نشكر الدكتور ميكي يانغ لتحرير والتعليقات، والدكاترة. ليو تشانغ بنغ بو وللحصول على المساعدة. وأيد هذا العمل من قبل مكتب العلوم ومكتب علوم الطاقة الأساسية من الولايات المتحدة وزارة الطاقة (العقد رقم DE-AC02-05CH11231)، والقومي للقلب والرئة والدم المعهد من المعاهد الوطنية للصحة (أي . R01HL115153)، والمعهد الوطني للعلوم الطبية العامة من المعاهد الوطنية للصحة (رقم R01GM104427).

1. إعداد سلبي الطازجة تلطيخ الحل عند 1٪ (ث / ت) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع 1 ملغ فورمات اليورانيل (UF) مسحوق في زجاجة تحتوي على 100 مل منزوع الأيونات الماء في غرفة مظلمة أو مربع. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحريك الحل O / N في RT في غرفة / مربع مظلم. التفاف زجاجة حل مع رقائق الألومنيوم لمنع الضوء من ضرب الحل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تصفية الحل شنت بلطف من خلال 0.2 ميكرون (حجم المسام) تصفية على حقنة 5 مل. تم جمع الحل تصفيتها إلى عدة رقائق الألومنيوم المغطاة أنابيب فالكون. ويجب أيضا أن تكون ملفوفة الحقنة فلتر مع رقائق الألومنيوم لمنع التعرض للضوء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تصفية الحل مرة أخرى من خلال 0.02 ميكرون (حجم المسام) مرشح شنت على 1 مل حقنة. وقد تم جمع الحل تصفيتها وقسامة في قارورة 2 مل. المحاقن وقارورة يتم تغطيتها بورق الألمنيوم قبل استخدامها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجميد قارورة قسامة باستخدام ملقط التعامل معها منذ فترة طويلة غمر قارورة في النيتروجين السائل الحاويات شغل فورابعد أن تم تصفيتها الحل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل القنينات المجمدة في الفريزر -80 درجة مئوية لتخزين واستخدام في المستقبل. </li></ol> 2. إعداد محطة العمل تلطيخ السلبية والحضانة محطة العمل <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ذوبان الجليد قارورة من 1٪ UF حل في حمام مائي وضعت في RT. تأكد من أن رقائق الألومنيوم لا تزال ملفوفة حول القنينة لمنع التعرض للضوء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تصفية الحل هو إذابة تماما بعد ذلك باستخدام رقائق الألومنيوم ملفوفة شنت 1 مل حقنة مع 0.02 ميكرون التصفية. جمع الحل تصفيتها في رقائق الألومنيوم الجديد ملفوفة قارورة، ووضعها على الجليد داخل سقف يغطيها الجليد مربع الانتظار للاستخدام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جعل وحات الحل بواسطة الإصبع دفع ورقة Parafilm طويلة ~ 8 بوصة على سطح لوحة فارغة البروتين التبلور. فإنه سيتم إنشاء الصفوف لوحات دائرية بقطر 5 مم ~. جعل 6 لوحات في كل مكان التوالي لوحات Parafilm على سطح الجليد بالارض داخل الجليد تحتوي علىإيه الغطاء، كمحطة عمل تلطيخ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ماصة ~ 35 ميكرولتر منزوع الأيونات الماء على كل من ترك ثلاث لوحات في كل صف، وماصة ~ 35 ميكرولتر تصفيتها حل UF إلى اليمين ثلاث لوحات في كل صف. تغطية محطة تلطيخ مع غطاء لمنع التعرض للضوء قبل تلطيخ البروتينات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد محطة حضانة شبكة EM عن طريق ملء مربع فارغ في منتصف الطريق مع الثلج، والالتزام بجانب الحظيرة التي يمكن تركيبها على قاعدة المساندة. وضع ملاقط العينة في الحظيرة، والذي نصائح ملاقط &quot;هي بالقرب من سطح الجليد. تغطية نصف نصائح ملاقط من خلال ارتفاع مربع الشفة. مربع الجليد مثالية لجعل محطة حضانة يستخدم وعاء نصائح الماصة فارغة. </li></ol> 3. OpNS عملية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> توهج في أداء رقيقة فيلم الكربون المغلفة 300 يتناغم شبكات النحاس EM لمدة 10 ثانية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التقاط الشبكة مع ملاقط وملاقط ربط في الحظيرة عن طريق الحفاظ على الشبكة في 45 درجة الميل و1 بوصة فوق الجليدالسطح داخل محطة الحضانة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمييع عينة بروتين مع Dulbecco والفوسفات مخزنة المالحة (DBPS) في تركيز البروتين النهائي من 0.01 إلى ~ ~ 0.005 ملغ / مل. إيداع ~ 4 ميكرولتر المخفف عينة مباشرة بعد التخفيف على الجانب الكربون من EM الشبكة. (DPBS يمكن تغيير عازلة لآخر إذا كان البروتين حساس للDPBS) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان العينة على شبكات EM ل~ 1 دقيقة داخل محطة الحضانة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الزائد من خلال حل بسرعة لمس حافة الشبكة مع ورق الترشيح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لمس الشبكة بسرعة لأول قطرة (~ 35 ميكرولتر) من سطح الماء النقي فوق ورقة Parafilm الحق بعد إزالة الحل الزائد على الشبكة EM. ثم إزالة الماء الزائد فورا مع ورق الترشيح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر الخطوة 3.6 لآخر مرتين عن طريق غسل الشبكة EM على اثنين من قطرات الماء المتبقية على Parafilm (الخطوة 3.6 و 3.7 يمكن تخطي إذا كانت العينة حساسة للغاية في الماء). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعويم GRI EMد مباشرة على سطح أول قطرة من UF حل مباشرة بعد الماء الزائد على الشبكة EM تم إزالتها. ثم احتضان لمدة 10 ثانية. تأكد لإنهاء إجراءات مياه الغسيل داخل 3 ثانية قبل العائمة الشبكة على سطح الحل UF. وأقصر وقت الغسيل، سيكون ذلك أفضل نوعية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنظيف ملاقط عن طريق اختراق النصائح في ورقة فلتر ل~ 2 - 3 مرات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الحل الزائد على الشبكة من خلال الاتصال على حافة الشبكة مع ورقة الترشيح، ثم تطفو الشبكة على الهبوط الثاني من UF. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مواصلة فوق خطوة 3.10 على الحبرية الثانية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطفو الشبكة على الحبرية الثالثة من حل UF وتغطية محطة تلطيخ ل~ 1 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خطوة اختيارية: غسل الشبكة بسرعة على رأس الماء كما هو موضح في 3.6. وهذه خطوة إضافية يستفيد عينات تحتوي على أكثر من جزيئات الذهب المجانية المحملة أو الخلفية صمة عار. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الحل الزائد عن طريق لمس ورقة الترشيح إلى الالبريد كامل المؤخر شبكة (مقابل الجانب الكربون). تجف الشبكة تحت تيار لطيف من غاز النيتروجين في RT الحق بعد مراقبة الحل لاستيعاب ورقة الترشيح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع الشبكة على ورقة من ورق الترشيح داخل طبق بتري، وتغطي طبق جزئيا مع قبعة لتجف لمدة 30 دقيقة على الأقل تحت RT. بالنسبة لبعض العينات، ووضع شبكة في 40 ° C حاضنة الخبز لساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخزين الشبكة في مربع شبكة EM EM لفحص في المستقبل. </li></ol> 4. EM فحص <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> محاذاة TEM بشكل صحيح قبل EM فحص بروتينات صغيرة على الشبكة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مراجعة القرار من أعلى مرئية ثون الدائري الذي هو طيف الطاقة من فيلم الكربون غير متبلور لتحديد ما إذا كان TEM تم محاذاة بشكل صحيح. منذ يتم تقاسم TEM قبل العديد من المستخدمين مختلفة، وغالبا ما لا محاذاة TEM بشكل صحيح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التحقق بعناية من طيف الطاقة على المنطقة فيلم الكربون من العينة لضبط المحاذاة شرطان من الجهاز. أعلى مرئية ثون حلقات هي أفضل من القرار المستهدفة. ملاحظة: وكمثال على التوافق السليم من TEM LaB6 خيوط تعمل تحت 120 كيلو فولت التوتر الشديد، أكثر من 20 ثون حلقات يمكن تصور فيها، وقرار المقابل يمكن أن يكون أفضل من 5.0 Å. وقد تحقق هذا ثون الدائري عن طريق التحويل فورييه من فيلم الكربون غير متبلور تصويرها تحت يزيل التباؤر من ~ 1.6 ميكرون وجرعة من 20.4 ه / A2 (الشكل 5). ملاحظة: من مراقبة عالية الدقة ثون الدائري هو شرط ضروري، ولكنه ليس شرطا كافيا لالمحاذاة الصحيحة. لتحقيق الواقع صور عالية الدقة، والعديد من العوامل الأخرى مهمة أيضا، مثل نوعية العينة، وأضرار الإشعاع، شحن والانجراف وكذلك معدل الجرعة الإضاءة. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جلب يزيل التباؤر إلى شبه شيرتسر التركيز لتصوير البروتينات صغيرة على مساحة الملون بشكل مثالي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> البحث عن منطقة &quot;جزئيا&quot; لايماجه. عادة ما تقع منطقة ملطخة مثالي بالقرب من حافة منطقة صمة عار سمكا، والتي تبدو مثل منطقة &quot;جزئيا&quot; على الشبكة منذ سمك وصمة عار عادة يست موزعة بالتساوي على الشبكة المغلفة الكربون (الشكل 6). وعادة ما كان التكبير المنخفض (&lt;100X) للمساعدة في العثور على هذه المناطق الغائمة أولا قبل التكبير للتصوير. </li></ol>

