي بتجنب دورة تجميد ذوبان الجليد وباستخدام عينة مجمدة مرة واحدة فقط. هذا الإجراء هو بسيط جدا، والسماح لكشف دقيق للخلل وظيفة البروتين غي في وقت قصير. باستخدام هذا الإجراء، والأطفال أعراض وجنفي يمكن تصنيفها بسهولة للتنبؤ أفضل النتائج السريرية من دون أي خطر على صحتهم. حويفر، عند تنفيذ التصنيف وفقا لدرجة الحد الأقصى ردا على التحفيز غي نسبة إلى الضابطة الصحية 12، يجب أن تتحقق متطلبات عدة لالضابطة. في الواقع، من أجل أن يكون لفيف مقارنة صحيحة، يجب أن تكون الضابطة العمر والجنس المتطابقة، لا يكون على أي نوع من الدواء، وتوفير المعلومات الخاصة، مثل الفرد / التاريخ الطبي العائلي الماضية. قد تشكل هذه المتطلبات عقبة هامة لتوظيف الضابطة. لذلك، من خلال دراسة أداء تصنيف درجة من عدم التوازن بين الاستجابة لغي وع البروتين التحفيز في نفس الفرد هو المثل الأعلى للقضاء على ضرورة استخدام الضابطة. استخدام نظام يستند CDS-لأداء هذا الاختبار النذير مهم من حيث توفير وقت واحد غي والاستجابات الخلوية ع بوساطة في نفس الفحص. على الرغم من أن العديد من المرضى يمكن أن تصنف مع عدم وجود صباحاbiguity باستخدام مجموعة ديناميكية ثابتة لهذا الاختبار، وعدد قليل من المرضى سوف يحمل القيم على الشريط الحدودي من النطاقات، كما يتضح من نتائج هذا التقرير. لتميز هؤلاء الأفراد، أدخلنا تقييم تأثير OPN على الاستجابة لتحفيز غي من خلال إظهار أن OPN يؤدي الى التأثير المتفاوت على الاستجابة الخلوية غي بوساطة بين المجموعات الوظيفية الثلاث. في الواقع، وجدنا أن في وجود OPN، استجابة لزيادة التحفيز غي في FG1، في حين أنه يقلل في FG2 وFG3، إلى أعلى حد في FG2. على الرغم من التكلفة العالية لOPN، واستخدام هذا chemokine الضروري أن نميز الحالات الغامضة، وبالتالي تحسين دقة الفحص تصنيف لدينا. ومع ذلك، هذا الاختبار لديه عيب في أن هناك حاجة إلى الحد الأدنى من 1.5 × 10 5 خلايا لكل بئر لمراقبة استجابة الخلوية مع نظام يقوم CDS-تحت ظروف تجريبية لدينا. سوف عينات المرضى معينة ليس لديها عدد كاف منخلايا لفحصها. في هذه الحالة، من الضروري أن نذكر المرضى لجمع الدم إضافية، والتي يمكن أن تكون مثيرة للقلق للأسر ومحبطة لأفراد الطواقم الطبية والمختبرية. ومن المقرر الدراسات المستقبلية في مختبرنا لمعالجة هذه المسألة. ومع ذلك، يعتمد البروتوكول الحالي على طرق بسيطة ومجربة لإعداد الخلايا بينما يتم اختبار الآلي باستخدام نظام التسمية خالية من التحقق من صحة 13 و 14 لرصد الاستجابات للخلايا. منصة الاختبار غير مكلفة نسبيا بالمقارنة مع منصة الجينية المتاحة لتشخيص أمراض أخرى. أيضا، فإن تكلفة جميع المواد القابل للتصرف، بما في ذلك أنابيب جمع الدم، نصائح، القطب خاصة microplates، والمخروطية وأنابيب إيبندورف، ليست مكلفة جدا ويقدر بأقل من 3،000 دولار لإكمال اختبار ما يقرب من ألف مريض. على الرغم من هذا التقدير لا يشمل تكاليف اليد العاملة لإعداد العيناتوأداء الاختبار، لا يزال هذا الاختبار إلى حد كبير أكثر يسرا من الجيل المقبل من منصات التسلسل. الجدير بالذكر، ليس فقط مقارنة التكاليف لمنصات الوراثية، ولكن أكثر تتعلق مجال AIS على وجه التحديد، هي التكاليف المرتبطة إلى التصوير الإشعاعي. اليوم، يتم تشخيص أكثر من مليون طفل في الولايات المتحدة وحوالي 100،000 طفل في كندا مع الجنف مجهول السبب، والتكلفة الإجمالية للتشخيص ورصد الأطفال جنفي عن التعرض للأشعة السينية هي أكثر من 2.5 مليار دولار سنويا في أمريكا الشمالية. وبالتالي، من المتوقع أن تكون مناسبة للتفتيش الروتيني ومراقبة الأطفال الذين يعانون من الجنف مجهول السبب دون مخاطر صحية وبتكلفة أقل لدينا إجراء فحص خلية مقرها.

