نشكر العلاقات العامة. برنار لا سكولا للحصول على النصائح التقنية مفيدة ومناقشة مثيرة للاهتمام على coculture amoebal وتخصيب amoebal. نشكر أيضا الدكتور فنسنت توماس لمساعدته في تنفيذ هذه التقنية في مختبرنا.

1. Amoebal Coculture 1.1 إعداد نموذج <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عينة بيئية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عينات المياه تحديد عينة المياه (500 مل إلى 1 لتر) من خلال 0.22 ميكرون حجم المسام الغشاء. ثم، ويهز الغشاء في الأميبا المالحة PAS المتوسطة صفحة في (120 ملغ من كلوريد الصوديوم، 4 ملغ من MgSO 4 • 7H 2 O، 4 ملغ من و CaCl 2 • 2H 2 O، 142 ملغ من الصوديوم 2 هبو 4، و 136 ملغ من KH 2 ص 4 في 1 لتر من الماء المقطر). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> العينات الصلبة في resuspend العينات الصلبة مثل التربة أو الرمل العينات وعينات شبه الصلبة مثل الحمأة المنشطة في الماء المقطر أو برنامج تلفزيوني وتصفية لهم من خلال 0.22 ميكرون حجم المسام الغشاء. ثم، ويهز الغشاء في نظام تقييم الأداء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عينات ملوثة للغاية مع الأميبات الذاتية والبروتوزوا أول الرواسب العينات بواسطة الطرد المركزي سرعة منخفضة (180 x ج) للص 10 دقيقة أو تصفية عليه من خلال 5 ميكرون حجم المسام الغشاء. مزيد من معالجة طاف (على التوالي رشاحة)، كما في 1.1.1. ملاحظة: يمكن استخدام تقنيات التطهير أخرى لمواصلة تطهير العينات البيئية: حرارة العينة في 50 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة أو علاج مع المحاليل الحمضية أو الأساسية 14. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عينة السريرية معالجة العينات السريرية اعتمادا على الخصائص الفيزيائية والكيميائية. تصفية الطرد المركزي أو سوائل لإزالة الشوائب الكبيرة. في resuspend العينات الصلبة. لاستخدام الأنسجة، وطحن لهم، على سبيل المثال باستخدام homogeneiser dounce أو الخرز الزجاجي، وليز الخلايا لتحرير البكتيريا داخل الخلايا. </li></ol> 1.2 إعداد الأميبات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد مرق إعداد وسائل الإعلام التالية: وسائل الإعلام الغنية التي تحتوي على ببتون، خلاصة الخميرة والجلوكوز (PYG و 100 غرام من ببتون البروتيوز، 10 غرام من خلاصة الخميرة، 4.9 غرام من MgSO 4 • 7H 2O، 5 غرام من سترات الصوديوم • 2H 2 O، 0.1 غرام من الحديد (NH 4) 2 (SO 4) 2 • 6H 2 O، 1.7 غرام من KH 2 PO 4، 1.97 غرام من نا 2 هبو 4 • 7H 2 O ، 45 غراما من الجلوكوز، و0.295 غرام من و CaCl 2 في 5 لتر من الماء المقطر) وسيلة غير الغذائية مثل PAS للأنواع الشوكميبة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ثقافة Amoebal <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> زراعة الأميبات (تفضيلي الشوكميبة castellanii آي تي سي سي 30010 أو A. polyphaga ينك-AP1) عند 25 درجة مئوية في قوارير زراعة الخلايا تحتوي على 30 مل من PYG المتوسط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حصاد الأميبات عن طريق هز قوية من القارورة وأجهزة الطرد المركزي تعليق خلية لمدة 10 دقيقة في 1،500 ز س. يغسل بيليه مرتين مع PAS المتوسط. عد الخلايا في شريحة كوفاتش وضبط مستوى الصوت للحصول على تعليق من 5 × 10 5 خلايا لكل مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل تعليق amoebal في microplates. استخدام 1 مل لكل بئر لمدة 12 - و 24 ثلوحات الذراع، 500 ميكرولتر لوحات 48 جيدا و 300 ميكرولتر لوحات 96 جيدا. احتضان صفيحة ميكروسكوبية لا يقل عن 2 ساعة على 25 درجة مئوية. وهذا يسمح الترسيب والتعلق من الأميبات إلى الجزء السفلي من كل بئر. </li></ol></li></ol> 1.3 Coculture <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عينة التلقيح <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطعيم لوحة من 2.3.3 مع التخفيفات التسلسلي للعينة من 1.1 أو 1.2، وعادة مع 10 أضعاف سلسلة التخفيف، بدءا من 100 ميكرولتر من العينة غير مخفف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي في صفيحة ميكروسكوبية 1،800 x ج لمدة 10 دقيقة على الرسوبيات في حديقة amoebal الكائنات الدقيقة يحتمل وجودها في العينة. وهذا يزيد من الاتصال والبلعمة من الكائنات الحية الدقيقة التي كتبها الأميبات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان لوحات لمدة 45 دقيقة عند 25 درجة مئوية ويغسل ثلاث مرات مع PAS عن طريق استبدال وسائل الإعلام مع PAS الطازجة. إضافة 1 مل لكل بئر من PAS مع أو بدون إضافة المضادات الحيوية (الستربتومايسين، البنسلين، جنتاميسين و / أو فانكومايسين)، اعتمادا على بكتيرياالأنواع آل التي يتم البحث عنها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان صفيحة ميكروسكوبية في 32 درجة مئوية في جو مرطب لتجنب تكيس من الأميبات. مراقبة كل بئر يوميا مع الهدف 20X للكشف عن وجود البكتيريا الغازية وlysing الأميبات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في حالة تحلل، نفذ ثقافة فرعية على الأميبات الطازجة، فحقن 100 ميكرولتر من cocultures لأحادي الطبقة من حوالي 10 الأميبات 5 / سم 2. لعزل تحديدا الأنواع البكتيرية معين، تطعيم أيضا وسائل الإعلام أجار محددة مصممة لهذه البكتيريا (أي BCYE أجار لالفيلقيات). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في غياب تحلل، واتخاذ 100 ميكرولتر من cocultures بعد 4-7 أيام من التلقيح الأول وتطعيم ثقافة amoebal جديدة من 900 ميكرولتر في 24 لوحة جيدا. إذا لوحظ تحلل السريع لالأميبات دون انتشار البكتيريا، قد يكون الفيروس الحالي. في هذه الحالة، تحديد طاف عند 0.22 ميكرون واستخدام التعليق تصفيتها لتصيب الأميبات الطازجة. </li></رأ&gt; </li></ol> 1.4 العزلة البكتيرية وتوصيف <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تلطيخ البكتيرية أداء cocultures مباشرة على coverslips الزجاج في 24 microplates جيدا. إزالة المتوسطة وأداء تلطيخ أو المناعي. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعديل Romanowsky تلطيخ <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> السماح للساترة الجافة. تزج ساترة خمس مرات في الحل تثبيتي (2 ملغم / لتر سريعة الخضراء في الميثانول). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تزج ساترة خمس مرات في حل تلطيخ الأول (1.22 ز / L G صبغة فوسفورية حمراء في الفوسفات العازلة درجة الحموضة 6.6) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أخيرا، تزج ساترة 5 مرات في حل تلطيخ الثاني (1.1 غرام / لتر thiazine في الفوسفات العازلة درجة الحموضة 6.6). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شطف العينة مع الماء المقطر. اسمحوا الجافة ونلاحظ بواسطة المجهر. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تسيل Neelsen تلطيخ <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> السماح للساترة الجافة. تغطية العينة مع تسيل فوكسين. حرارة الصبغة بلهب حتى تظهر الأبخرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بارد في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق على الأقلوشطف مع الماء المقطر. تغطية العينة مع 3٪ من محلول حمض الهيدروكلوريك في الأيزوبروبانول لمدة 2 دقيقة ويشطف بالماء المقطر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغطية لمدة 30 ثانية مع الميثيلين الأزرق وشطف مع الماء المقطر. اسمحوا الجافة ونلاحظ بواسطة المجهر 22. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جيمينيز تلطيخ <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد محلول المخزون فوكسين الأساسية عن طريق خلط 100 مل من فوكسين الأساسية بنسبة 10٪ (10 غرام من فوكسين الأساسية في 100 مل 95٪ من الإيثانول)، 250 مل من 4٪ الفينول المائي و 650 مل من الماء المقطر. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 48 ساعة قبل الاستخدام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> السماح للساترة الجافة وإصلاح بتمريرها من خلال اللهب. تغطية العينة مع تصفيتها حديثا فوكسين الأساسية (4 مل من محلول المخزون الأساسية فوكسين في 10 مل من 0.1 M العازلة فوسفات الصوديوم، ودرجة الحموضة 7.45) لمدة 2 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شطف العينة مع الماء واحتضان باللون الأخضر المرمر (0.8٪ في الماء المقطر) لمدة 10 ثانية. شطف مع الماء مرة أخرى وكرر تلطيخ المسرطنة. شطف مرة أخرى بالماء. السماح للساترة الجافة، مount ذلك، ونلاحظ بواسطة المجهر 23. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المناعي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إصلاح ساترة التي يحتضنها في الميثانول لمدة 5 دقائق أو مع بارافورمالدهيد 4٪ لمدة 10 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يغسل ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني واحتضان لمدة 2 ساعة في عرقلة الحل (5٪ BSA، 0.1٪ سابونين في برنامج تلفزيوني) في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان ساترة لمدة 1 ساعة في عرقلة الحل تحتوي على الأجسام المضادة التي أثيرت ضد الكائنات الحية الدقيقة في المصالح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يغسل مرة أخرى ثلاث مرات في برنامج تلفزيوني واحتضان لمدة 1 ساعة مع الأجسام المضادة الثانوية الموجهة ضد الأجسام المضادة الأولية وربطها fluorophore. يغسل ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني، جبل ساترة ونلاحظ بواسطة المجهر مضان. </li></ol></li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الكشف عن الحمض النووي عن طريق PCR استخراج الحمض النووي من 100 إلى 200 ميكرولتر من coculture amoebal. الكشف عن الكائنات الدقيقة مع الاشعال عالمية تستهدف الجينات 16S الرنا الريباسي أو الاشعال محددة للأنواع ذات الأهمية مثل المتفطرات 24<html> ، الليجيونيلا 25 أو 26 أعضاء المتدثراوات. </li></ol> 2. الإثراء Amoebal 2.1. إعداد نموذج في resuspend العينات الصلبة وشبه الصلبة في نظام تقييم الأداء من قبل vortexing. الطرد المركزي تعليق على سرعة منخفضة (180 x ج) لمدة 10 دقيقة. وهذا يسمح إثراء الأميبات حرة المعيشة في بيليه. طاف يمكن استخدامها لcoculture amoebal وبيليه لتخصيب amoebal 21. 2.2. إعداد المتوسطة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 1.5 غرام من أجار إلى 100 مل من PAS والأوتوكلاف المتوسط ​​15 دقيقة في 121 درجة مئوية. صب المتوسطة الدافئة في أطباق بتري، والسماح يصلب في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنمو القولونية (آي تي سي سي 25922) في مرق LB أو thioglycolate بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية. يغسل البكتيريا مرتين مع برنامج تلفزيوني و resuspend لهم في PAS المتوسط. تمييع 10X في PAS وتنتشر 2-3 مل من هذا التخفيف على لوحة PAS أجار واسمحوا الجافة. </li></ol>الحمار = &quot;jove_step&quot;&gt; 2.3. عينة التلقيح إضافة قطرة من العينة (أو قطعة من فلتر) على جانب واحد من لوحة والسماح لها بالتدفق على طبق بيتري لتشكيل خط في وسط الطبق. 2.4. النمو Amoebal وثقافة فرعية amoebal <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مراقبة طبق بيتري اليومية. إذا تم الكشف عن جبهة الهجرة amoebal، قطع قطعة صغيرة من أجار في الجبهة الهجرة وتطعيم طبق بتري NNA الطازجة مغطاة حشيش E. القولونية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تكرار إعادة التلقيح عدة مرات تبعا لنقاء العينة، من أجل الحصول على ثقافة نقية من سلالة amoebal معين. </li></ol> 2.5. الأميبات والبكتيريا توصيف <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تتخلص الخلايا و resuspend لهم في نظام تقييم الأداء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخراج الحمض النووي وتحديد هوية الأميبات و / أو endosymbionts البكتيرية بواسطة PCR والتسلسل (16S الرنا الريباسي التضخيم للبكتيريا، التركيب. 18S الرنا الريباسي لالأميبات وتسلسلها، على سبيل المثال). </li> &lt;لى&gt; استخدام هذه الخلايا في كشط PAS لتطعيم الأميبات الطازجة وإجراء coculture amoebal للكشف عن البكتيريا ربما موجودة في العينة. </li></ol>