We have nothing to disclose.

بالمقارنة مع التقنيات التقليدية NS، يمكن OpNS منع التحف النضائد (الشكل 1 و 9)، وتوفير موثوقة ومعقولة دقة عالية (~ 1nm) التفاصيل الهيكلية للبروتينات صغيرة (الشكل 2). مقارنة البرد EM، OpNS يوفر طريقة إنتاجية عالية ويمكن دراسة مجموعة واسعة من البروتينات والبروتين البروتين التفاعلات 6. ومع ذلك، لا يزال لديه OpNS سلبياته. مقارنة NS التقليدية، OpNS يستتبع: ط) خطوات أكثر تعقيدا في إعداد العينات. ب) باستخدام مادة مشعة، UF. ج) الحفاظ على وصمة عار جديدة بسبب قوة أقصر من وصمة عار UF بسبب حساسية الضوء فيها؛ د) لمنع هطول يجب تخزين الحل UF في -80 درجة مئوية، ويتطلب ذوبان الجليد قبل الاستخدام. ت) وأخيرا كل UF يجب أن يتم التعامل معها على أنها نفايات خطرة. مقارنة البرد EM، OpNS توفر صورا قرار أقل نسبيا ولا ضمان لأي قطعة أثرية لم تكتشف بعدفي المستقبل. الآثار الإجرائية العملية NS على تكوين البروتين الدهني النضائد NS بروتوكولات لإعداد البروتينات للفحص 16،29-36،55 يمكن تصنيفها إلى ثلاث مجموعات رئيسية من الأساليب 50: 55 الاختلاط، وانخفاض بنسبة انخفاض 16، وإجراءات الغسيل 29. ط) يتطلب بروتوكول خلط خلط الأولي للعينة وصمة عار والبروتين بنسبة معينة، ومن ثم تطبيق الحل مختلطة على الفيلم الكربون المغلفة على الشبكة، وإزالة أخيرا حل الزائد مع ورق الترشيح قبل التجفيف في الهواء لفحص EM 55. ب) ويتضمن بروتوكول قطرة تلو قطرة تطبيق (~ 4 ميكرولتر) قطرة عينة مباشرة إلى شبكة EM الكربون المغلفة في السماح للاعتصام ~ 1 دقيقة، وإزالة الزائد في وقت لاحق محلول العينة قبل تطبيق قطرة (~ 4 ميكرولتر) من وصمة عار الحل على نفس الجانب من الشبكة. ~ بعد 1 دقيقة من الحضانة، وإزالة excesق وصمة عار من خلال الاتصال مع ورقة نظيفة التصفية، التي تقدم أخيرا لتجفيف الهواء 16،56-58. ج) البروتوكول الغسيل (الشكل 7) تتطلب تطبيق محلول العينة إلى شبكة EM المغلفة في الكربون لمدة 1 دقيقة، ثم يغسل بالماء منزوع الأيونات ثلاث مرات مباشرة بعد إزالة حل الزائد في كل مرة بواسطة ورق الترشيح 3،29،30. OpNS تم تعديل بروتوكول من هذا الإجراء الغسيل. NS أنواع البقع والآثار على تشكيل البروتين الدهني النضائد في NS، نثر الإلكترون أقوى بسبب البقع المعادن الثقيلة توفر النقيض من البروتينات 17-20،59. يمكن أن عينات NS تعاني بالإضافة إلى المزيد من الجرعات الإشعاعية، وتعزيز الميزات البروتين تناقض أكثر حدة سلبي 8،9،60. ويمكن تصنيف البقع من المعادن الثقيلة مثل: أنيوني، بما في ذلك حمض الفسفوتنغستيك (PTA) 16، ميثيل تنغستات 14 و 61 السيليكون تنغستات. والموجبةجيم، مثل اليورانيل خلات (UA) 62، UF 3،29،30، ونترات اليورانيل (UN) 63. واحدة من البقع NS أنيوني يستخدم الأكثر شيوعا هو PTA 33،64-67. PTA هو حمض heteropoly، والتي عادة ما تستخدم حول درجة الحموضة 7،0-7،5. ويمكن أيضا أن تستخدم لمنطقة التجارة التفضيلية لتلطيخ إيجابي 3،16،68. هذه الاتهامات السلبية لمنطقة التجارة التفضيلية قد توسط التفاعلات مع الدهون غير المشبعة كهرباء موجبة الشحنة مجموعات الرأس، مثل POPC، على كلا البروتين الدهني والحويصلية السطوح. قد يسبب PTA تشكل النضائد من خلال هذا التفاعل 29،30 حتى 29،30 عازلة تحت منتظم الملوحة (الشكل 1). البقع اليورانيل، مثل UA، UF والأمم المتحدة هي الخيارات البديلة للالموجبة البقع المعادن الثقيلة وUA على وجه الخصوص كثيرا ما يستخدم لNS مجموعة متنوعة من العينات البيولوجية 62،69،70. ووجدت التجارب UF يسبب أي نضائد من البروتينات الدهنية التي تحتوي على الدهون غير المشبعة حمض الدهون، مثل POPC. ومع ذلك، قد لا يزال UF لحث rouleتشكيل مدخل aux على البروتين الدهني التي تحتوي على الدهون المشبعة الأحماض الدهنية، مثل فسفاتيديل dimyristoyl (DMPC) و 1 hexadecanoyl-2-octadecanoyl-SN-glycero-3-phosphocholine (PSPC). آلية مفصلة لهذا التفاعل غير معروفة. يمكن UA / UF / الأمم المتحدة عن العمل في قيم الرقم الهيدروجيني أقل تتراوح 3،5-4،6. يجوز لهذه القيم الرقم الهيدروجيني أقل غير مناسب لبعض الجزيئات البيولوجية التي تعتبر حساسة لدرجة الحموضة 14،71. ومن المثير للاهتمام، يمكن UA / UF إصلاح بنية البروتين داخل أجزاء قليلة من الثانية من خلال آلية غير معروفة 72. خلافا لمنطقة التجارة التفضيلية، UA / UF هو أكثر مماثلة إلى الملح من الأحماض. UF ورد يمكن أن توفر نتائج أفضل من UA 73، والتي، UF والأمم المتحدة بقع ذات أحجام أصغر من الحبوب UA (UF: 0.3 نانومتر، الأمم المتحدة: ~ 0.5 نانومتر) 3،74. مثال للاهتمام، والتفاصيل الثانوية مثل هيكل بروتين صغير (53 كيلو دالتون CETP) يمكن تصور مباشرة من الميكروسكوب الخام عندما كان يستخدم UF والسلبية وصمة عار كاشف باتباعذكرت في وقت سابق البرد الإيجابي تلطيخ (البرد PS) طريقة (الشكل 8) 6. في البرد PS، كانت عينة ملطخة فلاش المجمدة باتباع البرد EM إجراءات إعداد العينات بدلا من إجراء التجفيف في OpNS البروتوكول الذي قد يتسبب في انهيار الهيكلية الثانوي. والبرد PS هي طريقة لعالية التباين والتصوير ذات الدقة العالية للبروتينات صغيرة 75. منذ الصور البرد PS وقد عكس النقيض مقارنة بتلك التقارير من بروتوكول البرد NS 22، ولكن لديها ثابت صورة النقيض من تلك التقليدية من الصور البرد EM، وبالتالي سميت الطريقة البرد PS. تظهر الصور البرد PS أن كاشف تلطيخ، فورمات اليورانيل، تخترق السطح الجزيئي، مما يشكل تحديا وجهة النظر التقليدية التي تلطيخ يمكن تصور فقط بنية السطح الخارجي. آلية لكيفية فورمات اليورانيل تخترق السطح الجزيئي غير معروف. واحد الاحتمالات هو أن الموجبة اليورانيل يربط المتاحة مجموعات الكربوكسيل البروتين، وبالتاليالمحيطة الجليد الزجاجي هو من كثافة أقل من تلطيخ من البروتين والجماعات اليورانيل، وبالتالي بوصفها وصمة عار إيجابية. طريقة البرد PS يشبه متعددة استبدال متشاكل (MIR) الأسلوب، الذي كان نهج مشترك لحل المشكلة في مرحلة البلورات بالأشعة السينية 76-78. في MIR، هي غارقة عينات الكريستال مع حل ذرة الثقيلة، بما في ذلك اليورانيوم، للحصول على شكل تماثلية إلى شكله الأصلي. إضافة ذرة ثقيلة أحيانا لا يؤثر على تشكيل الكريستال أو وحدة أبعاد الخلية ولكن يوفر معلومات إضافية من الكريستال تحديد الهيكل 76-78. من خلال الاستفادة من الحبوب صغيرة من UF، يمكن البرد PS يوفر التباين العالي وصورة عالية الدقة من بروتين واحد، وهو أمر مهم للدراسات بنية البروتين، خاصة عندما اعتبر أن ما يقرب من جميع البروتينات الحيوية بشكل طبيعي وغير المتجانسة في الحل. للتأكد من صحة هذه الطريقة البرد PS، نفتح لأي اختبار أعمى من الميدان EM. </<html> P&gt; آثار تركيز الملح على تشكل النضائد في البروتينات الدهنية باستخدام PTA التقليدية تلطيخ السلبية الكاشف، تشكل النضائد احظ هو أكثر احتمالا المتعلقة التفاعلات الدهون بدلا من التفاعل البروتين. تصوير عينات من POPC الحويصلات الحويصلية أعدت تحت الملوحة كبيرة (0.5 M كلوريد الصوديوم)، والملوحة المعتدلة (0.25 M كلوريد الصوديوم)، ضعيفة نسبيا الملوحة (0.1M كلوريد الصوديوم)، والماء النقي (الشكل 9)، تظهر الميكروسكوب الإلكتروني كان تشكل النضائد المترابطة لتركيز الملح (الشكل 9A - D). باستخدام UF تلطيخ السلبية والكاشف، لم يلاحظ أي النضائد في POPC عينة الحويصلية حويصلة 30 (الشكل 2L)، مما يشير إلى إجراء الغسيل لتقليل تركيز الملح بسرعة الحق قبل تلطيخ هو ضروري، ولكن ليس خطوة كافية بشكل مستقل لمنع النضائد في POPC ذات الصلة العينات. &quot;jove_content&quot;&gt; التصوير TEM بروتين صغير يتطلب حالة التركيز شبه شيرتسر. التصوير TEM الناجح للبروتينات صغيرة في دقة أعلى يتطلب شرطين الحرجة، محاذاة شعاع المناسبة وشبه شيرتسر حالة اكتساب التركيز. ط) يمكن الحكم على تشكيلة شعاع المناسبة من خلال عدد من حلقات مرئية ثون (طيف الطاقة) على نقل فورييه لصورة الفيلم الكربون التي تحصل عليها بموجب يزيل التباؤر مرتفعة نسبيا. وأفضل حالة محاذاة شعاع، والمزيد من حلقات ثون يمكن تصور وقابلة للقياس .. ب) اكتساب صورة تحت القريب شيرتسر التركيز هو حالة حرجة أخرى. استراتيجية المعايير التقليدية لتصوير العينات البيولوجية يستخدم عادة يزيل التباؤر عالية (1 - 2 ميكرون وأكثر)، والتي يمكن أن تعزز عينة بيولوجية تباين الصورة 79. هذه الاستراتيجية هي مهمة تختلف عن استراتيجية نموذجية لتصوير هيكل قرار الذري للمواد الصلبة، والتي غالبا مايستخدم التركيز شيرتسر القريب (~ 50 نانومتر يزيل التباؤر). على الرغم من، يمكن أن يزيل التباؤر أعلى تعزيز البيولوجي عينة المقابل، إشارات عالية الدقة سوف يتم القضاء جزئيا. ونتيجة لذلك، فإن تواطؤ عالية الدقة إشارة تكون أقل في حالة ارتفاع يزيل التباؤر التصوير. والسبب هو أن الصورة TEM هي التفاف هيكل العينة وCTF الصك. وCTF هو منحنى متذبذب ضد تردد، الذي منحنى متذبذب كثيرا عبور الصفر السعة في الترددات العالية. في كل مرة عندما CTF عبر الصفر، سيتم القضاء على إشارة الهيكلية عينة في هذه تردد معين (لن الصفر مرة أي عدد يكون صفرا). إشارة القضاء في هذا التردد لا يمكن استعادتها بواسطة أي خوارزمية تصحيح CTF (صفر مقسوما صفر يمكن أن يكون أي رقم عشوائي بدلا من إشارة الهيكلية الأصلية). تحت أعلى التصوير يزيل التباؤر، فإن CTF التأرجح أكثر صرامة، وبالتالي فإن CTF يعبر الصفر السعة على نحو أكثر تواترا، ونتيجة لذلك،سيتم القضاء على الإشارات الهيكلية في عدد أكبر من ترددات محددة. والمزيد من الإشارات التي يتم القضاء عليها، وأقل تواطؤ الصورة سيكون. وتجدر الإشارة إلى تواطؤ صورة لا يمكن استردادها أو تصحيح من قبل أي تصحيح CTF. ومع ذلك، فإن عددا من الصور غير المكتملة المكتسبة تحت defocuses مختلفة يمكن استخدامها لملء الفجوات لبعضها البعض لحصل على إشارة الهيكلية الانتهاء من الهيكل عينة عن طريق حساب المتوسط، والتي حتى قرار الذري يمكن أن يتحقق 9-12. طريقة المتوسط ​​هو نهج قوي لتحقيق بنية بعض البروتينات شديدة التماثل والبروتينات الجامدة المرتبطة هيكليا. ومع ذلك، فإنه لا يزال تحديا في الدراسة الهيكلية للبروتينات صغيرة وغير المتماثلة، خاصة بالنسبة للديناميات الهيكلية المرنة والبروتينات، مثل الأجسام المضادة وHDLs. ويستند المتوسط ​​على افتراض أن جزيئات البروتين متطابقة في هيكل والتشكل لكن ديfferent في التوجهات، ومن المعروف مع ذلك العديد من البروتينات للخضوع لتقلبات الحرارية في الحل. من خلال تطبيق طريقة المتوسط ​​دون أن يعرف سابقا البروتين تقلبات تقلبات الحرارية، وغالبا ما تتسبب في هيكل متوسط ​​المفقودين المجالات 10،80 أو الاختلاف المحلي في القرار 81 في اعادة البناء البرد EM. النجاح في تحقيق إعادة الإعمار 3D من بروتين صغير، مثل 53 كيلو دالتون CETP، وهيكل 3D من بروتين واحد، مثل 160 كيلو دالتون IgG1 الضد، والفوائد من استخدام شبه شيرتسر حالة التصوير التركيز تحت شرط المحاذاة الصحيحة. على الرغم من تباين الصورة يبدو منخفضا في شيرتسر-بالقرب من صور التركيز، على النقيض يمكن أن تعزز بسهولة ببساطة عن طريق تطبيق منخفضة تمرير تصفية للحد من الضوضاء عالية التردد في الخلفية. نحن نعتقد، وشبه التركيز شيرتسر الصور تحمل أقصى إشارات الهيكلية، ويمكن أن تزيد من دقة محاذاة الجسيمات وتعزيز ايفيciency في واحد الجسيمات 3D إعادة الإعمار وإعادة الإعمار الجسيمات الفردية المقطعي الإلكترون.