الجنف مجهول السبب هو تشوه العمود الفقري لسبب غير معروف تعرف عموما بأنها انحناء الجانبي أكبر من 10 درجة مصحوبة التناوب الفقري 1. يؤثر على حالة 4٪ من السكان ويتم تشخيص الأطفال الأكثر شيوعا بين سن 9 إلى 13 عاما 2،3،4. التشخيص هو في المقام الأول من الإقصاء ويتم فقط بعد استبعاد الأسباب الأخرى للتشوه في العمود الفقري مثل تشوه العمود الفقري، أو اضطرابات العصبية والعضلية المتلازمات. تقليديا، تبين عدم التماثل trunkal من قبل آدمز اختبار الانحناء إلى الأمام، ويقاس مع مقياس الجنف خلال الفحص البدني 5. ويمكن بعد ذلك يتم تأكيد التشخيص عن طريق التصوير الشعاعي للمراقبة من منحنى وقياس زاوية باستخدام طريقة كوب 6. مرة واحدة تم تشخيصها، الشغل الشاغل للأطباء في إدارة الأطفال جنفي هو ما إذا كان منحنى سوف تقدم. في الواقع، وتطور منحنى لا يمكن التنبؤ بها في كثير من الأحيان وهو لوحظ بين الفتيات بشكل متكرر أكثر من الفتيان في 7. إذا لم يعالج، يمكن أن منحنى التقدم بشكل كبير، وخلق تشوهات جسدية كبيرة ومشاكل القلب حتى. هذه المظاهر أصبحت تهدد الحياة عندما يتجاوز منحنى 70 درجة 8،9. وتشمل خيارات العلاج الحالية لمنع أو وقف تطور منحنى تستعد والجراحة. بشكل عام، ينصح تستعد لمنحنيات بين 25-40 درجة مئوية، في حين تم حجز جراحة لمنحنيات أكبر من 45 درجة أو لا تستجيب لتستعد. حوالي 10٪ من الأطفال تشخيص الجنف مجهول السبب يكون تطور منحنى تتطلب جراحة تصحيحية 10. حاليا، لا توجد طريقة مؤكدة أو اختبار متاح لتحديد هذه الفئة من المرضى. بالتالي، يتعرض جميع الأطفال لتشخيص الصور الشعاعية متعددة على مدى عدة سنوات، وعادة حتى تصل إلى مرحلة النضج الهيكل العظمي. وتشير التقديرات إلى أن المرضى نموذجية مع جنف سيكون لهاما يقرب من 22 الفحوصات الإشعاعية على مدى فترة 3 سنوات 11. بسبب الخطر المحتمل من الامتحانات التصوير الشعاعي متعددة، والنهج البديلة التي يمكن أن تسمح بأداء تشخيص الجنف مجهول السبب دون تعريض الأطفال للإشعاع المؤين تكون مرغوبة بشدة. بهدف تلبية هذه الحاجة، وقد وضعنا سابقا الفحص فحص خلية مقرها كاختبار النذير لتحديد عاجلا الأطفال المعرضين للخطر أعراض الجنف مجهول السبب من تطوير. ويتوقع اختبار نتائج السريرية في كل من الأطفال أعراض وتتأثر دراسة الوضع الوظيفي للبروتينات غي وتصنيف الأطفال إلى ثلاث مجموعات وظيفية (FG1، FG2 وFG3) وفقا لدرجة الحد الأقصى ردا على البروتين غي التحفيز 12 مقاسا CDS نظام قائم. ويستخدم هذا النظام إلى حد كبير لتقييم نقل الإشارة من خلال البروتينات G في مختلف أنواع الخلايا 13،14،15،16. انه يعطي معلومات عن<html> مجموعه متكاملة من استجابة الخلايا للمؤثرات الخارجية من خلال قياس التغيرات في مقاومة بعد تنشيط مستقبلات سطح الخلية. هي المصنفة الخلايا في microplates التي تحتوي على أقطاب كهربائية في الجزء السفلي من الآبار ويطبق نظام الجهد الصغيرة التي تحفز التيارات خارج الخلية والعابر للخلايا. بعد حقن المركب في البئر، يتم تحفيز مستقبلات سطح الخلية وتحدث الأحداث نقل الإشارة، مما يؤدي إلى التغيرات الخلوية التي تؤثر على تدفق تيارات خارج الخلية والعابر للخلايا، وبالتالي تؤثر على حجم قياسه. مع هذا النهج، والمرضى والأطفال جنفي أكثر عرضة لخطر تطوير جنف هي أقل استجابة لغي تحفيز البروتين مقارنة مع الضابطة صحية، ويستند التصنيف على نسبة الدرجة من انخفاض نسبي للسيطرة على المجموعة. يتم إصلاح النطاقات تصنيف بين 10 و 40٪ لFG3 و 40 و 60٪ لFG2، و 60، و 90٪ للFG1 12. ق ق = &quot;jove_content&quot;&gt; وفي الآونة الأخيرة، قمنا بتعديل هذا النهج من خلال إظهار أن المجموعات الوظيفية الثلاثة يمكن تمييزها بوضوح وفقا لمحة من عدم التوازن بين الاستجابة لغي والتحفيز ع. في الواقع، وجدنا أن الاستجابة لتحفيز غي سادت في FG3، في حين لم يلاحظ أي خلل واضح في FG2. في المقابل، أظهرت FG1 غلبة للاستجابة لتحفيز ع. بالإضافة إلى ذلك، قدمنا ​​أدلة على أن المرضى الذين ينتمون إلى FG2 هي أكثر عرضة للخطر من يتقدم إلى نقطة تحتاج إلى عملية جراحية 17. وكذلك تم تحسين دقة هذا الاختبار تصنيف من خلال إظهار تأثير الفرق من osteopontin (OPN) على الاستجابة لتحفيز غي بين المجموعات الوظيفية. نحن هنا توثيق خطوات تفصيلية من الإجراءات التجريبية والتحليلية لهذا الاختبار وظيفية يؤديها حاليا في مختبرنا.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI</td>
			<td>Wisent, Inc</td>
			<td>350-005-CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Therno Scientific Hyclone</td>
			<td>SH3007103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll-Plaque Plus</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17144003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15240-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phytohemagglutinin</td>
			<td>Invitrogen (Gibco)</td>
			<td>10576-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human Osteopontin</td>
			<td>R&#38;D Systems, Inc</td>
			<td>1433-OP/CF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Somatostatin</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>1157</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoproterenol</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>1743</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Wisent, Inc</td>
			<td>311-010-CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile pipette tips</td>
			<td>Axygen Scientific</td>
			<td>301-06-451</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Eppendorf tubes</td>
			<td>Ultident</td>
			<td>24-MCT-150-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml conical tubes</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>89039-658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellkey small sample 96W microplate</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>1026496</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellkey tips</td>
			<td>Cybio</td>
			<td>OL3800-25-559N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precut pierceable seals</td>
			<td>Excel Scientific, Inc</td>
			<td>XP-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vicell XR</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>731050</td>
			<td>Automated cell counter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture hood</td>
			<td>Forma Scientific</td>
			<td>1284</td>
			<td>Class II</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid nitrogen storage</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>CY5093570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>89032-204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard light microscope</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>DMIL LED</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>51019557</td>
			<td>5% CO2 at 37 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low speed centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75004364</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellkey system</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>1019185</td>
			<td>CDS-based instrument</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cell-based assay protocol for the prognostic prediction of idiopathic scoliosis using cellular dielectric spectroscopy