<ol>
	<li>Fraser, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Legionnaires'+disease:+description+of+an+epidemic+of+pneumonia.">Legionnaires' disease: description of an epidemic of pneumonia.</a> New Engl. J. Med. 297, 1189-1197 (1977).</li><li>McDade, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Legionnaires'+disease:+isolation+of+a+bacterium+and+demonstration+of+its+role+in+other+respiratory+disease.">Legionnaires' disease: isolation of a bacterium and demonstration of its role in other respiratory disease.</a> New Engl. J. Med. 297, 1197-1203 (1977).</li><li>Rowbotham, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preliminary+report+on+the+pathogenicity+of+Legionella+pneumophila+for+freshwater+and+soil+amoebae.">Preliminary report on the pathogenicity of Legionella pneumophila for freshwater and soil amoebae.</a> J. Clin. Pathol. 33, 1179-1183 (1980).</li><li>Rodriguez-Zaragoza, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ecology+of+free-living+amoebae.">Ecology of free-living amoebae.</a> Crit. Rev. Microbiol. 20, 225-241 (1994).</li><li>Booton, G. C., Visvesvara, G. S., Byers, T. J., Kelly, D. J., Fuerst, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+distribution+of+Acanthamoeba+species+genotypes+associated+with+nonkeratitis+infections.">Identification and distribution of Acanthamoeba species genotypes associated with nonkeratitis infections.</a> J Clin. Microbiol. 43, 1689-1693 (2005).</li><li>Brussow, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacteria+between+protists+and+phages:+from+antipredation+strategies+to+the+evolution+of+pathogenicity.">Bacteria between protists and phages: from antipredation strategies to the evolution of pathogenicity.</a> Molecular microbiology. 65, 583-589 (2007).</li><li>Greub, G., Raoult, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microorganisms+resistant+to+free-living+amoebae.">Microorganisms resistant to free-living amoebae.</a> Clin. Microbiol. Rev. 17, 413-433 (2004).</li><li>Thomas, V., McDonnell, G., Denyer, S. P., Maillard, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Free-living+amoebae+and+their+intracellular+pathogenic+microorganisms:+risks+for+water+quality.">Free-living amoebae and their intracellular pathogenic microorganisms: risks for water quality.</a> FEMS Microbiol Rev. 34, 231-259 (2010).</li><li>Birtles, R. J., Rowbotham, T. J., Storey, C., Marrie, T. J., Raoult, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chlamydia-like+obligate+parasite+of+free-living+amoebae.">Chlamydia-like obligate parasite of free-living amoebae.</a> Lancet. 349, 925-926 (1997).</li><li>Amann, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obligate+intracellular+bacterial+parasites+of+acanthamoebae+related+to+Chlamydia+spp.">Obligate intracellular bacterial parasites of acanthamoebae related to Chlamydia spp.</a> Appl. Environ. Microbiol. 63, 115-121 (1997).</li><li>Birtles, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Candidatus+Odyssella+thessalonicensis'+gen.+nov.,+sp.+nov.,+an+obligate+intracellular+parasite+of+Acanthamoeba+species.">Candidatus Odyssella thessalonicensis' gen. nov., sp. nov., an obligate intracellular parasite of Acanthamoeba species.</a> Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 50, 63-72 (2000).</li><li>Thomas, V., Casson, N., Greub, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Criblamydia+sequanensis,+a+new+intracellular+Chlamydiales+isolated+from+Seine+river+water+using+amoebal+co-culture.">Criblamydia sequanensis, a new intracellular Chlamydiales isolated from Seine river water using amoebal co-culture.</a> Environ. Microbiol. 8, 2125-2135 (2006).</li><li>Pagnier, I., Raoult, D., La Scola, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+identification+of+amoeba-resisting+bacteria+from+water+in+human+environment+by+using+an+Acanthamoeba+polyphaga+co-culture+procedure.">Isolation and identification of amoeba-resisting bacteria from water in human environment by using an Acanthamoeba polyphaga co-culture procedure.</a> Environ. Microbiol. 10, 1135-1144 (2008).</li><li>Thomas, V., Loret, J. F., Jousset, M., Greub, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biodiversity+of+amoebae+and+amoebae-resisting+bacteria+in+a+drinking+water+treatment+plant.">Biodiversity of amoebae and amoebae-resisting bacteria in a drinking water treatment plant.</a> Environ. Microbiol. 10, 2728-2745 (2008).</li><li>Corsaro, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+Chlamydiales+strains+isolated+from+a+water+treatment+plant.">Novel Chlamydiales strains isolated from a water treatment plant.</a> Environ. Microbiol. 11, 188-200 (2009).</li><li>Goy, G., Croxatto, A., Greub, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Waddlia+chondrophila+enters+and+multiplies+within+human+macrophages.">Waddlia chondrophila enters and multiplies within human macrophages.</a> Microbes Infect. 10, 556-562 (2008).</li><li>Kebbi-Beghdadi, C., Cisse, O., Greub, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Permissivity+of+Vero+cells,+human+pneumocytes+and+human+endometrial+cells+to+Waddlia+chondrophila.">Permissivity of Vero cells, human pneumocytes and human endometrial cells to Waddlia chondrophila.</a> Microbes Infect. 13, 566-574 (2011).</li><li>Kebbi-Beghdadi, C., Batista, C., Greub, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Permissivity+of+fish+cell+lines+to+three+Chlamydia-related+bacteria:+Waddlia+chondrophila,+Estrella+lausannensis+and+Parachlamydia+acanthamoebae.">Permissivity of fish cell lines to three Chlamydia-related bacteria: Waddlia chondrophila, Estrella lausannensis and Parachlamydia acanthamoebae.</a> FEMS Immunol. Med. Microbiol. 63, 339-345 (2011).</li><li>Fry, N. K., Rowbotham, T. J., Saunders, N. A., Embley, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+amplification+and+sequencing+of+the+16S+ribosomal+DNA+of+an+intracellular+Legionella+species+recovered+by+amoebal+enrichment+from+the+sputum+of+a+patient+with+pneumonia.">Direct amplification and sequencing of the 16S ribosomal DNA of an intracellular Legionella species recovered by amoebal enrichment from the sputum of a patient with pneumonia.</a> FEMS Microbiol. Lett. 67, 165-168 (1991).</li><li>Rowbotham, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+Legionella+pneumophila+serogroup+1+from+human+feces+with+use+of+amebic+cocultures.">Isolation of Legionella pneumophila serogroup 1 from human feces with use of amebic cocultures.