فهم وظيفة البروتين يتطلب معرفة بنية البروتين. تقرير الهيكلي تحديا للبروتينات التي تقع ضمن الجماهير الجزيئية 40 - 200 كيلو دالتون. البلورات بالأشعة السينية يقتصر بواسطة بروتين التبلور. الرنين النووي المغناطيسي (NMR) مطياف يقتصر على الجماهير الجزيئية أقل من 40 كيلو دالتون، في حين المجهري البرد الإلكترون (البرد EM) لديه صعوبة في الحصول على الصور على حد سواء وثلاثية الأبعاد (3D) إعادة بناء البروتينات الصغيرة التي هي أقل جماهير الجزيئية من 200 كيلو دالتون. والجدير بالذكر أن أكثر من 50٪ بروتينات لها الكتلة الجزيئية ضمن نطاق 40-200 كيلو دالتون 1،2، والطرق الحالية تشكل تحديا في دراسة البروتينات من هذا الحجم، هناك حاجة إلى طريقة جديدة. على الرغم من أن معظم المجاهر الإلكترونية الإرسال (إحساس الغانيين) قادرة على قرار الذري، أي أفضل من (3) قرار Å، حتى تحقيق بنية القريب قرار نانومتر من العينات البيولوجية هو challen بدلاجينج 7. أضرار الإشعاع والتباين المنخفض، الانحرافات الهيكلية فضلا عن القطع الأثرية مثل الجفاف كل تعيق عالية الدقة TEM التصوير 3،8. بين النهج TEM مختلفة، البرد EM هو وسيلة متقدمة وأحدث لتحقيق الهياكل قرار ذرية من الجزيئات الكبيرة متماثل للغاية في ظل الظروف الفسيولوجية بالقرب من 9-12. يتم تحضير العينة البرد EM فلاش تجميد محلول العينة، تضمين الجزيئات في الجليد الزجاجي، الذي التقط لاحقا عند درجات الحرارة المبردة مثل النيتروجين أو الهليوم السائل درجات الحرارة 13. البرد EM هو مفيد في تلك العينات وجود أي التحف وهم السكان الأصليون تقريبا في الهيكل 8-12. البرد EM لديها سلبياته: ط) مطلوبة أجهزة إضافية ليتم تثبيتها أو شراؤها للترقية أداة TEM القياسية للقدرة البرد EM. وتشمل الأجهزة: مكافحة contaminator، البرد حامل، جرعة منخفضة من وضع برامج وجرعة منخفضة من سينسيTIVE CCD الكاميرا، على الرغم من أن أسعار هذه الأجهزة هي أقل بكثير من سعر الأداة TEM نفسه؛ ب) تحتاج عملية البرد EM قتا أطول من عملية NS. فحص عينة البرد EM غالبا ما يتطلب وقتا أطول لإعداد العينات وتشغيل أداة TEM من ذلك من NS بسبب البرد EM يتطلب معالجة صعوبات إضافية، بما في ذلك: درجة حرارة النيتروجين السائل العملية، عينة الشحن، والانحراف التصوير، والتدرجات درجة الحرارة، جرعة منخفضة تشغيل النموذج، الحساسيات الإشعاع عينة والقيود الجرعة. وهذه خطوات إضافية تبطئ من سرعة الحصول على بيانات مفيدة مقارنة الحصول على البيانات NS، على الرغم من أن عدد قليل من الصور البرد EM يمكن بالتأكيد الحصول في 1 ساعة أو أقل قبل خبراء البرد EM مع وثيقة أعدت في درجة حرارة التدرج متوازن. ج) للمستخدمين تتطلب تدريبا إضافيا، مثل التعامل مع النيتروجين السائل، وتجميد شبكات البرد EM، عملية جرعة منخفضة، قياس الجرعة، التعامل مع الشحن، والانجراف والمعرفة في بروك التصويرessing. د) عدم وجود التصوير تكرار لنفس العينة-البرد خلال جلسات TEM مختلفة. تلف العينات البرد EM بسهولة عن طريق تلوث الجليد خلال عينة التحميل والتفريغ إلى / من الصك TEM. هذا الضرر هو مصدر قلق خاصة عندما يصعب أن تكون معزولة العينات / تنقيته 14؛ ت) بروتينات صغيرة (&lt;200 كيلو دالتون الكتلة الجزيئية) يتحدون ليمكن تصوير بسبب تباين منخفضة؛ السادس) على النقيض منخفضة وضوضاء عالية من الصور البرد EM يقلل من قيمة عبر ارتباط بين الصور، لذلك، خفض دقة الشاملة في تحديد التوجهات البروتين، التشكل والتصنيفات، وخاصة بالنسبة البروتينات التي هي مرنة هيكليا وتتقلب بشكل طبيعي في حل 4،5. تلطيخ السلبية (NS) هو أسلوب نسبيا &quot;القديم&quot; والتاريخي الذي أي مختبر، مع أي نوع EM، يمكن الاستفادة لدراسة بنية البروتين. برينر وهورن أول من طور مفهوم سو تلطيخ السلبية قبل نصف قرن لفحص الفيروسات 15. ويتم إنجاز NS من خلال طلاء العينة مع المتهمين أملاح المعادن الثقيلة. هذا المفهوم تأتي أصلا من المجهر الضوئي وممارسة دمج البكتيريا في حل وصمة عار توفير الظلام حول العينات، مما يتيح أعلى تباين الصورة عند عرض صورة سلبية 16. منذ ايونات المعادن الثقيلة لديها قدرة أكبر على تفريق الإلكترونات مقارنة مع أقل كثافة الذرات في البروتينات 17-20، وصمة عار طلاء المعادن الثقيلة يسمح وجود قيود جرعة أعلى مع تحسين التباين. يمكن أن توفر عينة NS صور عالية التباين 8 لتسهيل تحديد اتجاه الجسيمات وإعادة الإعمار 3D من الصور من البرد EM. NS التقليدية، لسوء الحظ، يمكن ان تنتج القطع الأثرية الناجمة عن التفاعلات وصمة عار البروتين، مثل التجميع العام، التفكك الجزيئي، تسطيح والتراص 8،21،22. لدهن المتعلقة المتواجدالإضافية، مثل البروتينات الدهنية 16،23-30، ونتائج القطع الأثرية المشتركة في الجزيئات التي مكدسة ومعبأة معا في نضائد (الشكل 1) 31-36. العديد من الدراسات البروتين الدهني، مثل nondenaturing التدرج الكهربائي للهلام بولي أكريلاميد، البرد EM يدرس 13،29،37-40، مطياف الكتلة 39،41، والصغيرة بيانات حيود الأشعة السينية زاوية 42 جميع الجسيمات هي جسيمات البروتين الدهني تظهر معزولة بدلا من مكدسة بشكل طبيعي معا تشكيل نضائد 21،29،30،35،42-45. ربما كان السبب في مراقبة تشكل النضائد التي كتبها NS التقليدية من خلال التفاعلات الدينامية بين البروتينات الدهنية تتكون من (APO) apolipoproteins والدهون الفوسفاتية التي تتسم بالمرونة هيكليا في حل 13،29،30،46-49 والحساسية للبروتوكول NS القياسية. للتعرف على هذه الأداة، استخدمت ئي E4 (apoE4) بالميتويل-oleoylphosphatidylcholine (POPC) البروتين الدهني عالي الكثافة (HDL) عينة كعينة اختبار وcryo-EM الصور لقطعة أثرية خالية مستوى 29، وفحص العينات NS أعدت في إطار سلسلة من الشروط. بمقارنة أحجام الجسيمات والأشكال الحصول عليها من البرد وNS-EM، تم العثور على نوع معين من كاشف تلطيخ وتركيز الملح ليكون معلمتين الرئيسية مما تسبب في الظواهر النضائد معروفة. وبالتالي، أفيد بروتوكول الأمثل لتلطيخ السلبية (OpNS). بواسطة OpNS، تم القضاء على ظاهرة النضائد معروفة من قبل OpNS apoE4 HDL (الشكل 2A). أظهر التحليل الإحصائي OpNS عوائد صور مماثلة جدا (أقل من 5٪ انحراف) في الحجم والشكل مقارنة مع تلك من البرد EM، ولكن تم القضاء على التباين. أجريت على التصديقات من OpNS عن طريق فحص القضاء على قطعة أثرية النضائد ما يقرب من جميع الطبقات أو الفئات الفرعية من عينات البروتين الدهني 6،29،30،50،51، بما في ذلك برنامج عمل ألماتي-I 7.8 نانومتر (الشكل 2B)، 8.4 نانومتر (الشكل 2C) و 9.6 نانومتر دiscoidal أعيد HDL (rHDL) (الشكل 2D)، 9.3 نانومتر كروية rHDL (الشكل 2E)، البشري HDL البلازما (الشكل 2F)، الدهون مجانا برنامج عمل ألماتي-I (الشكل 2G)، HDL البلازما (الشكل 2H)، البروتين الدهني منخفض الكثافة (LDL ) (الشكل 2I)، البروتين الدهني المتوسطة الكثافة (IDL) (الشكل 2J)، البروتين الدهني منخفض الكثافة جدا (VLDL) (الشكل 2K)، وPOPC الحويصلية (الشكل 2L) 30. أجريت التصديقات إضافية عن طريق التصوير بروتينات صغيرة وغير المتماثلة، بما في ذلك 53 كيلو دالتون البروتين نقل الكوليسترول استر (CETP) (الشكل 3A - C) 6،29، ودرجة عالية من المرونة 160 كيلو دالتون مفتش الأضداد (الشكل 4A وباء) 4،5،29 (52 عاما) واثنين من البروتينات الهيكلية المعروفة، GroEL وproteasome (الشكل 2M و N). لطلب أي التحقق من صحة إضافي من جolleagues، ونحن منفتحون على أي الاختبارات العمياء في هذه الطريقة OpNS. OpNS كبروتوكول عالية الإنتاجية كما تم استخدامها لدراسة آلية البروتين عن طريق فحص مئات العينات من البروتينات الصغيرة، مثل CETP التي كانت ملزمة لبروتينات مختلفة في ظل الظروف سلسلة (بما في ذلك CETP التفاعل إلى 4 فئات من البروتينات الدهنية، معاد HDL، البلازما HDL، LDL وVLDL، مع / بدون 2 الأجسام