تفاصيل هذا البروتوكول الإجراء التجريبية والتحليلية لفحص خلية مقرها وضعت في المختبر لدينا بمثابة اختبار وظيفي للتنبؤ والتكهن الجنف مجهول السبب عند الأطفال أعراض والمتضررة. يتكون الاختبار من تقييم الحالة الوظيفية للغي وع البروتينات في الخلايا الدموية المحيطية وحيدات النوى (PBMCs) من خلال التحليل الطيفي عازلة الخلوية (CDS)، وذلك باستخدام أداة التلقائية وفقا CDS-، وتصنيف الأطفال إلى ثلاث مجموعات وظيفية (FG1 ، FG2، FG3) فيما يتعلق الشخصى التوازن بين درجة استجابة لغي وع البروتينات التحفيز. تأكيد التصنيف مزيد من التأثير المتباين للosteopontin (OPN) على الاستجابة لتحفيز غي بين الجماعات والمشار إليها تطور شديد من المرض عن طريق FG2. تقريبا، لا بد من حجم 10 مل من الدم لاستخراج PBMCs بواسطة Ficoll-الانحدار والخلايا ثم يتم تخزينها في النيتروجين السائل. عدد كاف من Pيتم الحصول على خلايا نخاع العظم لأداء الفحص بعد يومين من زراعة الخلايا. أساسا، يتم تحضين الخلايا الأولى مع phytohemmaglutinin (فا). بعد 24 ساعة الحضانة، يتم استبدال المتوسطة من قبل مستنبت خالية من PHA ل24 ساعة إضافية قبل البذر الخلية والعلاج OPN. ثم يتم فحص الخلايا الطيفي لردودها على السوماتوستاتين وايزوبروتيرينول، التي تنشط على التوالي غي وع البروتينات من خلال مستقبلاتها وما شابه ذلك. يتم حقن كل من السوماتوستاتين وايزوبروتيرينول في وقت واحد مع نظام FLUIDICS متكاملة وتتم مراقبة ردود الخلايا لمدة 15 دقيقة. الفحص لا يمكن أن يؤديها مع PBMCs الطازجة أو المجمدة واكتمال الإجراء في غضون 4 أيام.