</a> Clin. Infect. Dis. 26, 502-503 (1998).</li><li>Greub, G., La Scola, B., Raoult, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amoebae-resisting+bacteria+isolated+from+human+nasal+swabs+by+amoebal+coculture.">Amoebae-resisting bacteria isolated from human nasal swabs by amoebal coculture.</a> Emerging Infect. Dis. 10, 470-477 (2004).</li><li>Isenberg, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Clinical microbiology procedures handbook. , (1992).</li><li>Gimenez, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staining+Rickettsiae+in+Yolk-Sac+Cultures.">Staining Rickettsiae in Yolk-Sac Cultures.</a> Stain Technol. 39, 135-140 (1964).</li><li>Thomas, V., Herrera-Rimann, K., Blanc, D. S., Greub, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biodiversity+of+amoebae+and+amoeba-resisting+bacteria+in+a+hospital+water+network.">Biodiversity of amoebae and amoeba-resisting bacteria in a hospital water network.</a> Appl. Environ. Microbiol. 72, 2428-2438 (2006).</li><li>Miyamoto, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+new+seminested+PCR+method+for+detection+of+Legionella+species+and+its+application+to+surveillance+of+legionellae+in+hospital+cooling+tower+water.">Development of a new seminested PCR method for detection of Legionella species and its application to surveillance of legionellae in hospital cooling tower water.</a> Appl. Environ. Microbiol. 63, 2489-2494 (1997).</li><li>Lienard, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+new+chlamydiales-specific+real-time+PCR+and+its+application+to+respiratory+clinical+samples.">Development of a new chlamydiales-specific real-time PCR and its application to respiratory clinical samples.</a> J. Clin. Microbiol. 49, 2637-2642 (2011).</li><li>Wang, Y., Ogawa, M., Fukuda, K., Miyamoto, H., Taniguchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+identification+of+mycobacteria+from+soils+at+an+illegal+dumping+site+and+landfills+in+Japan.">Isolation and identification of mycobacteria from soils at an illegal dumping site and landfills in Japan.</a> Microbiol. Immunol. 50, 513-524 (2006).</li><li>Corsaro, D., Pages, G. S., Catalan, V., Loret, J. F., Greub, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biodiversity+of+amoebae+and+amoeba-associated+bacteria+in+water+treatment+plants.">Biodiversity of amoebae and amoeba-associated bacteria in water treatment plants.</a> Int. J. Hygiene Environ. Health. 213, 158-166 (2010).</li><li>La Scola, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Legionella+drancourtii+sp.+nov.,+a+strictly+intracellular+amoebal+pathogen.">Legionella drancourtii sp. nov., a strictly intracellular amoebal pathogen.</a> Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 54, 699-703 (2004).</li><li>Thomas, V., Casson, N., Greub, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+Afipia+and+Bosea+strains+isolated+from+various+water+sources+by+amoebal+co-culture.">New Afipia and Bosea strains isolated from various water sources by amoebal co-culture.</a> Syst. Appl. Microbiol. 30, 572-579 (2007).</li><li>La Scola, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amoeba-resisting+bacteria+and+ventilator-associated+pneumonia.">Amoeba-resisting bacteria and ventilator-associated pneumonia.</a> Emerging Infect. Dis. 9, 815-821 (2003).</li><li>Collingro, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recovery+of+an+environmental+Chlamydia+strain+from+activated+sludge+by+co-cultivation+with+Acanthamoeba+sp.">Recovery of an environmental Chlamydia strain from activated sludge by co-cultivation with Acanthamoeba sp.</a> Microbiology. 151, 301-309 (2005).</li><li>Lienard, J., Croxatto, A., Prod'hom, G., Greub, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estrella+lausannensis,+a+new+star+in+the+Chlamydiales+order.">Estrella lausannensis, a new star in the Chlamydiales order.</a> Microbes Infect. 13, 1232-1241 (2011).</li><li>La Scola, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+giant+virus+in+amoebae.">A giant virus in amoebae.</a> Science. 299, 2033 (2003).</li><li>Boyer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Giant+Marseillevirus+highlights+the+role+of+amoebae+as+a+melting+pot+in+emergence+of+chimeric+microorganisms.">Giant Marseillevirus highlights the role of amoebae as a melting pot in emergence of chimeric microorganisms.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 21848-21853 (2009).</li><li>Thomas, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lausannevirus,+a+giant+amoebal+virus+encoding+histone+doublets.">Lausannevirus, a giant amoebal virus encoding histone doublets.</a> Environ. Microbiol. 13, 1454-1466 (2011).</li><li>Raoult, D., Renesto, P., Brouqui, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laboratory+infection+of+a+technician+by+mimivirus.">Laboratory infection of a technician by mimivirus.</a> Ann. Internal Med. 144, 702-703 (2006).</li><li>Greub, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parachlamydia+acanthamoebae,+an+emerging+agent+of+pneumonia.">Parachlamydia acanthamoebae, an emerging agent of pneumonia.</a> Clin. Microbiol. Infect. 15, 18-28 (2009).</li><li>Lamoth, F., Greub, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amoebal+pathogens+as+emerging+causal+agents+of+pneumonia.">Amoebal pathogens as emerging causal agents of pneumonia.</a> FEMS Microbiol. Rev. 34, 260-280 (2010).</li><li>Lienard, J. G., Ashbolt, K., Sen, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ch.+6.">Ch. 6.</a> Environmental microbiology, current technology and water applications. , 143-162 (2011).</li><li>Boughalmi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+isolation+of+giant+viruses+of+the+Mimiviridae+and+Marseilleviridae+families+in+the+Tunisian+environment.">High-throughput isolation of giant viruses of the Mimiviridae and Marseilleviridae families in the Tunisian environment.</a> Environ. Microbiol. , (2012).</li><li>Ovrutsky, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cooccurrence+of+Free-Living+Amoebae+and+Nontuberculous+Mycobacteria+in+Hospital+Water+Networks,+and+Preferential+Growth+of+Mycobacterium+avium+in+Acanthamoeba+lenticulata.">Cooccurrence of Free-Living Amoebae and Nontuberculous Mycobacteria in Hospital Water Networks, and Preferential Growth of Mycobacterium avium in Acanthamoeba lenticulata.</a> Appl. Environ. Microbiol. 79, 3185-3192 (2013).</li></ol>