المضادة، H300 وN13، تحت مرة 9 الحضانة، بما في ذلك 3 دقيقة، 20 دقيقة، 1 ساعة، 2 ساعة، 4 ساعة، 8 ساعة، 24 ساعة، 48 ساعة و 72 ساعة، أقل من 4 نسب الضرس، أي 1: 0.5، 1: 1، 1: 2، 1: 4، و 3 التخفيفات، أي 0.1 ملغ / مل، 0.01 ملغ / مل و 0.001 ملغم / لتر، بالإضافة إلى عينات تحكم إضافية، بما في ذلك CETP وحده، وحده LDL، VLDL وحدها، مع اختبارات ثلاثية من التجارب المذكورة أعلاه من قبل أشخاص مختلفين) 6،29. OpNS صور CETP قدمت الصور عالية التباين مع تفاصيل الهيكلية غرامة معقول. مما يسمح لنا لإعادة بناء بنجاح خريطة 3D كثافة 53 كيلو دالتون SMAليرة لبنانية البروتين CETP (الشكل 3D - F) من خلال إعادة الإعمار جسيم واحد. وعلاوة على ذلك، فإن التباين العالي OpNS الصور توفر لنا إشارة كافية من البروتين الفردية (الشكل 4A - C)، الأمر الذي سمح لنا لتحقيق قرار وسيطة (~ 1.5 نانومتر) من واحد (كائن واحد، أي المتوسط) هيكل مفتش الأضداد 3D عبر طريقة الفرد الجسيمات التصوير المقطعي الإلكترون (IPET) (الشكل 4E - J) 5. تم الإبلاغ عن وصف مفصل لاستراتيجية IPET إعادة الإعمار، والمنهجية، خطوة بخطوة العمليات وتحليل التباين الهيكلي سابقا 4. وكان فيلم عن إجراءات إعادة الإعمار IPET الأجسام المضادة، بما في ذلك الصور الخام والنتائج الوسيطة، خريطة كثافة 3D والالتحام الهيكلي أيضا متاحة للجمهور من خلال تحميلها على موقع يوتيوب 5. مقارنة بين إعادة البناء 3D مختلفة من الأجسام المضادة الجزيئات الفردية يمكن أن تكشف ديناميات البروتين وجالتغييرات onformational خلال التفاعلات الكيميائية 4،5. وبالنظر إلى أن أكثر من 50٪ من البروتينات لها الكتلة الجزيئية التي تتراوح 40-200 كيلو دالتون 1،2، يدل على نجاح في تصوير هذه البروتينات الصغيرة التي طريقة OpNS هو أداة مفيدة لدفع EM الحدود التقليدية تجاه قرارات هيكلية صغيرة وغير المتماثلة والاكتشافات آلية . وبالتالي، يتم توفير بروتوكول مفصلة على النحو التالي.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1070">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:159px;">Company</td>
			<td style="width:137px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:547px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:228px;">Stain: Uranyl Formate</td>
			<td style="width:159px;">The SPI Supplies Division of Structure Probe, Inc.</td>
			<td style="width:137px;">02545-AA</td>
			<td>http://www.2spi.com/catalog/chem/Uranyl_Formate.shtml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">SYRINGE: 1ML NORM-JECT</td>
			<td style="width:159px;">VWR</td>
			<td style="width:137px;">89174-491</td>
			<td>https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=89174-491</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Syringe filter: 0.2 &#956;m&#160;</td>
			<td style="width:159px;">VWR</td>
			<td style="width:137px;">28145-487</td>
			<td>https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=28145-487</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:228px;">Syringe filter: 0.02 &#956;m filter (Anotop 10)</td>
			<td style="width:159px;">Whatman</td>
			<td style="width:137px;">6809-1002</td>
			<td>http://www.whatman.com/AnotopSyringeFilters.aspx</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:228px;">Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline</td>
			<td style="width:159px;">SIGMA-Aldrich</td>
			<td style="width:137px;">D8537</td>
			<td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/d8537?lang=en&#38;region=US</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Parafilm: 4 in. x 125 ft.</td>
			<td style="width:159px;">VWR</td>
			<td style="width:137px;">470152-246</td>
			<td>https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=WLS65710-A</td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:47px;width:228px;">Carbon film coated TEM grid: 300 mesh</td>
			<td style="width:159px;">Pacific Grid-Tech</td>
			<td style="width:137px;">Cu-300CN</td>
			<td>http://www.grid-tech.com/catalog.htm#1-thincarbon</td>
		</tr>
		<tr height="45">
			<td height="45" style="height:46px;width:228px;">Carbon film coated TEM grid: 200 mesh</td>
			<td style="width:159px;">EMS (Electro Microscopy Sciences)</td>
			<td style="width:137px;">CF200-Cu</td>
			<td>http://www.emsdiasum.com/microscopy/products/grids/support.aspx</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:228px;">Tweezer: Dumont Tweezer L5</td>
			<td style="width:159px;">EMS (Electro Microscopy Sciences)</td>
			<td style="width:137px;">72882-D</td>
			<td>http://www.emsdiasum.com/microscopy/products/tweezers/dumont_clamping.aspx#02-L5</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:228px;">Milli-Q Advantage A10 Ultrapure Water Purification System</td>
			<td style="width:159px;">EMD Millipore</td>
			<td style="width:137px;">Milli-Q Advantage A10</td>
			<td>http://www.millipore.com/catalogue/module.do?id=C10117</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Filter Paper: Grade 1 circles</td>
			<td style="width:159px;">Whatman</td>
			<td style="width:137px;">1001-090</td>
			<td>http://www.whatman.com/QualitativeFilterPapersStandardGrades.aspx</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Aluminum Foil</td>
			<td style="width:159px;">NA</td>
			<td style="width:137px;">NA</td>
			<td>Any type</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:228px;">Glow Discharge Unit</td>
			<td style="width:159px;">Ted Pella</td>
			<td style="width:137px;">91000</td>
			<td>http://www.tedpella.com/easiglow_html/Glow-Discharge-Cleaning-System.htm</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:228px;">Filter Tips: Low-Retention Aerosol Filter Tips for 10&#181;L Pipettors</td>
			<td style="width:159px;">VWR</td>
			<td style="width:137px;">89174-520</td>
			<td>https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=89174-520</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:228px;">Filter Tips: Low-Retention Aerosol Filter Tips for 40&#181;L Pipettors</td>
			<td style="width:159px;">VWR</td>
			<td style="width:137px;">89174-524</td>
			<td>https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=89174-524</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:228px;">Filter Tips: VWR Signature 200 &#181;L Pipet Tips</td>
			<td style="width:159px;">VWR</td>
			<td style="width:137px;">37001-528</td>
			<td>https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=37001-528</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:228px;">Pipet</td>
			<td style="width:159px;">Pipetman</td>
			<td style="width:137px;">F161201 and F167300</td>
			<td>http://www.pipetman.com/Pipettes/Single-Channel/PIPETMAN-Classic.aspx</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optimized negative staining: a high-throughput protocol for examining small and asymmetric protein structure by electron microscopy