كان بقاء الخلية مقارنة بين جميع العينات مع القيم متسقة في حدود 86 و 96٪. في المقابل، لوحظت اختلافات في ارتفاع أعداد الخلايا بين العينات (الجدول 3). من 32 العينات المستخدمة، وكان اثنين من عدد كاف من الخلايا والتي لم يتم تصنيفها. وأظهرت مثال على نتائج التصنيف الوظيفي وفقا لدرجة من التوازن بين غي وع الإشارات في الشكل 3. وينقسم المحور العمودي من هذا الرقم إلى ثلاثة أقسام ترسيم المجموعات الوظيفية مع نطاقات دينامية على النحو المنصوص عليه&gt; +10 لFG3، بين +10 و -10 لFG2، وأخيرا &lt;-10 لFG1. بين 30 مريضا اختبار هنا، ان 14، 6، و 5 مرضى تصنف بشكل واضح في FG3، FG2، وFG1، على التوالي، في حين أن خمسة مرضى، وخاصة 345، 353، 370، 371، و 382، كانت في الشريط الحدودي النطاقات. ان تقييم تأثير OPN على الاستجابة لتحفيز غي كشفت أن OPN زيادة الاستجابة في السلطة الفلسطينيةالمرضى في 353 و 371. في المقابل، تم تخفيض استجابة بأكثر من 50٪ في المرضى 345 و 382 وبنسبة أقل من 50٪ في المرضى بعد العلاج rOPN 370. لذلك، وفقا لمعايير التصنيف لدينا (الجدول 2)، كنا قادرين على تصنيف المرضى 353 و 371 في FG1، والمرضى 345 و 382 في FG2، والمريض 370 في FG3. في موازاة ذلك، تم فحص جميع المرضى لاستجابتها لغي تحفيز البروتين ومقارنة بالمجموعة الضابطة. كما هو متوقع، كان جميع المرضى أقل استجابة من الضابطة، والمرضى تصنف في نفس المجموعة الفنية من خلال الإجراء الجديد لدينا أظهرت مستويات مماثلة من الحد الأقصى للاستجابة (الشكل 5). علاوة على ذلك، كان التفاوت بين المرضى من كل مجموعة وظيفية متسقة مع مجموعة الكلاسيكية لدينا تصنيف 12 والتأكد من صحتها الإجراء الجديد لدينا. وقد كشف تصنيف لفيف كبير من المرضى جنفي اتباعها بانتظام في عيادة خاصة لدينا في مستشفى سانت جوستين ان الثلاثةوزعت المجموعات الوظيفية بالمثل بين الحالات المعتدلة، في حين كان السائد بين FG2 الحالات الشديدة (الشكل 6)، وتحديد المرضى تصنيفها إلى هذه المجموعة وظيفية وأكثر عرضة للتطور شديد للمرض وتشير إلى أن هذا الاختبار تصنيف يمكن أن تكون مفيدة في الجنف مجهول السبب التكهن. <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td rowspan="5"> الحل A </td><td> اللامائية مد الجلوكوز </td><td> 0.1٪ </td></tr><tr><td> و CaCl 2 2H 2 O </td><td> 0.05 ملي </td></tr><tr><td> MgCl 2 </td><td> 0.98 ملي </td></tr><tr><td> بوكل </td><td> 5.4 ملي </td></tr><tr><td> تريس </td><td> 145 ملي </td></tr><tr><td> الحل B </td><td> كلوريد الصوديوم </td><td> 140 ملي </td></tr><tr><td rowspan="2"> محلول الملح المتوازن (BSS) </td><td> الحل A </td><td> 1 حجم </td></tr><tr><td> الحل B </td><td> 9 حجم </td></tr><tr><tdروسبان = &quot;3&quot;&gt; وسائل الإعلام كاملة </td><td> RPMI-1640 </td><td> 500 مل </td></tr><tr><td> مضاد فطري للمضادات الحيوية </td><td> 1٪ </td></tr><tr><td> FBS </td><td> 10٪ </td></tr><tr><td rowspan="3"> وسائل الإعلام التكميلية </td><td> RPMI-1640 </td><td> 50 مل </td></tr><tr><td> مضاد فطري للمضادات الحيوية </td><td> 1٪ </td></tr><tr><td> FBS </td><td> 40٪ </td></tr><tr><td rowspan="4"> وسائل الإعلام تجميد </td><td> RPMI-1640 </td><td> 50 مل </td></tr><tr><td> مضاد فطري للمضادات الحيوية </td><td> 1٪ </td></tr><tr><td> FBS </td><td> 40٪ </td></tr><tr><td> DMSO </td><td> 20٪ </td></tr><tr><td rowspan="4"> وسائل الإعلام PHA </td><td> RPMI-1640 </td><td> 500 مل </td></tr><tr><td> مضاد فطري للمضادات الحيوية </td><td> 1٪ </td></tr><tr><td> FBS </td><td> 10٪ </td></tr><tr><td> Phytohemaglutinin </td><td> 1٪ </td></tr></tbody></table> الجدول 1. الأساسيةحلول. <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> نطاقات ديناميكية مع ΔG </td><td> المجموعات الوظيفية </td><td> نطاقات ديناميكية مع الحديد </td></tr><tr><td> ΔG &lt;-10 </td><td> FG1 </td><td> الحديد&gt; 100٪ </td></tr><tr><td> -10 &lt;ΔG &lt;+10 </td><td> FG2 </td><td> الحديد &lt;50٪ </td></tr><tr><td> ΔG&gt; +10 </td><td> FG3 </td><td> 50٪ &lt;الحديد &lt;95٪ </td></tr></tbody></table> الجدول 2. تصنيف المجموعات الوظيفية وفقا لنطاقات الديناميكية التي أقيمت مع ΔG والحديد. <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> المرضى </td><td> الجدوى (٪) </td><td> تركيز خلية (10 × 6 / مل) </td><td> تعليقات </td></tr><tr><td> 343 </td><td> 88.7 </td><td> 11.64 </td><td></td></tr><tr><td> 344 </td><td> 90.5</td><td> 13.6 </td><td></td></tr><tr><td> 345 </td><td> 94.4 </td><td> 8.54 </td><td></td></tr><tr><td> 346 </td><td> 94.3 </td><td> 25.79 </td><td></td></tr><tr><td> 347 </td><td> 94.2 </td><td> 27.36 </td><td></td></tr><tr><td> 348 </td><td> 94.6 </td><td> 8.52 </td><td></td></tr><tr><td> 349 </td><td> 91.2 </td><td> 0.82 </td><td> عدد كاف من الخلايا </td></tr><tr><td> 350 </td><td> 90.3 </td><td> 8.92 </td><td></td></tr><tr><td> 352 </td><td> 92.6 </td><td> 8.28 </td><td></td></tr><tr><td> 353 </td><td> 91.3 </td><td> 12.75 </td><td></td></tr><tr><td> 354 </td><td> 86.9 </td><td> 7.62 </td><td></td></tr><tr><td> 355 </td><td> 91.2 </td><td> 7.51 </td><td></td></tr><tr><td> 356 </td><td> 90.3 </td><td> 9.36 </td><td></td></tr><tr><td> 358 </td><td> 95.1 </td><td> 16.94 </td><td></الدفتيريا&gt; </tr><tr><td> 359 </td><td> 92.3 </td><td> 13.89 </td><td></td></tr><tr><td> 360 </td><td> 89.4 </td><td> 7.67 </td><td></td></tr><tr><td> 361 </td><td> 93.5 </td><td> 7.84 </td><td></td></tr><tr><td> 365 </td><td> 86.5 </td><td> 2.2 </td><td> عدد كاف من الخلايا </td></tr><tr><td> 368 </td><td> 92.6 </td><td> 15.69 </td><td></td></tr><tr><td> 369 </td><td> 93.4 </td><td> 10.9 </td><td></td></tr><tr><td> 370 </td><td> 92.5 </td><td> 19.93 </td><td></td></tr><tr><td> 371 </td><td> 88.8 </td><td> 10.68 </td><td></td></tr><tr><td> 374 </td><td> 93.9 </td><td> 16.86 </td><td></td></tr><tr><td> 376 </td><td> 92.9 </td><td> 15.67 </td><td></td></tr><tr><td> 377 </td><td> 93.1 </td><td> 9.99 </td><td></td></tr><tr><td> 378 </td><td> 93.6 </td><td> 13.57 </td><td></td></tr><tr><td> 379 &lt;/ الدفتيريا&gt; <td> 92.6 </td><td> 19.86 </td><td></td></tr><tr><td> 380 </td><td> 91.1 </td><td> 8.46 </td><td></td></tr><tr><td> 381 </td><td> 93.9 </td><td> 14.82 </td><td></td></tr><tr><td> 382 </td><td> 92.1 </td><td> 23.06 </td><td></td></tr><tr><td> 383 </td><td> 92.9 </td><td> 11.82 </td><td></td></tr><tr><td> 384 </td><td> 89.1 </td><td> 7.73 </td><td></td></tr></tbody></table> الجدول 3. الجدوى في المئة وتركيز خلية كما هو محدد باستخدام عداد الخلايا الآلي وقابلية محلل. <img alt="الشكل 1" src="/files/ftp_upload/50768/50768fig1.jpg" /> الشكل 1. تصميم لبذر الخلية. <img alt="الرقم 2" src="/files/ftp_upload/50768/50768fig2.jpg" /> الشكل 2.تصميم للاستغناء عن المركبات. <img alt="الرقم 3" src="/files/ftp_upload/50768/50768fig3.jpg" /> الرقم 3. مجموعة ديناميكية من التصنيف الوظيفي باستخدام نظام قائم CDS-. ويوضح الرسم البياني القيم لدرجة عدم التوازن بين الردود على غي والتحفيز ع الحصول عليها في PBMCs من المرضى الذين يعانون من الجنف مجهول السبب. تم قياس القيم من قبل النظام القائم CDS-ردا على 10 ميكرومتر من السوماتوستاتين وايزوبروتيرينول. كل نقطة تمثل ΔG كل الردود في مكررة. <img alt="الرقم 4" src="/files/ftp_upload/50768/50768fig4.jpg" /> الشكل 4. تأثير rOPN على الاستجابة لتحفيز غي في PBMCs. تم تجويع الخلايا المصل لمدة 18 ساعة في وجود أو عدم وجود 0.5 ميكروغرام / مل rOPN ثم حفز مع 10<html> 56؛ M من السوماتوستاتين لبدء الاستجابة الخلوية غي بوساطة. وقد تم توليد البيانات في الرسم البياني من أقصى الحد الأدنى من مقاومة وتتوافق مع متوسط ​​الاستجابة في مكررة. <img alt="الرقم 5" src="/files/ftp_upload/50768/50768fig5.jpg" /> الرقم 5. حالة وظيفية من البروتين غي في PBMCs من السيطرة والمواضيع scoliostic. تعرضت PBMCs من الضابطة ومرضى جنفي إلى زيادة تركيزات السوماتوستاتين لتحفيز البروتينات غي عبر مستقبلات السوماتوستاتين الذاتية. وقد تم قياس الاستجابة الخلوية من قبل النظام القائم CDS-كما هو موضح في القسم الداخلي. تم إنشاء منحنيات من أقصى الحد الأدنى من مقاومة. يمثل كل منحنى الانحدار غير الخطية. تم تطبيع البيانات إلى الاستجابة القصوى في الخلايا من الضابطة وكل نقطة يتوافق مع متوسط ​​الاستجابة في مكررة./ 50768/50768fig5large.jpg &quot;الهدف =&quot; _blank &quot;&gt; اضغط هنا لعرض أكبر شخصية. <img alt="الرقم 6" src="/files/ftp_upload/50768/50768fig6.jpg" /> الرقم 6. توزيع المجموعات الوظيفية بين مراحل مختلفة من الجنف. A فوج كبير من المرضى جنفي مع 794 المعتدلة (الانحرافات بين 10-44 درجة) و162 الحالات الشديدة (انحناء أكبر من 45 درجة)، يليه بانتظام في مستشفى سانت جوستين، صنفت وفقا لدرجة من التوازن بين الاستجابة لغي وع التحفيز. تم قياس ردود النظام القائم CDS-ردا على 10 ميكرومتر من السوماتوستاتين وايزوبروتيرينول.