يعلن الكتاب أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.

coculture Amoebal وتخصيب amoebal طرق فعالة التي سمحت للعزل العديد من الأنواع البكتيرية وamoebal جديدة. النتائج التي تم الحصول عليها مع هذه الأساليب تؤكد وجود في كل مكان من كلا الأميبات والبكتيريا مقاومة الأميبا في البيئة، وهذا هو الأكثر أهمية في شبكات المياه من صنع الإنسان التي تع?...

قبل ظهور التشخيص الجزيئي، والكائنات الدقيقة الموجودة في محاريب البيئية أو في العينات السريرية في كثير من الأحيان الكشف عنها من قبل زراعتها على وسائل الإعلام الانتقائي مختلفة، وذلك أساسا على أجار في أطباق بتري. النمط الظاهري من المستعمرات البكتيرية ونشاطهم الأيضية ثم سمح تصنيف البكتيريا على مستوى الأنواع. ويمكن أيضا أن تستخدم مرق لزيادة حساسية الكشف. ومع ذلك، كل التقنيات لا تسمح الانتعاش من البكتيريا التي تنمو ببطء أو لا على الاطلاق على هذه الوسائط. هذا هو السبب وتستخدم على نطاق واسع النهج الجزيئية في الوقت الحاضر. ومع ذلك، والكشف عن الحمض النووي لا يقدم أي دليل على بقاء البكتيريا. علاوة على ذلك، على العكس من الثقافة، والنهج الجزيئية لا يؤدي إلى سلالة يمكن أن تكون كذلك تتميز. دراسة مسببات الأمراض التي تنمو بشكل سيئ على وسائل الاعلام الصلبة أو أن الخلايا تنمو الحاجة إلى معقد. معظم هذه &quot;من الصعب أن تنمو البكتيريا&quot; هي INTR الحساسيةالبكتيريا ديكي، وكثيرا ما اكتشف وتتميز التالية تفشي كبيرة كما كان الحال بالنسبة لالمستروحة البكتيريا. وقد تميزت هذه البكتيريا التالية تفشى التي وقعت خلال اتفاقية الفيلق الاميركي. أصيب ما لا يقل عن 182 شخصا وتوفي 29 بسبب التهاب رئوي حاد 1،2. وقد تجلى لاحقا أن الأميبات كانت الحاضن الطبيعي لهذه البكتيريا والتي كان وجودها في شبكات الفنادق نظام تكييف الهواء والماء في أصل اندلاع مرض ما يسمى الجندي 3. الأميبات موجودة في جميع أنحاء العالم وكانت معزولة من التربة والهواء والماء والغشاء المخاطي للأنف من متطوعين من البشر (مراجعة في 4). هذه الأميبات &quot;حرة المعيشة&quot; يتم تقسيم عموما بشكل مستقل في البيئة ولكن في بعض الأحيان قد تغزو المضيفين متساهلة 5. تغذية الأميبات على مختلف الكائنات الدقيقة من خلال البلعمة واللاحقة الليزوزومية الهضم بواسطة HYdrolases 6. العديد من أنواع البكتيريا داخل الخلايا الاختيارية أو تلزم هي قادرة على مقاومة عملية الهضم، وبالتالي تصيب وتقسيم في الأميبات على سبيل المثال البكتيريا أو المتفطرات المرتبطة الكلاميديا ​​البكتيريا، (مراجعة في 7 و 8). الأميبات حرة المعيشة المرجح تمثل الخزان المحتملة الهامة للبكتيريا داخل الخلايا التي تم اكتشافها حتى الآن لا. قاد هذه المجموعة جهدنا لتنفيذها في لوزان اثنين من التقنيات الرئيسية، ودعا coculture amoebal وتخصيب amoebal، مما سمح مجموعات مختلفة لعزل الكائنات الدقيقة العديد من الخلايا تلزم جديدة من العينات البيئية المختلفة 9-15. منذ الأميبات هي البالعات المهنية الرعي على البكتيريا، قد بكتيريا قادرة على مقاومة البلعمة وتنمو داخل هذه الأولانيات أيضا استعمار البالعات الإنسان وتكون الممرضة تجاه البشر. وقد تجلى هذا بشكل جزئي لبعض أنواع البكتيريا المرتبطة الكلاميديا، مثل Waddlia تشوndrophila. دبليو chondrophila يمكن أن تنمو، ليس فقط في الأميبات ولكن أيضا في العديد من أنواع الخلايا مثل الخلايا الظهارية الثديية، الضامة، وخطوط الخلايا الأسماك 16-18. يظهر coculture amoebal أيضا ذات الصلة للكشف عن البكتيريا داخل الخلايا في العينات السريرية 19،20، بما في ذلك البراز التي تكون ملوثة بشكل كبير مع الأنواع البكتيرية المختلفة 21. نحن هنا وصف الخطوات الرئيسية لcoculture amoebal وتخصيب amoebal، بما في ذلك (أ) معاملة العينات البيئية أو السريرية، (ب) نمو الأميبات على وسائل الإعلام وممحوضة على العشب البكتيريا القولونية و (ج) اختيار وتوصيف من البكتيريا داخل الخلايا.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Reagent/ Equipment</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose monohydrate</td>
			<td>Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td>108342</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 &#956;m pore size membrane</td>
			<td>Merck Millipore, Darmstadt, Germany</td>
			<td>SCVPU11RE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>proteose peptone</td>
			<td>Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ</td>
			<td>211693</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>yeast extract</td>
			<td>Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ</td>
			<td>212750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture flasks</td>
			<td>Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ</td>
			<td>353135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kova slide</td>
			<td>Hycor, Indianapolis, IN</td>
			<td>87144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cell culture microplates</td>
			<td>Corning Inc, Corning, NY</td>
			<td>3524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diff-Quik staining kit</td>
			<td>Siemens Healthcare diagn., Munich, Germany</td>
			<td>130832</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ziehl fuchsin</td>
			<td>Fluka, St-Louis, MI</td>
			<td>21820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>basic fuchsin</td>
			<td>Sigma, St-Louis, MI</td>
			<td>857843</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol</td>
			<td>Sigma, St-Louis, MI</td>
			<td>P1037</td>
			<td>Corrosive and mutagenic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>malachite green oxalate</td>
			<td>Fluka, St-Louis, MI</td>
			<td>63160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde 16% solution</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA</td>
			<td>15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saponin</td>
			<td>Sigma, St-Louis, MI</td>
			<td>84510</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

discovery of new intracellular pathogens by amoebal coculture and amoebal enrichment approaches

مسببات الأمراض مثل البكتيريا داخل الخلايا، المتفطرات والكائنات الحية مثل الكلاميديا ​​يصعب عزل لأنهم غالبا ما تنمو بشكل سيئ أو لا على الاطلاق على وسائل الإعلام الانتقائي الذي عادة ما تستخدم لزراعة البكتيريا. لهذا السبب، تم اكتشاف العديد من هذه الجراثيم إلا في الآونة الأخيرة أو في أعقاب تفشي الهامة. غالبا ما ترتبط هذه الجراثيم مع الأميبات، والتي تكون بمثابة خلايا المضيف والسماح للبقاء ونمو البكتيريا. نعتزم هنا لتقديم مظاهرة من اثنين من التقنيات التي تسمح العزلة وتوصيف مسببات الأمراض داخل الخلايا الموجودة في العينات السريرية أو البيئية: وcoculture amoebal وتخصيب amoebal. coculture Amoebal يسمح الانتعاش من البكتيريا داخل الخلايا، فحقن العينة على التحقيق في الحديقة amoebal التي يمكن أن تكون مصابة و lysed من البكتيريا داخل الخلايا الموجودة في العينة. يسمح تخصيب Amoebal استرداد الأميبات موجودة في عينة سريرية أو البيئية. الويمكن أن يؤدي إلى اكتشاف أنواع جديدة amoebal ولكن أيضا من البكتيريا داخل الخلايا الجديدة المتنامية على وجه التحديد في هذه الأميبات. معا، وهذه التقنيات اثنين تساعد على اكتشاف البكتيريا داخل الخلايا الجديدة قادرة على النمو في الأميبات. نظرا لقدرتها على إصابة الأميبات ومقاومة البلعمة، قد هذه البكتيريا داخل الخلايا أيضا الهروب البلعمة التي الضامة، وبالتالي، تكون الممرضة لحقيقيات النوى أعلى.

<html> باستخدام coculture amoebal وتخصيب amoebal، مجموعة كاملة من البكتيريا البيئية و / أو المسببة للأمراض تم اكتشاف (الجدول 1). وقد استخدم coculture Amoebal لدينا مجموعة وغيرها لتحليل العينات البيئية، ومحطات معالجة المياه وشبكات توزيع المياه....