تقرير الهيكلي من البروتينات وليس تحديا للبروتينات مع الجماهير الجزيئية بين 40-200 كيلو دالتون. وبالنظر إلى أن أكثر من نصف البروتينات الطبيعية لديهم الكتلة الجزيئية بين 40-200 كيلو دالتون 1،2، هناك حاجة إلى وسيلة قوية والإنتاجية العالية مع قدرة قرار نانومتر. تلطيخ السلبية (NS) المجهر الإلكتروني (EM) هو نهج سهلة وسريعة، والنوعي الذي كثيرا ما تستخدم في مختبرات الأبحاث لدراسة بنية البروتين والبروتين البروتين التفاعلات. للأسف، NS البروتوكولات التقليدية كثيرا ما تولد التحف الهيكلي على البروتينات، وخاصة مع البروتينات الدهنية التي تشكل عادة تقديم الأعمال الفنية النضائد. باستخدام صور من البروتينات الدهنية من البرد الإلكترون المجهري (البرد EM) كمعيار، تم فحص المعايير الرئيسية في NS ظروف التحضير عينة مؤخرا وتحدثت باسم NS بروتوكول الأمثل (OpNS)، والبروتوكول التقليدي NS تعديل 3. التحف مثل ريال عمانيuleaux يمكن الحد بشكل كبير من قبل OpNS، بالإضافة إلى توفير التباين العالي مع معقول عالية الدقة (بالقرب من 1 نانومتر) وصور للبروتينات صغيرة وغير المتماثلة. هذه الصور عالية الدقة وعالية التباين، بل هي مواتية للبروتين الفردي (كائن واحد، أي المتوسط) إعادة الإعمار 3D، مثل 160 كيلو دالتون الأجسام المضادة، من خلال طريقة التصوير المقطعي الإلكترون 4،5. وعلاوة على ذلك، يمكن أن تكون أداة OpNS الإنتاجية العالية لفحص مئات العينات من البروتينات الصغيرة. على سبيل المثال، تضمنت آلية المنشورة سابقا من 53 كيلو دالتون البروتين نقل الكوليسترول استر (CETP) الفحص والتصوير من مئات العينات 6. النظر في البرد EM نادرا بنجاح الصور البروتينات أقل من 200 كيلو دالتون له بعد نشر أي دراسة شملت فحص أكثر من مائة عينة الظروف، فمن الإنصاف أن يدعو OpNS طريقة الإنتاجية العالية لدراسة البروتينات الصغيرة. نأمل بروتوكول OpNS المعروضة هنا يمكن أن تكون أداة مفيدة لدفع حدود EM وتسريع الدراسات EM في هيكل بروتين صغير، وديناميات وآليات.