Watch this Scientific Journal Video about Cell-based Assay Protocol for the Prognostic Prediction of Idiopathic Scoliosis Using Cellular Dielectric Spectroscopy at JoVE.com

Cell-based Assay Protocol for the Prognostic Prediction of Idiopathic Scoliosis Using Cellular Dielectric Spectroscopy

ويرد البروتوكول المنظم لفحص خلية مقرها بمثابة اختبار وظيفي للتنبؤ والتكهن الجنف مجهول السبب باستخدام التحليل الطيفي عازلة الخلوية (CDS). الفحص لا يمكن أن يؤديها مع خلايا الدم المحيطية الطازجة أو المجمدة (PBMCs) واكتمال الإجراء في غضون 4 أيام.

بروتوكول الفحص على أساس خلية للتنبؤ النذير من الجنف مجهول السبب عن طريق الخلوي عازل الطيفي

This protocol details the experimental and analytical procedure for a cell-based assay developed in our laboratory as a functional test to predict the ...

cell-based-assay-protocol-for-prognostic-prediction-idiopathic

Research

JoVE Journal

Medicine

10.5K Views.  Sainte-Justine University Hospital Research Center.  ويرد البروتوكول المنظم لفحص خلية مقرها بمثابة اختبار وظيفي للتنبؤ والتكهن الجنف مجهول السبب باستخدام التحليل الطيفي عازلة الخلوية (CDS). الفحص لا يمكن أن يؤديها مع خلايا الدم المحيطية الطازجة أو المجمدة (PBMCs) واكتمال الإجراء في غضون 4 أيام. 

Video: Cell-based Assay Protocol for the Prognostic Prediction of Idiopathic Scoliosis Using Cellular Dielectric Spectroscopy

An Experimental Paradigm for the Prediction of Post-Operative Pain (PPOP)