Watch this Scientific Journal Video about Discovery of New Intracellular Pathogens by Amoebal Coculture and Amoebal Enrichment Approaches at JoVE.com

Discovery of New Intracellular Pathogens by Amoebal Coculture and Amoebal Enrichment Approaches

coculture Amoebal هو نظام زراعة الخلايا باستخدام الأميبات تمسكا تنمو بشكل انتقائي مسببات الأمراض داخل الخلايا قادرة على مقاومة الخلايا البلعمية مثل الأميبات والضامة. وبالتالي فإنه يمثل أداة رئيسية لاكتشاف العوامل المعدية الجديدة. تخصيب Amoebal يسمح اكتشاف الأنواع الجديدة وamoebal من البكتيريا داخل الخلايا الخاصة.

اكتشاف جديد بين الخلايا مسببات الأمراض عن طريق Amoebal Coculture والمناهج Amoebal التخصيب

Intracellular pathogens such as legionella, mycobacteria and Chlamydia-like organisms are difficult to isolate because they often grow poorly or not at ...

discovery-new-intracellular-pathogens-amoebal-coculture-amoebal

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

14.4K Views.  University Hospital Center and University of Lausanne.  coculture Amoebal هو نظام زراعة الخلايا باستخدام الأميبات تمسكا تنمو بشكل انتقائي مسببات الأمراض داخل الخلايا قادرة على مقاومة الخلايا البلعمية مثل الأميبات والضامة. وبالتالي فإنه يمثل أداة رئيسية لاكتشاف العوامل المعدية الجديدة. تخصيب Amoebal يسم?...

Video: Discovery of New Intracellular Pathogens by Amoebal Coculture and Amoebal Enrichment Approaches

Infection of Zebrafish Embryos with Intracellular Bacterial Pathogens

Zebrafish (Danio rerio) embryos are increasingly used as a model for studying the function of the vertebrate innate immune system in host-pathogen interactions 1. The major cell types of the innate immune system, macrophages and neutrophils, develop during the first days of embryogenesis prior to the maturation of lymphocytes that are required for adaptive immune responses. The ease of obtaining large numbers of embryos, their accessibility due to external development, the optical transparency of embryonic and larval stages, a wide range of genetic tools, extensive mutant resources and collections of transgenic reporter lines, all add to the versatility of the zebrafish model. Salmonella enterica serovar Typhimurium (S. typhimurium) and Mycobacterium marinum can reside intracellularly in macrophages and are frequently used to study host-pathogen interactions in zebrafish embryos. The infection processes of these two bacterial pathogens are interesting to compare because S. typhimurium infection is acute and lethal within one day, whereas M. marinum infection is chronic and can be imaged up to the larval stage 2, 3. The site of micro-injection of bacteria into the embryo (Figure 1) determines whether the infection will rapidly become systemic or will initially remain localized. A rapid systemic infection can be established by micro-injecting bacteria directly into the blood circulation via the caudal vein at the posterior blood island or via the Duct of Cuvier, a wide circulation channel on the yolk sac connecting the heart to the trunk vasculature. At 1 dpf, when embryos at this stage have phagocytically active macrophages but neutrophils have not yet matured, injecting into the blood island is preferred. For injections at 2-3 dpf, when embryos also have developed functional (myeloperoxidase-producing) neutrophils, the Duct of Cuvier is preferred as the injection site. To study directed migration of myeloid cells towards local infections, bacteria can be injected into the tail muscle, otic vesicle, or hindbrain ventricle 4-6. In addition, the notochord, a structure that appears to be normally inaccessible to myeloid cells, is highly susceptible to local infection 7. A useful alternative for high-throughput applications is the injection of bacteria into the yolk of embryos within the first hours after fertilization 8. Combining fluorescent bacteria and transgenic zebrafish lines with fluorescent macrophages or neutrophils creates ideal circumstances for multi-color imaging of host-pathogen interactions. This video article will describe detailed protocols for intravenous and local infection of zebrafish embryos with S. typhimurium or M. marinum bacteria and for subsequent fluorescence imaging of the interaction with cells of the innate immune system.

Transparent zebrafish embryos have proved useful model hosts to visualize and functionally study interactions between innate immune cells and intracellular bacterial pathogens, such as Salmonella typhimurium and Mycobacterium marinum. Micro-injection of bacteria and multi-color fluorescence imaging are essential techniques involved in the application of zebrafish embryo infection models.

إصابة الأجنة الزرد مع مسببات الأمراض البكتيرية بين الخلايا

Zebrafish (Danio rerio) embryos are increasingly used as a model for studying the function of the vertebrate innate immune system in host-pathogen ...

Single Cell Measurements of Vacuolar Rupture Caused by Intracellular Pathogens

Shigella flexneri are pathogenic bacteria that invade host cells entering into an endocytic vacuole. Subsequently, the rupture of this membrane-enclosed compartment allows bacteria to move within the cytosol, proliferate and further invade neighboring cells. Mycobacterium tuberculosis is phagocytosed by immune cells, and has recently been shown to rupture phagosomal membrane in macrophages. We developed a robust assay for tracking phagosomal membrane disruption after host cell entry of Shigella flexneri or Mycobacterium tuberculosis. The approach makes use of CCF4, a FRET reporter sensitive to &beta;-lactamase that equilibrates in the cytosol of host cells. Upon invasion of host cells by bacterial pathogens, the probe remains intact as long as the bacteria reside in membrane-enclosed compartments. After disruption of the vacuole, &beta;-lactamase activity on the surface of the intracellular pathogen cleaves CCF4 instantly leading to a loss of FRET signal and switching its emission spectrum. This robust ratiometric assay yields accurate information about the timing of vacuolar rupture induced by the invading bacteria, and it can be coupled to automated microscopy and image processing by specialized algorithms for the detection of the emission signals of the FRET donor and acceptor. Further, it allows investigating the dynamics of vacuolar disruption elicited by intracellular bacteria in real time in single cells. Finally, it is perfectly suited for high-throughput analysis with a spatio-temporal resolution exceeding previous methods. Here, we provide the experimental details of exemplary protocols for the CCF4 vacuolar rupture assay on HeLa cells and THP-1 macrophages for time-lapse experiments or end points experiments using Shigella flexneri as well as multiple mycobacterial strains such as Mycobacterium marinum, Mycobacterium bovis, and Mycobacterium tuberculosis.

We describe a method for tracking the endomembrane rupture elicited by the intracellular bacteria Shigella flexneri and Mycobacterium tuberculosis upon host cell invasion. Our assay makes use of CCF4, a host cytoplasmic FRET probe in live or fixed cells. This reporter is degraded by an enzyme activity present on the bacterial surface.