Watch this Scientific Journal Video about Optimized Negative Staining: a High-throughput Protocol for Examining Small and Asymmetric Protein Structure by Electron Microscopy at JoVE.com

Optimized Negative Staining: a High-throughput Protocol for Examining Small and Asymmetric Protein Structure by Electron Microscopy

أكثر من نصف البروتينات هي بروتينات صغيرة (الكتلة الجزيئية &lt;200 كيلو دالتون) التي تم تحدي لكل من الإلكترون التصوير المجهر وإعادة بناء ثلاثية الأبعاد. الأمثل تلطيخ السلبية هو بروتوكول قوية وعالية الإنتاجية للحصول على صور عالية التباين والبروتينات غير المتماثلة الصغيرة أو المجمعات تحت الظروف الفسيولوجية المختلفة مرتفعة نسبيا القرار (~ 1 نانومتر).

الأمثل تلطيخ سلبي: بروتوكول عالية الإنتاجية للدراسة صغيرة وغير المتناظر هيكل البروتين بواسطة المجهر الإلكتروني

Structural determination of proteins is rather challenging for proteins with molecular masses between 40 - 200 kDa. Considering that more than half of ...

optimized-negative-staining-high-throughput-protocol-for-examining

Research

JoVE Journal

Environment

43.1K Views.  The Molecular Foundry.  أكثر من نصف البروتينات هي بروتينات صغيرة (الكتلة الجزيئية 

Video: Optimized Negative Staining: a High-throughput Protocol for Examining Small and Asymmetric Protein Structure by Electron Microscopy

High-throughput Fluorometric Measurement of Potential Soil Extracellular Enzyme Activities

Microbes in soils and other environments produce extracellular enzymes to depolymerize and hydrolyze organic macromolecules so that they can be assimilated for energy and nutrients. Measuring soil microbial enzyme activity is crucial in understanding soil ecosystem functional dynamics. The general concept of the fluorescence enzyme assay is that synthetic C-, N-, or P-rich substrates bound with a fluorescent dye are added to soil samples. When intact, the labeled substrates do not fluoresce. Enzyme activity is measured as the increase in fluorescence as the fluorescent dyes are cleaved from their substrates, which allows them to fluoresce. Enzyme measurements can be expressed in units of molarity or activity. To perform this assay, soil slurries are prepared by combining soil with a pH buffer. The pH buffer (typically a 50 mM sodium acetate or 50 mM Tris buffer), is chosen for the buffer&#39;s particular acid dissociation constant (pKa) to best match the soil sample pH. The soil slurries are inoculated with a nonlimiting amount of fluorescently labeled (i.e. C-, N-, or P-rich) substrate. Using soil slurries in the assay serves to minimize limitations on enzyme and substrate diffusion. Therefore, this assay controls for differences in substrate limitation, diffusion rates, and soil pH conditions; thus detecting potential enzyme activity rates as a function of the difference in enzyme concentrations (per sample).
Fluorescence enzyme assays are typically more sensitive than spectrophotometric (i.e. colorimetric) assays,&#160;but can suffer from interference caused by impurities and the instability of many fluorescent compounds when exposed to light; so caution is required when handling fluorescent substrates. Likewise, this method only assesses potential enzyme activities under laboratory conditions when substrates are not limiting. Caution should be used when interpreting the data representing cross-site comparisons with differing temperatures or soil types, as in situ soil type and temperature can influence enzyme kinetics.

To measure potential rates of soil extracellular enzyme activities, synthetic substrates that are bound to a fluorescent dye are added to soil samples. Enzyme activity is measured as the fluorescent dye is released from the substrate by an enzyme-catalyzed reaction, where higher fluorescence indicates more substrate degradation.