Many women undergo cesarean delivery without problems, however some experience significant pain after cesarean section. Pain is associated with negative short-term and long-term effects on the mother. Prior to women undergoing surgery, can we predict who is at risk for developing significant postoperative pain and potentially prevent or minimize its negative consequences? These are the fundamental questions that a team from the University of Washington, Stanford University, the Catholic University in Brussels, Belgium, Santa Joana Women's Hospital in S&atilde;o Paulo, Brazil, and Rambam Medical Center in Israel is currently evaluating in an international research collaboration. The ultimate goal of this project is to provide optimal pain relief during and after cesarean section by offering individualized anesthetic care to women who appear to be more 'susceptible' to pain after surgery.
A significant number of women experience moderate or severe acute post-partum pain after vaginal and cesarean deliveries. 1 Furthermore, 10-15% of women suffer chronic persistent pain after cesarean section. 2 With constant increase in cesarean rates in the US 3 and the already high rate in Brazil, this is bound to create a significant public health problem. When questioning women's fears and expectations from cesarean section, pain during and after it is their greatest concern. 4 Individual variability in severity of pain after vaginal or operative delivery is influenced by multiple factors including sensitivity to pain, psychological factors, age, and genetics. The unique birth experience leads to unpredictable requirements for analgesics, from 'none at all' to 'very high' doses of pain medication. Pain after cesarean section is an excellent model to study post-operative pain because it is performed on otherwise young and healthy women. Therefore, it is recommended to attenuate the pain during the acute phase because this may lead to chronic pain disorders. The impact of developing persistent pain is immense, since it may impair not only the ability of women to care for their child in the immediate postpartum period, but also their own well being for a long period of time.
In a series of projects, an international research network is currently investigating the effect of pregnancy on pain modulation and ways to predict who will suffer acute severe pain and potentially chronic pain, by using simple pain tests and questionnaires in combination with genetic analysis. A relatively recent approach to investigate pain modulation is via the psychophysical measure of Diffuse Noxious Inhibitory Control (DNIC). This pain-modulating process is the neurophysiological basis for the well-known phenomenon of 'pain inhibits pain' from remote areas of the body. The DNIC paradigm has evolved recently into a clinical tool and simple test and has been shown to be a predictor of post-operative pain.5 Since pregnancy is associated with decreased pain sensitivity and/or enhanced processes of pain modulation, using tests that investigate pain modulation should provide a better understanding of the pathways involved with pregnancy-induced analgesia and may help predict pain outcomes during labor and delivery. For those women delivering by cesarean section, a DNIC test performed prior to surgery along with psychosocial questionnaires and genetic tests should enable one to identify women prone to suffer severe post-cesarean pain and persistent pain. These clinical tests should allow anesthesiologists to offer not only personalized medicine to women with the promise to improve well-being and satisfaction, but also a reduction in the overall cost of perioperative and long term care due to pain and suffering. On a larger scale, these tests that explore pain modulation may become bedside screening tests to predict the development of pain disorders following surgery.

An Experimental Paradigm for the Prediction of Post-Operative Pain PPOP

Diffuse noxious inhibitory control, temporal summation and wound hyperalgesia testing are demonstrated in the obstetric patient. These tests evaluate inhibitory and excitatory mechanisms of pain processing and are here utilized to evaluate endogenous analgesia at different time-points during pregnancy and the peripartum period to help reveal individual s risk for persistent pain.

والنموذج التجريبي للتنبؤ ألم ما بعد العملية (PPOP)

Many women undergo cesarean delivery without problems, however some experience significant pain after cesarean section. Pain is associated with negative ...

A Method for Murine Islet Isolation and Subcapsular Kidney Transplantation

Since the early pioneering work of Ballinger and Reckard demonstrating that transplantation of islets of Langerhans into diabetic rodents could normalize their blood glucose levels, islet transplantation has been proposed to be a potential treatment for type 1 diabetes 1,2. More recently, advances in human islet transplantation have further strengthened this view 1,3. However, two major limitations prevent islet transplantation from being a widespread clinical reality: (a) the requirement for large numbers of islets per patient, which severely reduces the number of potential recipients, and (b) the need for heavy immunosuppression, which significantly affects the pediatric population of patients due to their vulnerability to long-term immunosuppression. Strategies that can overcome these limitations have the potential to enhance the therapeutic utility of islet transplantation.
Islet transplantation under the mouse kidney capsule is a widely accepted model to investigate various strategies to improve islet transplantation. This experiment requires the isolation of high quality islets and implantation of islets to the diabetic recipients. Both procedures require surgical steps that can be better demonstrated by video than by text. Here, we document the detailed steps for these procedures by both video and written protocol. We also briefly discuss different transplantation models: syngeneic, allogeneic, syngeneic autoimmune, and allogeneic autoimmune.

Transplantation of isolated islets has been proposed to be a potential treatment for type 1 diabetes. Here we describe a method to isolate islets from mouse pancreata and transplant them to the subcapsular space of the kidney.

وهناك طريقة لعزل جزيرة الفئران تحت المحفظة وزراعة الكلى

Since the early pioneering work of Ballinger and Reckard demonstrating that transplantation of islets of Langerhans into diabetic rodents could normalize ...

High-throughput Flow Cytometry Cell-based Assay to Detect Antibodies to N-Methyl-D-aspartate Receptor or Dopamine-2 Receptor in Human Serum

Over the recent years, antibodies against surface and conformational proteins involved in neurotransmission have been detected in autoimmune CNS diseases in children and adults. These antibodies have been used to guide diagnosis and treatment. Cell-based assays have improved the detection of antibodies in patient serum. They are based on the surface expression of brain antigens on eukaryotic cells, which are then incubated with diluted patient sera followed by fluorochrome-conjugated secondary antibodies. After washing, secondary antibody binding is then analyzed by flow cytometry. Our group has developed a high-throughput flow cytometry live cell-based assay to reliably detect antibodies against specific neurotransmitter receptors. This flow cytometry method is straight forward, quantitative, efficient, and the use of a high-throughput sampler system allows for large patient cohorts to be easily assayed in a short space of time. Additionally, this cell-based assay can be easily adapted to detect antibodies to many different antigenic targets, both from the central nervous system and periphery. Discovering additional novel antibody biomarkers will enable prompt and accurate diagnosis and improve treatment of immune-mediated disorders.

Over the recent years, live cell-based assays have been used successfully to detect antibodies against surface and conformational antigens. Here, we describe a method using high-throughput flow cytometry enabling the analysis of large cohorts of patients. Detection of novel antibodies will improve diagnosis and treatment of immune-mediated disorders.

الإنتاجية العالية التدفق الخلوي القائم على الفحص لكشف خلية أضداد N-ميثيل مد اسبارتاتي مستقبلات الدوبامين-2 أو مستقبلات في مصل الإنسان

Over the recent years, antibodies against surface and conformational proteins involved in neurotransmission have been detected in autoimmune CNS diseases ...