القياسات خلية واحدة من تمزق رغوي الناجمة عن مسببات الأمراض بين الخلايا

Shigella flexneri are pathogenic bacteria that invade host cells entering into an endocytic vacuole. Subsequently, the rupture of this membrane-enclosed ...

Monitoring Changes in Membrane Polarity, Membrane Integrity, and Intracellular Ion Concentrations in Streptococcus pneumoniae Using Fluorescent Dyes

Membrane depolarization and ion fluxes are events that have been studied extensively in biological systems due to their ability to profoundly impact cellular functions, including energetics and signal transductions. While both fluorescent and electrophysiological methods, including electrode usage and patch-clamping, have been well developed for measuring these events in eukaryotic cells, methodology for measuring similar events in microorganisms have proven more challenging to develop given their small size in combination with the more complex outer surface of bacteria shielding the membrane. During our studies of death-initiation in Streptococcus pneumoniae (pneumococcus), we wanted to elucidate the role of membrane events, including changes in polarity, integrity, and intracellular ion concentrations. Searching the literature, we found that very few studies exist. Other investigators had monitored radioisotope uptake or equilibrium to measure ion fluxes and membrane potential and a limited number of studies, mostly in Gram-negative organisms, had seen some success using carbocyanine or oxonol fluorescent dyes to measure membrane potential, or loading bacteria with cell-permeant acetoxymethyl (AM) ester versions of ion-sensitive fluorescent indicator dyes. We therefore established and optimized protocols for measuring membrane potential, rupture, and ion-transport in the Gram-positive organism S. pneumoniae. We developed protocols using the bis-oxonol dye DiBAC4(3) and the cell-impermeant dye propidium iodide to measure membrane depolarization and rupture, respectively, as well as methods to optimally load the pneumococci with the AM esters of the ratiometric dyes Fura-2, PBFI, and BCECF to detect changes in intracellular concentrations of Ca2+, K+, and H+, respectively, using a fluorescence-detection plate reader. These protocols are the first of their kind for the pneumococcus and the majority of these dyes have not been used in any other bacterial species. Though our protocols have been optimized for S. pneumoniae, we believe these approaches should form an excellent starting-point for similar studies in other bacterial species.

Monitoring Changes in Membrane Polarity, Membrane Integrity, and Intracellular Ion Concentrations in Streptococcus pneumoniae Using Fluorescent Dyes

Unlike that seen for eukaryotes, there is a paucity of studies that detail membrane depolarization and ion concentration changes in bacteria, primarily as their small size makes conventional methods of measurement difficult. Here, we detail protocols for monitoring such events in the significant Gram-positive pathogen Streptococcus pneumoniae utilizing fluorescence techniques.

رصد التغيرات في غشاء التقاطب، غشاء النزاهة، وبين الخلايا ايون التركيزات في<em&gt; العقدية الرئوية</em&gt; استخدام الأصباغ نيون

Membrane depolarization and ion fluxes are events that have been studied extensively in biological systems due to their ability to profoundly impact ...

Application of Fluorescent Nanoparticles to Study Remodeling of the Endo-lysosomal System by Intracellular Bacteria

Fluorescent nanoparticles (NPs) with desirable chemical, optical and mechanical properties are promising tools to label intracellular organelles. Here, we introduce a method using gold-BSA-rhodamine NPs to label the endo-lysosomal system of eukaryotic cells and monitor manipulations of host cellular pathways by the intracellular pathogen Salmonella enterica. The NPs were readily internalized by HeLa cells and localized in late endosomes/lysosomes. Salmonella infection induced rearrangement of the vesicles and accumulation of NPs in Salmonella-induced membrane structures. We deployed the Imaris software package for quantitative analyses of confocal microscopy images. The number of objects and their size distribution in non-infected cells were distinct from the ones in Salmonella-infected cells, indicating extremely remodeling of the endo-lysosomal system by WT Salmonella.

This article describes methods for the synthesis and fluorescent labeling of nanoparticles (NPs). The NPs were applied in pulse-chase experiments to label the endo-lysosomal system of eukaryotic cells. Manipulation of the endo-lysosomal system by activities of the intracellular pathogen Salmonella enterica were followed by live cell imaging and quantified.

تطبيق نيون النانوية لدراسة إعادة عرض لنظام إندو-الليزوزومية من البكتيريا داخل الخلايا

Fluorescent nanoparticles (NPs) with desirable chemical, optical and mechanical properties are promising tools to label intracellular organelles. Here, we ...

Biolistic Transformation of a Fluorescent Tagged Gene into the Opportunistic Fungal Pathogen Cryptococcus neoformans

The basidiomycete Cryptococcus neoformans, an invasive opportunistic pathogen of the central nervous system, is the most frequent cause of fungal meningitis worldwide resulting in more than 625,000 deaths per year worldwide.&#160;Although electroporation has been developed for the transformation of plasmids in Cryptococcus, only&#160;biolistic&#160;delivery provides&#160;an effective means to transform&#160;linear&#160;DNA&#160;that can be integrated into the genome by homologous recombination.&#160;
Acetate has been shown to be a major fermentation product during cryptococcal infection, but the significance of this is not yet known.&#160;A bacterial pathway composed of the enzymes xylulose-5-phosphate/fructose-6-phosphate phosphoketolase (Xfp) and acetate kinase (Ack) is one of three potential pathways for acetate production in C. neoformans. Here, we demonstrate the biolistic transformation of a construct, which has the gene encoding Ack fused to the fluorescent tag mCherry, into&#160;C. neoformans. We then confirm integration of the ACK-mCherry fusion into the&#160;ACK&#160;locus.

Biolistic Transformation of a Fluorescent Tagged Gene into the Opportunistic Fungal Pathogen Cryptococcus neoformans

Biolistic transformation is a method used to generate stable integration of DNA into the genome of the opportunistic pathogen Cryptococcus neoformans through homologous recombination. We will demonstrate biolistic transformation of a construct, which has the gene encoding acetate kinase fused to the fluorescent tag mCherry into&#160;C. neoformans.

التحول Biolistic من نيون معلم جين إلى القناص الفطرية مسببات الأمراض<em&gt; المستخفية المورمة</em

The basidiomycete Cryptococcus neoformans, an invasive opportunistic pathogen of the central nervous system, is the most frequent cause of fungal ...

Identification of Rare Bacterial Pathogens by 16S rRNA Gene Sequencing and MALDI-TOF MS

There are a number of rare and, therefore, insufficiently described bacterial pathogens which are reported to cause severe infections especially in immunocompromised patients. In most cases only few data, mostly published as case reports, are available which investigate the role of such pathogens as an infectious agent. Therefore, in order to clarify the pathogenic character of such microorganisms, it is necessary to conduct epidemiologic studies which include large numbers of these bacteria. The methods used in such a surveillance study have to meet the following criteria: the identification of the strains has to be accurate according to the valid nomenclature, they should be easy to handle (robustness), economical in routine diagnostics and they have to generate comparable results among different laboratories. Generally, there are three strategies for identifying bacterial strains in a routine setting: 1) phenotypic identification characterizing the biochemical and metabolic properties of the bacteria, 2) molecular techniques such as 16S rRNA gene sequencing and 3) mass spectrometry as a novel proteome based approach. Since mass spectrometry and molecular approaches are the most promising tools for identifying a large variety of bacterial species, these two methods are described. Advances, limitations and potential problems when using these techniques are discussed.

Matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS) and molecular techniques (16S rRNA gene sequencing) permit the identification of rare bacterial pathogens in routine diagnostics. The goal of this protocol lies in the combination of both techniques which leads to more accurate and reliable data.

تحديد مسببات الأمراض البكتيرية النادرة التي 16S الريباسي جين تسلسل وMALDI-TOF MS

There are a number of rare and, therefore, insufficiently described bacterial pathogens which are reported to cause severe infections especially in ...

High-throughput Detection of Respiratory Pathogens in Animal Specimens by Nanoscale PCR

Nanoliter scale real-time PCR uses spatial multiplexing to allow multiple assays to be run in parallel on a single plate without the typical drawbacks of combining reactions together. We designed and evaluated a panel based on this principle to rapidly identify the presence of common disease agents in dogs and horses with acute respiratory illness. This manuscript describes a nanoscale diagnostic PCR workflow for sample preparation, amplification, and analysis of target pathogen sequences, focusing on procedures that are different from microliter scale reactions. In the respiratory panel presented, 18 assays were each set up in triplicate, accommodating up to 48 samples per plate. A universal extraction and pre-amplification workflow was optimized for high-throughput sample preparation to accommodate multiple matrices and DNA and RNA based pathogens. Representative data are presented for one RNA target (influenza A matrix) and one DNA target (equine herpesvirus 1). The ability to quickly and accurately test for a comprehensive, syndrome-based group of pathogens is a valuable tool for improving efficiency and ergonomics of diagnostic testing and for acute respiratory disease diagnosis and management.

High-throughput testing of DNA and RNA based pathogens by nanoscale PCR is described using a syndromic canine and equine respiratory PCR panel.

كشف الإنتاجية العالية للجهاز التنفسي مسببات الأمراض في العينات الحيوانية التي كتبها النانو PCR

Nanoliter scale real-time PCR uses spatial multiplexing to allow multiple assays to be run in parallel on a single plate without the typical drawbacks of ...

Visualizing Intracellular SNARE Trafficking by Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy

Soluble N-ethylmaleimide sensitive fusion protein (NSF) attachment protein receptor (SNARE) proteins are key for membrane trafficking, as they catalyze membrane fusion within eukaryotic cells. The SNARE protein family consists of about 36 different members. Specific intracellular transport routes are catalyzed by specific sets of 3 or 4 SNARE proteins that thereby contribute to the specificity and fidelity of membrane trafficking. However, studying the precise function of SNARE proteins is technically challenging, because SNAREs are highly abundant and functionally redundant, with most SNAREs having multiple and overlapping functions. In this protocol, a new method for the visualization of SNARE complex formation in live cells is described. This method is based on expressing SNARE proteins C-terminally fused to fluorescent proteins and measuring their interaction by F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) employing fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM). By fitting the fluorescence lifetime histograms with a multicomponent decay model, FRET-FLIM allows (semi-)quantitative estimation of the fraction of the SNARE complex formation at different vesicles. This protocol has been successfully applied to visualize SNARE complex formation at the plasma membrane and at endosomal compartments in mammalian cell lines and primary immune cells, and can be readily extended to study SNARE functions at other organelles in animal, plant, and fungal cells.

This protocol describes a new method allowing for the quantitative visualization of complex formation of SNARE proteins, based on F&#246;rster resonance energy transfer, and fluorescence lifetime imaging microscopy.

تصور داخل الخلايا المطوقة الاتجار بواسطة عمر Fluorescence التصوير المجهري

Soluble N-ethylmaleimide sensitive fusion protein (NSF) attachment protein receptor (SNARE) proteins are key for membrane trafficking, as they catalyze ...

Zika Virus Specific Diagnostic Epitope Discovery

High-density peptide microarrays allow screening of more than six thousand peptides on a single standard microscopy slide. This method can be applied for drug discovery, therapeutic target identification, and developing of diagnostics. Here, we present a protocol to discover specific Zika virus (ZIKV) diagnostic peptides using a high-density peptide microarray. A human serum sample validated for ZIKV infection was incubated with a high-density peptide microarray containing the entire ZIKV protein translated into 3,423 unique 15 linear amino acid (aa) residues with a 14-aa residue overlap printed in duplicate. Staining with different secondary antibodies within the same array, we detected peptides that bind to Immunoglobulin M (IgM) and Immunoglobulin G (IgG) antibodies present in serum. These peptides were selected for further validation experiments. In this protocol, we describe the strategy followed to design, process, and analyze a high-density peptide microarray.

In this protocol, we describe a technique to discover Zika virus specific diagnostic peptides using a high-density peptide microarray. This protocol can readly be adapted for other emerging infectious diseases.

اكتشاف حانمه تشخيصية محددة الفيروس Zika

High-density peptide microarrays allow screening of more than six thousand peptides on a single standard microscopy slide. This method can be applied for ...

Human Colonoid Monolayers to Study Interactions Between Pathogens, Commensals, and Host Intestinal Epithelium

Human 3-dimensional (3D) enteroid or colonoid cultures derived from crypt base stem cells are currently the most advanced ex vivo model of the intestinal epithelium. Due to their closed structures and significant supporting extracellular matrix, 3D cultures are not ideal for host-pathogen studies. Enteroids or colonoids can be grown as epithelial monolayers on permeable tissue culture membranes to allow manipulation of both luminal and basolateral cell surfaces and accompanying fluids. This enhanced luminal surface accessibility facilitates modeling bacterial-host epithelial interactions such as the mucus-degrading ability of enterohemorrhagic E. coli (EHEC) on colonic epithelium. A method for 3D culture fragmentation, monolayer seeding, and transepithelial electrical resistance (TER) measurements to monitor the progress towards confluency and differentiation are described. Colonoid monolayer differentiation yields secreted mucus that can be studied by the immunofluorescence or immunoblotting techniques. More generally, enteroid or colonoid monolayers enable a physiologically-relevant platform to evaluate specific cell populations that may be targeted by pathogenic or commensal microbiota.

Here, we present a protocol to culture human enteroid or colonoid monolayers that have intact barrier function to study host epithelial-microbiota interactions at the cellular and biochemical level.

مونولاييرس كولونويد البشرية لدراسة التفاعلات بين العوامل الممرضة، كومينسالس، وظهاره الأمعاء المضيف

Human 3-dimensional (3D) enteroid or colonoid cultures derived from crypt base stem cells are currently the most advanced ex vivo model of the intestinal ...