الإنتاجية العالية فلوروميتريك قياس التربة المحتملة خارج الخلية أنزيم الأنشطة

Microbes in soils and other environments produce extracellular enzymes to depolymerize and hydrolyze organic macromolecules so that they can be ...

Experimental Protocol for Manipulating Plant-induced Soil Heterogeneity

Coexistence theory has often treated environmental heterogeneity as being independent of the community composition; however biotic feedbacks such as plant-soil feedbacks (PSF) have large effects on plant performance, and create environmental heterogeneity that depends on the community composition. Understanding the importance of PSF for plant community assembly necessitates understanding of the role of heterogeneity in PSF, in addition to mean PSF effects. Here, we describe a protocol for manipulating plant-induced soil heterogeneity. Two example experiments are presented: (1) a field experiment with a 6-patch grid of soils to measure plant population responses and (2) a greenhouse experiment with 2-patch soils to measure individual plant responses. Soils can be collected from the zone of root influence (soils from the rhizosphere and directly adjacent to the rhizosphere) of plants in the field from conspecific and heterospecific plant species. Replicate collections are used to avoid pseudoreplicating soil samples. These soils are then placed into separate patches for heterogeneous treatments or mixed for a homogenized treatment. Care should be taken to ensure that heterogeneous and homogenized treatments experience the same degree of soil disturbance. Plants can then be placed in these soil treatments to determine the effect of plant-induced soil heterogeneity on plant performance. We demonstrate that plant-induced heterogeneity results in different outcomes than predicted by traditional coexistence models, perhaps because of the dynamic nature of these feedbacks. Theory that incorporates environmental heterogeneity influenced by the assembling community and additional empirical work is needed to determine when heterogeneity intrinsic to the assembling community will result in different assembly outcomes compared with heterogeneity extrinsic to the community composition.

Understanding the role of environmental heterogeneity in species coexistence has typically focused on types of heterogeneity that are extrinsic to the community&#8217;s species composition. We provide novel detailed methods for creating soil heterogeneity treatments using soils subject to plant-soil feedback conditioning, or heterogeneity intrinsic to the community composition.

بروتوكول التجريبية لالناجم عن النبات والتلاعب التجانس التربة

Coexistence theory has often treated environmental heterogeneity as being independent of the community composition; however biotic feedbacks such as ...

Multimodal Optical Microscopy Methods Reveal Polyp Tissue Morphology and Structure in Caribbean Reef Building Corals

An integrated suite of imaging techniques has been applied to determine the three-dimensional (3D) morphology and cellular structure of polyp tissues comprising the Caribbean reef building corals Montastraeaannularis and M. faveolata. These approaches include fluorescence microscopy (FM), serial block face imaging (SBFI), and two-photon confocal laser scanning microscopy (TPLSM). SBFI provides deep tissue imaging after physical sectioning; it details the tissue surface texture and 3D visualization to tissue depths of more than 2 mm. Complementary FM and TPLSM yield ultra-high resolution images of tissue cellular structure. Results have: (1) identified previously unreported lobate tissue morphologies on the outer wall of individual coral polyps&#160;and (2) created the first surface maps of the 3D distribution and tissue density of chromatophores and algae-like dinoflagellate zooxanthellae endosymbionts. Spectral absorption peaks of 500 nm and 675 nm, respectively, suggest that M. annularis and M. faveolata contain similar types of chlorophyll and chromatophores. However, M. annularis and M. faveolata exhibit significant differences in the tissue density and 3D distribution of these key cellular components. This study focusing on imaging methods indicates that SBFI is extremely useful for analysis of large mm-scale samples of decalcified coral tissues. Complimentary FM and TPLSM reveal subtle submillimeter&#160;scale changes in cellular distribution and density in nondecalcified coral tissue samples. The TPLSM technique affords: (1) minimally invasive sample preparation,&#160;(2) superior optical sectioning ability,&#160;and (3) minimal light absorption and scattering, while still permitting deep tissue imaging.

An integrated suite of imaging techniques has been applied to determine polyp morphology and tissue structure in the Caribbean corals Montastraeaannularis and M. faveolata. Fluorescence, serial block face,&#160;and two-photon confocal laser scanning microscopy have identified lobate structure, polyp walls, and estimated chromatophore and zooxanthellae densities and distributions.

المتعدد الوسائط البصرية الميكروسكوب طرق كشف ورم الأنسجة الصرف والبنية في منطقة البحر الكاريبي المرجانية بناء المرجان

An integrated suite of imaging techniques has been applied to determine the three-dimensional (3D) morphology and cellular structure of polyp tissues ...

Semi-High Throughput Screening for Potential Drought-tolerance in Lettuce (Lactuca sativa) Germplasm Collections

This protocol describes a method by which a large collection of the leafy green vegetable lettuce (Lactuca sativa L.) germplasm was screened for likely drought-tolerance traits. Fresh water availability for agricultural use is a growing concern across the United States as well as many regions of the world. Short-term drought events along with regulatory intervention in the regulation of water availability coupled with the looming threat of long-term climate shifts that may lead to reduced precipitation in many important agricultural regions has increased the need to hasten the development of crops adapted for improved water use efficiency in order to maintain or expand production in the coming years. This protocol is not meant as a step-by-step guide to identifying at either the physiological or molecular level drought-tolerance traits in lettuce, but rather is a method developed and refined through the screening of thousands of different lettuce varieties. The nature of this screen is based in part on the streamlined measurements focusing on only three water-stress indicators: leaf relative water content, wilt, and differential plant growth following drought-stress. The purpose of rapidly screening a large germplasm collection is to narrow the candidate pool to a point in which more intensive physiological, molecular, and genetic methods can be applied to identify specific drought-tolerant traits in either the lab or field. Candidates can also be directly incorporated into breeding programs as a source of drought-tolerance traits.

Semi-High Throughput Screening for Potential Drought-tolerance in Lettuce Lactuca sativa Germplasm Collections

This protocol was developed to screen a large germplasm collection of the leafy vegetable lettuce (Lactuca sativa L.) for drought-tolerance, in order to identify a small candidate pool of lettuce for use in physiological, molecular, and genetic studies to identify underlying drought-tolerance traits along with breeding programs.

شبه عالية الإنتاجية لفحص إمكانية الجفاف التسامح في الخس (<em&gt; خس ساتيفا</em&gt;) مجموعات الأصول الوراثية

This protocol describes a method by which a large collection of the leafy green vegetable lettuce (Lactuca sativa L.) germplasm was screened for likely ...

High-throughput Screening of Recalcitrance Variations in Lignocellulosic Biomass: Total Lignin, Lignin Monomers, and Enzymatic Sugar Release

The conversion of lignocellulosic biomass to fuels, chemicals, and other commodities has been explored as one possible pathway toward reductions in the use of non-renewable energy sources. In order to identify which plants, out of a diverse pool, have the desired chemical traits for downstream applications, attributes, such as cellulose and lignin content, or monomeric sugar release following an enzymatic saccharification, must be compared. The experimental and data analysis protocols of the standard methods of analysis can be time-consuming, thereby limiting the number of samples that can be measured. High-throughput (HTP) methods alleviate the shortcomings of the standard methods, and permit the rapid screening of available samples to isolate those possessing the desired traits. This study illustrates the HTP sugar release and pyrolysis-molecular beam mass spectrometry pipelines employed at the National Renewable Energy Lab. These pipelines have enabled the efficient assessment of thousands of plants while decreasing experimental time and costs through reductions in labor and consumables.

Plant cell wall structure and chemistry traits are evaluated to identify ideal feedstocks for biofuels and bio-materials. Standard methods have limitations when applied to large data sets. These high-throughput pretreatment, enzyme saccharification, and pyrolysis-molecular beam mass spectrometry methods compare large numbers of biomass samples with decreased experimental time and cost.

الإنتاجية العالية فحص الاختلافات الإستعصاء في Lignocellulosic الكتلة الحيوية: إجمالي اللجنين، اللجنين مونمرات، والأنزيمية السكر الإصدار

The conversion of lignocellulosic biomass to fuels, chemicals, and other commodities has been explored as one possible pathway toward reductions in the ...