Focus Formation: A Cell-based Assay to Determine the Oncogenic Potential of a Gene

Malignant transformation of cells is typically associated with increased proliferation, loss of contact inhibition, acquisition of anchorage-independent growth potential, and the ability to form tumors in experimental animals1. In NIH 3T3 cells, the Ras signal transduction pathway is known to trigger many of these events, what is known as Ras transformation. The introduction of an overexpressed gene in NIH 3T3 cells may promote morphological transformation and loss of contact inhibition, which can help determine the oncogenic potential of that gene of interest. An assay that provides a straightforward method to assess one aspect of the transforming potential of an oncogene is the Focus Formation Assay (FFA)2. When NIH 3T3 cells divide normally in culture, they do so until they reach a confluent monolayer. However, in the presence of an overexpressed oncogene, these cells can begin to grow in dense, multilayered foci1 that can be visualized and quantified by crystal violet or Hema 3 staining. In this article we describe the FFA protocol with retroviral transduction of the gene of interest into NIH 3T3 cells, and how to quantify the number of foci through staining. Retroviral transduction offers a more efficient method of gene delivery than transfection, and the use of an ecotropic murine retrovirus provides a biosafety control when working with potential human oncogenes.

The Focus Formation Assay provides a straightforward method to assess the transforming potential of a candidate oncogene.

التركيز تشكيل: A الفحص القائم على خلية لتحديد إمكانية أنكجنيك لجين

Malignant transformation of cells is typically associated with increased proliferation, loss of contact inhibition, acquisition of anchorage-independent ...

Diffuse Optical Spectroscopy for the Quantitative Assessment of Acute Ionizing Radiation Induced Skin Toxicity Using a Mouse Model

Acute skin toxicities from ionizing radiation (IR) are a common side effect from therapeutic courses of external beam radiation therapy (RT) and negatively impact patient quality of life and long term survival. Advances in the understanding of the biological pathways associated with normal tissue toxicities have allowed for the development of interventional drugs, however, current response studies are limited by a lack of quantitative metrics for assessing the severity of skin reactions. Here we present a diffuse optical spectroscopic (DOS) approach that provides quantitative optical biomarkers of skin response to radiation. We describe the instrumentation design of the DOS system as well as the inversion algorithm for extracting the optical parameters. Finally, to demonstrate clinical utility, we present representative data from a pre-clinical mouse model of radiation induced erythema and compare the results with a commonly employed visual scoring. The described DOS method offers an objective, high through-put evaluation of skin toxicity via functional response that is translatable to the clinical setting.

We present a diffuse optical spectroscopic (DOS) approach that provides quantitative optical biomarkers of skin response to radiation. We describe DOS instrumentation design, optical parameters extraction algorithms and the animal handling procedures required to yield representative data from a pre-clinical mouse model of radiation induced erythema.

منتشر الطيفي الضوئي للتقييم الكمي الحاد الإشعاعات المؤينة الجلد المستحث السمية باستخدام نموذج الفأر

Acute skin toxicities from ionizing radiation (IR) are a common side effect from therapeutic courses of external beam radiation therapy (RT) and ...

Identifying Inhibitors of the HBx-DDB1 Interaction Using a Split Luciferase Assay System

There is an urgent need for novel therapeutic agents for hepatitis B virus (HBV) infection. Although currently available nucleos(t)ide analogs potently inhibit viral replication, they have no direct effect on the expression of viral proteins transcribed from a viral covalently closed circular DNA (cccDNA). As high viral antigen load may play a role in this chronic and HBV-related carcinogenesis, the goal of HBV treatment is to eradicate viral proteins. HBV regulatory protein X (HBx) binds to the host DNA damage-binding protein 1 (DDB1) protein to degrade structural maintenance of chromosomes 5/6 (Smc5/6), resulting in activation of viral transcription from cccDNA. Here, using a split luciferase complementation assay system, we present a comprehensive compound screening system to identify inhibitors of the HBx-DDB1 interaction. Our protocol enables easy detection of interaction dynamics in real time within living cells. This technique may become a key assay to discover novel therapeutic agents for treatment of HBV infection.

Here, we present a method for screening anti-hepatitis B viral agents that inhibit the HBx-DDB1 interaction using a split luciferase assay system. This system allows easy detection of protein-protein interactions and is suitable for identifying inhibitors of such interactions.

تحديد مثبطات التفاعل HBx-DDB1 باستخدام نظام الفحص التحليلي المنقسم

There is an urgent need for novel therapeutic agents for hepatitis B virus (HBV) infection. Although currently available nucleos(t)ide analogs potently ...

Quantification of Optic Nerve Cross Sectional Area on MRI: A Novel Protocol using Fiji Software

Optic nerve assessment is an important aspect of glaucoma diagnosis and follow-up. This project describes a protocol for a unified methodology of optic nerve cross-sectional assessment and quantification using 3 T MRI for image acquisition and ImageJ's Fiji software for image processing quantification. Image acquisition was performed using 3 T MRI, with proper instructions for the patient to ensure straight fixation during imaging. A T2-weighted fat suppressed sequence was used. A coronal cut taken 3 mm behind the globe and perpendicular to the optic nerve axis should be uploaded to the software. Using the threshold function, the white matter area of the optic nerve is selected and quantified, thus, eliminating inter-individual measurement bias. We also described the normal limits for the optic nerve cross-sectional area according to age, based on previously published literature. We used the described protocol to assess optic nerve of a suspected glaucoma patient. The optic nerve cross-sectional area was found to be within the normal limits, a finding further confirmed via optical coherence tomography of the optic nerve.

We provided a detailed protocol for a standardized method of optic nerve assessment and quantification using MRI, utilizing a widely available imaging sequence, and open access software for image analysis. Following this standardized protocol would provide meaningful data for comparison between different patients and different studies.

القياس الكمي لمنطقة الأعصاب البصرية العرضية على التصوير بالرنين المغناطيسي: بروتوكول جديد باستخدام برامج فيجي

Optic nerve assessment is an important aspect of glaucoma diagnosis and follow-up. This project describes a protocol for a unified methodology of optic ...