Administering and Detecting Protein Marks on Arthropods for Dispersal Research

Monitoring arthropod movement is often required to better understand associated population dynamics, dispersal patterns, host plant preferences, and other ecological interactions. Arthropods are usually tracked in nature by tagging them with a unique mark and then re-collecting them over time and space to determine their dispersal capabilities. In addition to actual physical tags, such as colored dust or paint, various types of proteins have proven very effective for marking arthropods for ecological research. Proteins can be administered internally and/or externally. The proteins can then be detected on recaptured arthropods with a protein-specific enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Here we describe protocols for externally and internally tagging arthropods with protein. Two simple experimental examples are demonstrated: (1) an internal protein mark introduced to an insect by providing a protein-enriched diet and (2) an external protein mark topically applied to an insect using a medical nebulizer. We then relate a step-by-step guide of the sandwich and indirect ELISA methods used to detect protein marks on the insects. In this demonstration, various aspects of the acquisition and detection of protein markers on arthropods for mark-release-recapture, mark-capture, and self-mark-capture types of research are discussed, along with the various ways that the immunomarking procedure has been adapted to suit a wide variety of research objectives.

Proteins are often used to mark arthropods for dispersal research. Methods for administering internal and external protein marks on arthropods are demonstrated. Protein mark detection techniques, either through indirect or sandwich enzyme-linked immunosorbent assays (ELISAs), are also illustrated.

إدارة والكشف عن علامات البروتين على المفصليات للبحوث تشتت

Monitoring arthropod movement is often required to better understand associated population dynamics, dispersal patterns, host plant preferences, and other ...

A Push-pull Protocol to Reduce Colonization of Bird Nest Boxes by Honey Bees

Introduction of the invasive Africanized honey bee (AHB) into the Neotropics is a serious problem for many cavity nesting birds, specifically parrots. These bees select cavities that are suitable nest sites for birds, resulting in competition. The difficulty of removing bees and their defensive behavior makes a prevention protocol necessary. Here, we describe a push-pull integrated pest management protocol to deter bees from inhabiting bird boxes by applying a bird safe insecticide, permethrin, to repel bees from nest boxes, while simultaneously attracting them to pheromone-baited swarm traps. Shown here is an example experiment using Barn Owl nest boxes. This protocol successfully reduced colonization of Barn Owl nest boxes by Africanized honey bees. This protocol is flexible, allowing adjustments to accommodate a wide range of bird species and habitats. This protocol could benefit conservation efforts where AHB are located.

Preventing colonization of bird nest boxes by invasive Africanized honey bees is important for conservation efforts of nest-site limited birds. We provide an integrated pest management approach to &#34;push&#34; bees away from nest boxes with a repellant insecticide, permethrin, and &#34;pull&#34; them toward pheromone baited swarm traps.

بروتوكول دفع سحب للحد من استعمار الطيور صناديق عش من عسل النحل

Introduction of the invasive Africanized honey bee (AHB) into the Neotropics is a serious problem for many cavity nesting birds, specifically parrots. ...

A Protocol for Collecting and Constructing Soil Core Lysimeters

Leaching of nutrients from land applied fertilizers and manure used in agriculture can lead to accelerated eutrophication of surface water. Because the landscape has complex and varied soil morphology, an accompanying disparity in flow paths for leachate through the soil macropore and matrix structure is present. The rate of flow through these paths is further affected by antecedent soil moisture. Lysimeters are used to quantify flow rate, volume of water and concentration of nutrients leaching downward through soils. While many lysimeter designs exist, accurately determining the volume of water and mass balance of nutrients is best accomplished with bounded lysimeters that leave the natural soil structure intact. 
Here we present a detailed method for the extraction and construction of soil core lysimeters equipped with soil moisture sensors at 5 cm and 25 cm depths. Lysimeters from four different Coastal Plain soils (Bojac, Evesboro, Quindocqua and Sassafras) were collected on the Delmarva Peninsula and moved to an indoor climate controlled facility. Soils were irrigated once weekly with the equivalent of 2 cm of rainfall to draw down soil nitrate-N concentrations. At the end of the draw down period, poultry litter was applied (162 kg TN ha-1) and leaching was resumed for an additional five weeks. Total recovery of applied irrigation water varied from 71% to 85%. Nitrate-N concentration varied over the course of the study from an average of 27.1 mg L-1 before litter application to 40.3 mg L-1 following litter application. While greatest flux of nutrients was measured in soils dominated by coarse sand (Sassafras) the greatest immediate flux occurred from the finest textured soil with pronounced macropore development (Quindocqua).

A detailed method for extraction and assembly of intact soil core lysimeters and their use for study of leachate and associated loss of nutrients from surface applied poultry litter is demonstrated.

بروتوكول لجمع وبناء Lysimeters الأساسية التربة

Leaching of nutrients from land applied fertilizers and manure used in agriculture can lead to accelerated eutrophication of surface water. Because the ...

High-throughput, Microscale Protocol for the Analysis of Processing Parameters and Nutritional Qualities in Maize (Zea mays L.)

Maize is an important grain crop in the United States and worldwide. However, maize grain must be processed prior to human consumption. Furthermore, whole grain composition and processing characteristics vary among maize hybrids and can impact the quality of the final processed product. Therefore, in order to produce healthier processed food products from maize, it is necessary to know how to optimize processing parameters for particular sets of germplasm to account for these differences in grain composition and processing characteristics. This includes a better understanding of how current processing techniques impact the nutritional quality of the final processed food product. Here, we describe a microscale protocol that both simulates the processing pipeline to produce cornflakes from large flaking grits and allows for the processing of multiple grain samples simultaneously. The flaking grits, the intermediate processed products, or final processed product, as well as the corn grain itself, can be analyzed for nutritional content as part of a high-throughput analytical pipeline. This procedure was developed specifically for incorporation into a maize breeding research program, and it can be modified for other grain crops. We provide an example of the analysis of insoluble-bound ferulic acid and p-coumaric acid content in maize. Samples were taken at five different processing stages. We demonstrate that sampling can take place at multiple stages during microscale processing, that the processing technique can be utilized in the context of a specialized maize breeding program, and that, in our example, most of the nutritional content was lost during food product processing.

High-throughput, Microscale Protocol for the Analysis of Processing Parameters and Nutritional Qualities in Maize Zea mays L.

Here, we present a microscale protocol for processing grain samples and for incorporating this microscale approach into a high-throughput analytical pipeline. This is a higher throughput adaptation of currently available protocols.

الفائق، بروتوكول Microscale لتحليل المعالجة البارامترات والصفات الغذائية في الذرة (ميس زيا ل.)

Maize is an important grain crop in the United States and worldwide. However, maize grain must be processed prior to human consumption. Furthermore, whole ...

A 3-dimensional (3D)-printed Template for High Throughput Zebrafish Embryo Arraying

The zebrafish is a globally recognized fresh water organism frequently used in developmental biology, environmental toxicology, and human disease related research fields. Thanks to its unique features, including large fecundity, embryo translucency, rapid and simultaneous development, etc., zebrafish embryos are often used for large scale toxicity assessment of chemicals and drug/compound screening. A typical screening procedure involves adult zebrafish spawning, embryos selection, and arraying the embryos into multi-well plates. From there, embryos are subjected to exposure and the toxicity of chemical, or the effectiveness of the drugs/compounds can be evaluated relatively quickly based on phenotypic observations. Among these processes, embryos arraying is one of the most time-consuming and labor-intensive steps that limits the throughput level. In this protocol, we present an innovative approach that makes use of a 3D-printed arraying template coupled with vacuum manipulation to speed up this laborious step. The protocol herein describes the overall design of the arraying template, a detailed experimental setup and step-by-step procedure, followed by representative results. When implemented, this approach should prove beneficial in a variety of research applications using zebrafish embryos as testing subjects.

A 3-dimensional 3D-printed Template for High Throughput Zebrafish Embryo Arraying

Here, we present a protocol to design and fabricate a zebrafish embryo arraying template, followed by a detailed procedure on the use of such template for high throughput zebrafish embryo arraying into a 96-well plate.

3-الأبعاد (3D)--طباعة قالب للجنين الزرد الإنتاجية العالية أرايينج

The zebrafish is a globally recognized fresh water organism frequently used in developmental biology, environmental toxicology, and human disease related ...