A Real-World High-Intensity Interval Training Protocol for Cardiorespiratory Fitness Improvement

High-Intensity Interval Training (HIIT) has emerged as an interesting time-efficient approach to increase exercise adherence and improve health. However, few studies have tested the efficiency of HIIT protocols in a &#34;real world&#34; setting, e.g., HIIT protocols designed for outdoor spaces without specialized equipment. This study presents a &#34;real world&#34; training protocol, named &#34;beep training&#34;, and compares the efficiency of a HIIT regiment versus a traditional long-duration Moderate-Intensity Continuous Training (MICT) regiment using this beep training protocol on VO2 max of overweight untrained men. Twenty-two subjects performed outdoor running with MICT (n = 11) or HIIT (n = 11). Cardiorespiratory fitness was assessed before and after training protocols using a metabolic analyzer. Both training protocols were performed 3 days a week for 8 weeks using the Beep Test results. The MICT group performed the exercise program at 60%-75% of the maximum speed of the 20 m shuttle test (Vmax) and with a progression of the distance of 3,500-5,000 m. The HIIT group performed the interval exercise with 7-10 bouts of 200 m at 85%-100% of the maximum speed of the 20 m shuttle test (Vmax), interspersed with 1 min of passive recovery. Although the HIIT group presented a significantly lower training volume than the MICT group (p &#60; 0.05) after 8 weeks of beep training, HIIT was superior to MICT in improving VO2 max (MICT: ~4.1%; HIIT: ~7.3%; p &#60; 0.05). The &#34;real world&#34; HIIT regiment based on beep training protocol is a time-efficient, low-cost, and easy-to-implement protocol for overweight untrained men.

This study presents a low-cost and easy-to-implement "real world" high-intensity interval training (HIIT) protocol for scientific research and discusses its efficiency for cardiorespiratory fitness.

بروتوكول تدريب فتري عالي الكثافة في العالم الحقيقي لتحسين اللياقة القلبية التنفسية

High-Intensity Interval Training (HIIT) has emerged as an interesting time-efficient approach to increase exercise adherence and improve health. However, ...

Network Pharmacology Prediction and Metabolomics Validation of the Mechanism of Fructus Phyllanthi against Hyperlipidemia

Hyperlipidemia has become a leading risk factor for cardiovascular diseases and liver injury worldwide. Fructus Phyllanthi (FP) is an effective drug against hyperlipidemia in Traditional Chinese Medicine (TCM) and Indian Medicine theories, however the potential mechanism requires further exploration. The present research aims to reveal the mechanism of FP against hyperlipidemia based on an integrated strategy combining network pharmacology prediction with metabolomics validation. A high-fat diet (HFD)-induced mice model was established by evaluating the plasma lipid levels, including total cholesterol (TC), triglyceride (TG), low-density lipoprotein cholesterol (LDL-C), and high-density lipoprotein cholesterol (HDL-C). Network pharmacology was applied to find out the active ingredients of FP and potential targets against hyperlipidemia. Metabolomics of plasma and liver were performed to identify differential metabolites and their corresponding pathways among the normal group, model group, and intervention group. The relationship between network pharmacology and metabolomics was further constructed to obtain a comprehensive view of the process of FP against hyperlipidemia. The obtained key target proteins were verified by molecular docking. These results reflected that FP improved the plasma lipid levels and liver injury of hyperlipidemia induced by a HFD. Gallic acid, quercetin, and beta-sitosterol in FP were demonstrated as the key active compounds. A total of 16 and six potential differential metabolites in plasma and liver, respectively, were found to be involved in the therapeutic effects of FP against hyperlipidemia by metabolomics. Further, integration analysis indicated that the intervention effects were associated with CYP1A1, AChE, and MGAM, as well as the adjustment of L-kynurenine, corticosterone, acetylcholine, and raffinose, mainly involving tryptophan metabolism pathway. Molecular docking ensured that the above ingredients acting on hyperlipidemia-related protein targets played a key role in lowering lipids. In summary, this research provided a new possibility for preventing and treating hyperlipidemia.

The present protocol describes an integrated strategy for exploring the key targets and mechanisms of Fructus Phyllanthi against hyperlipidemia based on network pharmacology prediction and metabolomics verification.

التنبؤ بعلم الأدوية الشبكي والتحقق من صحة الأيض لآلية Fructus Phyllanthi ضد فرط شحميات الدم

Hyperlipidemia has become a leading risk factor for cardiovascular diseases and liver injury worldwide. Fructus Phyllanthi (FP) is an effective drug ...

اكتشاف العلامات الحيوية غير الغازية للبروتينات المسيل للدموع باستخدام LC-MS

A Protein Suspension-Trapping Sample Preparation for Tear Proteomics by Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

Tear fluid is one of the easily accessible biofluids that can be collected non-invasively. Tear proteomics has the potential to discover biomarkers for several ocular diseases and conditions. The suspension trapping column has been reported to be an efficient and user-friendly sample preparation workflow for the broad application of downstream proteomic analysis. Yet, this strategy has not been well-studied in the analysis of human tear proteome. The present protocol describes an integrated workflow from clinical human tear samples to purified peptides for non-invasive tear protein biomarker research using mass spectrometry, which provides insights into disease biomarkers and monitoring when combined with bioinformatics analysis. A protein suspension trapping sample preparation was applied and demonstrated the discovery of tear proteome with fast, reproducible, and user-friendly procedures, as a universal, optimized sample preparation for human tear fluid analysis. In particular, the suspension trapping procedure outperformed in-solution sample preparation in terms of peptide recovery, protein identification, and shorter sample preparation time.

تسليط الضوء على المؤلف: تطوير تحليل السائل المسيل للدموع باستخدام بروتوكول موحد لأبحاث البروتيوميات 

This protocol describes a method for collecting tear samples using Schirmer strips and an integrated quantitative workflow for discovering non-invasive tear protein biomarkers. The suspension trapping sample preparation workflow enables fast and robust tear sample preparation and mass spectrometric analysis, resulting in higher peptide recovery yields and protein identification than standard in-solution procedures.

تحضير عينة محاصرة بتعليق البروتين للبروتينات المسيل للدموع بواسطة الكروماتوغرافيا السائلة - قياس الطيف الكتلي الترادفي

Tear fluid is one of the easily accessible biofluids that can be collected non-invasively. Tear proteomics has the potential to discover biomarkers for ...