نشكر جانيس فيشر لتوفير البلازميد UAS-EGFP :: MSP-300 KASH. تم الحصول على الضد mAB24B10 من دراسات البنك التنموي ورم هجين وضعت تحت إشراف معاهد الصحة القومية والتي تحتفظ بها جامعة ولاية ايوا، قسم الأحياء. تم الحصول على الأوراق المالية الريبو-GAL4 (BL7415) من مركز بلومينغتون الأسهم في جامعة إنديانا. بدعم من جمعية السرطان الأمريكية المؤسسية بحوث غرانت (IRG # 58-006-53) لمركز جامعة بوردو لأبحاث السرطان هو اعترف بامتنان. ويدعم Jingqun ما قبل البحوث الزراعية في جامعة بوردو في مساعدة مالية للأغذية والزراعة من جامعة بوردو.

1. جيل وتوصيف EGFP :: KASH ذبابة الفاكهة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> السائق عبر GAL4 تسير رحلات الى UAS-EGFP :: MSP-300 KASH الذباب. بدلا من ذلك، يمكن أن تتولد الذباب المؤتلف التي تحمل كل من السائق GAL4 والتحوير UAS-EGFP :: MSP-300 KASH باستخدام تقنيات وراثية القياسية. هذا النهج الثاني هو مفيد إذا كانت هناك حاجة أعداد كبيرة من النسل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تميز تعبير عن علامة EGFP :: KASH باستخدام تقنيات المجهر القياسية. ملاحظة: EGFP التعبير يمكن ملاحظتها بواسطة تقنيات المجهر القياسية في تشريح ثابتة الأنسجة ذبابة الفاكهة، أو في اليرقات كله، و لا يتطلب استخدام الأجسام المضادة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد نمط التعبير عن EGFP :: KASH علامة في الكائن الحي بأكمله تحت المجهر مضان تشريح (انظر المواد PDF). ملاحظة: العديد من السائقين GAL4، بما في ذلك السائق الريبو-GAL4 هو مبين في الشكل 1، ن المعرضأنماط onspecific التعبير في أنسجة اليرقات الأخرى مثل الغدة اللعابية (انظر نتائج). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحليل نمط التعبير EGFP :: KASH في الأنسجة تشريح ذات الاهتمام باستخدام متحد البؤر المجهري. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إصلاح الأنسجة من الاهتمام باستخدام الفورمالدهيد بتركيز نهائي من 4٪، والحمض النووي وصمة عار باستخدام دابي في تركيز النهائي من 0.1 ميكروغرام / مل لتصور توطين EGFP :: KASH العلامة نسبة إلى الحمض النووي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحصول على الصور باستخدام إما الهدف 40X / 1.30 النفط الغمر أو الهدف 20X / 0.75 الغمر النفط، وهذا يتوقف على حجم الأنسجة من الاهتمام. الشروط الإثارة / الانبعاثات التالية يمكن استخدامها لالتقاط صور: 408 nm/425-475 نانومتر (دابي)؛ 488 نانومتر / 525-550 نانومتر (GFP). </li></ol></li></ol></li></ol> 2. عزل النواة من ذبابة الفاكهة اليرقات الأنسجة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد المعدات اللازمة لتشريح الأنسجة اليرقات والعزلة نوى اللاحقة. لاحظ أنويمكن أيضا أن تستخدم الأجنة dechorionated كله في بدء المواد اذا شئت. فمن المستحسن أن استخدام أنسجة اليرقات تشريح جزئيا بدلا من اليرقات بأكمله إذا كان نوع من الخلايا في المصالح موجود في الأنسجة محددة مثل القرص تخيلي. هذا يقلل غير محددة ملزمة، وكذلك يلغي المشاكل التي يمكن أن تسببها التعبير عن بعض السائقين GAL4 في الخلايا غير المستهدفة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد اثنين من أزواج من ملقط حاد (انظر المواد PDF)، واحدة siliconized 9 جيدا لوحة من الزجاج (انظر المواد PDF)، وPBT (1X PBS، ودرجة الحموضة 7.4؛ 0.1٪ توين 20). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Prebind الأجسام المضادة GFP إلى حبات المغناطيسي. يجب أن تبدأ هذه الخطوة قبل البدء في تشريح. إضافة 10 ميكرولتر من الخرز المغناطيسي (إينفيتروجن، انظر المواد PDF) و 2 ميكروغرام من GFP الضد (روش، انظر المواد PDF) إلى 400 ميكرولتر من غسل العازلة (1X PBS، ودرجة الحموضة 7.4؛ 2.5 ملي MgCl 2) في أنبوب 1.5 مل . كمية من الخرز والأجسام المضادة المستخدمة يمكن أن يكون الأمثل إذا لزم الأمر على أساس كمية من الهدف في سامالتنوير القائل وتقارب ملزم من الأجسام المضادة إلى الخرز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان حبات والأجسام المضادة مع دوران لا يقل عن 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع أنبوب 1.5 مل يحتوي على الخرز والأجسام المضادة في رف المغناطيسي (انظر المواد PDF) والسماح حبات لربط المغناطيسي لحوالي 1-2 دقائق. إزالة طاف يحتوي على الأجسام المضادة غير منضم وغسل العازلة باستخدام ماصة 1 مل. ستظل منضمة إلى حبات جدار أنبوب 1.5 مل على الجانب المجاور إلى المغناطيس. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شطف حبات مرتين مع 1 مل من غسل العازلة في كل مرة كما هو موضح في القسم 2.1.4. إزالة أنبوب 1.5 مل من رف وعكس المغناطيسية لفترة وجيزة لمزج الخرز وغسل العازلة خلال كل خطوة الغسيل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخزين حبات محددة الأجسام المضادة في غسل العازلة حتى على استعداد لمواصلة الخطوة 2.7. لا ينبغي أن يسمح حبات لتجف في أي مرحلة من البروتوكول. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تشريح الأنسجة اليرقات في PBT ونقل الأنسجة تشريح لكذلك واحدة من الطبق 9 جيدا. عادة، تشريح الفص البصري والعين القرص تخيلي من 100 يرقات العمر الثالث يوفر مادة كافية لتحليل التعبير الجيني المصب التالية العزلة نوى. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شطف الأنسجة المعزولة في استخراج العازلة النووية (10 ملي HEPES-كوه، ودرجة الحموضة 7.5؛ 2.5 ملي MgCl 2 و 10 ملي بوكل) في أنبوب 1.5 مل. نقل أنسجة اليرقات معزولة إلى 1 مل الخالط Dounce (انظر المواد PDF) على الجليد يحتوي على 1 مل من العازلة استخراج نووية جديدة. احتضان على الجليد لمدة 5 دقائق. فإنه ليس من الضروري إضافة مثبطات الأنزيم البروتيني إذا RNA هو استخراجها التالية العزلة نوى. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعطيل الأنسجة بنسبة 20 السكتات الدماغية مع مدقة فضفاضة وثم احتضان العينة على الجليد لمدة 10 دقيقة للسماح للخلايا لتنتفخ. استخراج النواة من الخلايا باستخدام 15 السكتات الدماغية مع مدقة ضيقة. يحتاج عدد من السكتات الدماغية مع المطاحن فضفاضة وضيقة ليكون الأمثل لأنسجة مختلفة وأنواع الخلايا؛ التجانس الزائد يمكن أن يؤدي إلىالمنفصمة النوى، في حين أن عدم كفاية التجانس لا استخراج كافة النوى من الأنسجة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد جناسة، الذي يحتوي على نواة والحطام الخلوية، من خلال 40 ميكرون مسام الحجم مصفاة (انظر المواد PDF) التي تم prerinsed مع العازلة التجانس النووية. جمع جناسة تصفيتها في أنبوب جديد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع عينات ما قبل العزلة لتحليلها لاحقا لتحديد العائد النوى، نوى النزاهة، وتحديد مستويات النص من الجينات المستهدفة قبل النوى العزلة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل 50 ميكرولتر من جناسة تصفيتها إلى الطازجة أنبوب 1.5 مل باستخدام ماصة. هذا هو نموذج ما قبل العزلة. إضافة 500 ميكرولتر من كاشف Trizol (انظر المواد PDF، تنبيه)، قلب لخلط، وتخزينها في -20 درجة مئوية لعزل الحمض النووي الريبي لاحقة (الخطوة 3.1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل 20 ميكرولتر من جناسة تصفيتها إلى الطازجة 1.5 مل أنبوب. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة دابي لتركيز النهائي من 0.1 ميكروغرام / مل، والمؤتمر الوطني العراقيعينة أوباتي على الجليد لمدة 10 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل نوى دابي الملون إلى ساترة المغلفة بولي يسين، ووضع على شريحة المجهر. ختم ساترة باستخدام طلاء الأظافر واضحة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التحقق من سلامة نوى، وجود نواة GFP الموسومة ذات الاهتمام باستخدام المجهر الفلورسنت. ملاحظة: ليس من الضروري لإصلاح نوى، أو وصمة عار لGFP إذا تم تحليل هذه الشرائح بسرعة معقولة التالية إعداد (في غضون 24 ساعة). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل 10 ميكرولتر من جناسة تصفيتها إلى الطازجة 1.5 مل أنبوب وإضافة 90 ميكرولتر من غسل العازلة (1X PBS، ودرجة الحموضة 7.4؛ 2.5 ملي MgCl 2). إضافة دابي لتركيز النهائي من 0.1 ميكروغرام / مل، واحتضان على الجليد لمدة 10 دقيقة. تحديد العائد نوى في العينة قبل العزل باستخدام عدادة الكريات لحساب نوى-دابي إيجابية باستخدام epifluorescence تحت هدف الهواء 10X. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع أنبوب 1.5 مل تحتوي على حبات محددة الأجسام المضادة (المعد في القسم 2.1.6) في رفوف المغناطيسي،وتسمح حبات مغناطيسية لربط المغناطيس لمدة 2 دقيقة على الأقل كما هو موضح في القسم 2.1.4. إزالة غسل العازلة من الخرز محددة الأجسام المضادة باستخدام ماصة 1 مل، وإضافة جناسة تصفيتها من الخطوة 2.5 إلى أنبوب 1.5 مل باستخدام ماصة 1 مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عكس بلطف الأنبوب عدة مرات لخلط، واحتضان عند 4 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة مع نهاية الإفراط في نهاية الانفعالات. تجنب فقاعات في أنبوب إذا كان ذلك ممكنا لأن هذه يمكن أن يؤدي إلى تراكمها من نوى. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع أنبوب 1.5 مل تحتوي على حبات محددة الأجسام المضادة وجناسة في رفوف المغناطيسي، والسماح حبات مغناطيسية لربط المغناطيس لمدة 2 دقيقة على الأقل كما هو موضح في القسم 2.1.4. إزالة جناسة تحتوي على جزء نوى غير منضم باستخدام ماصة 1 مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل العينة 3X مع 1 مل من غسل العازلة في كل مرة. إزالة أنبوب 1.5 مل تحتوي على الخرز، ونوى ملزمة وغسل العازلة من رف وعكس لخلط عدة مرات، ثم وضع أنبوب في رف المغناطيسي كما هو موضحفي الخطوة 2.9 وإزالة طاف باستخدام ماصة 1 مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 150 ميكرولتر من غسل العازلة إلى الخرز، والتي ينبغي أن تكون ملزمة لنواة الهدف. هذا هو نموذج آخر العزلة. تحضير عينات للتحليل المجهري واستخراج الحمض النووي الريبي لاحقة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل 20 ميكرولتر من العينة آخر العزلة إلى أنبوب 1.5 مل الطازجة وصمة عار مع دابي وتحليل كما هو موضح في القسم 2.6.2. عد GFP + / + دابي وGFP-/DAPI + نوى استولت عليها حبات مغناطيسية لتحديد نقاء GFP + نوى التخصيب في عينة آخر العزلة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 1 مل من كاشف Trizol إلى ما تبقى من العينة آخر العزلة، عكس لخلط، وتخزينها في -20 درجة مئوية لعزل الحمض النووي الريبي لاحقة (الخطوة 3.1). ملاحظة: يمكن تخزين العينات في Trizol لعدة أسابيع إذا لزم الأمر في -20 درجة مئوية. فإنه ليس من الضروري أزل النوى من حبات مغناطيسية قبل استخراج الحمض النووي الريبي باستخدام Trizol كاشف، becausه حبات لا تتداخل مع عزل الحمض النووي الريبي لاحقة. </li></ol></li></ol> 3. تحديد مستويات النص في النواة المعزولة من اليرقات الأنسجة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عزل الحمض النووي الريبي من قبل العزلة والعزلة آخر عينات أعدت في الأقسام 2.6.1 و2.11.2 باستخدام بروتوكول قياسي لاستخراج الحمض النووي الريبي وصفت مقرها Trizol (انظر المواد PDF) مع إجراء التعديلات التالية: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد هطول الأمطار من بيليه الحمض النووي الريبي، إضافة 19.2 ميكرولتر من ريبونوكلياز خالية من المياه و 0.8 ميكرولتر من كاشف RNASecure (انظر المواد PDF) لبيليه واحتضان عند 60 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة إلى تعطيل RNAses. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد تركيز الحمض النووي الريبي مع صبغة الفلورسنت الحمض النووي الريبي ملزمة مثل مجموعة RNA و qubit فحص (انظر المواد PDF) باستخدام QubitR 2.0 التألق التالية بروتوكول الشركة المصنعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> توليف [كدنا] باستخدام الناسخ العكسي تضخيم مثل EpiScrIPT عكسي عدة الناسخ والاشعال oligodT باتباع إرشادات الشركة المصنعة. ملاحظة: عادة، و 50 إلى 100 نانوغرام من الحمض النووي الريبي [كدنا] يولد كافية لإجراء تحليلات متعددة التعبير الجيني. المبالغ المعادلة من قبل العزلة والعزلة RNA آخر ينبغي أن تستخدم لتوليد [كدنا]. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 180 ميكرولتر من nuclease خالية من المياه لعينة [كدنا] 20 ميكرولتر لتمييع هذا 10 أضعاف قبل الوقت الحقيقي PCR الكمي (QPCR) التحليل. هذا التخفيف هو خطوة مهمة، وذلك لأن عينات [كدنا] مخفف يمكن أن تمنع QPCR. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد مزيج الرئيسي QPCR مع البلمرة وdNTPs، 4 pmoles كل من الأمام وعكس التمهيدي، تتكون مع الماء المعقم لحجم رد الفعل النهائي من 20 ميكرولتر. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تصميم الاشعال QPCR لاستهداف الجينات التي من المتوقع أن يتم التعبير عنها في نوع من الخلايا في المصالح، وفي المرحلة التنموية التي يتم جمعها الأنسجة. الاشعال تصميم لتمتد على إنترون إذا أمكن، بحيث الجيني وويمكن التمييز بين المنتجات [كدنا] PCR. ملاحظة: إذا كان الوضع التعبير الجيني من نوع الخلية المستهدفة غير معروف، الاشعال ضد EGFP، والتي ينبغي أن تتجلى على وجه التحديد في عدد السكان نوى الموسومة، ويمكن استخدامها لتحسين بروتوكول لنوع خلية معينة والأنسجة (الجدول 1). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد مستويات النص النسبية لكل الجينات في المصالح في عينات ما قبل وبعد العزلة العزلة من خلال المقارنة إلى سلسلة التخفيف من [كدنا] أعدت من النسيج كله. وينبغي تطبيع مستويات النص من الجينات المستهدفة لجين مرجعية مثل Rpl32 (أو يفضل العديد من الجينات المرجعية). </li></ol>

<ol>
	<li>Weake, V. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-transcription+initiation+function+of+the+ubiquitous+SAGA+complex+in+tissue-specific+gene+activation.">Post-transcription initiation function of the ubiquitous SAGA complex in tissue-specific gene activation.</a> Genes Dev. 25, 1499-1509 (2011).</li><li>Bonn, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+type-specific+chromatin+immunoprecipitation+from+multicellular+complex+samples+using+BiTS-ChIP.">Cell type-specific chromatin immunoprecipitation from multicellular complex samples using BiTS-ChIP.</a> Nat. Protoc. 7, 978-994 (2012).</li><li>Haenni, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+C.+elegans+intestinal+gene+expression+and+polyadenylation+by+fluorescence-activated+nuclei+sorting+and+3'-end-seq.">Analysis of C. elegans intestinal gene expression and polyadenylation by fluorescence-activated nuclei sorting and 3'-end-seq.</a> Nucleic Acids Res. 40, 6304-6318 (2012).</li><li>Barthelson, R. A., Lambert, G. M., Vanier, C., Lynch, R. M., Galbraith, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+the+contributions+of+the+nuclear+and+cytoplasmic+compartments+to+global+gene+expression+in+human+cells.">Comparison of the contributions of the nuclear and cytoplasmic compartments to global gene expression in human cells.</a> BMC Genom. 8, 340 (2007).</li><li>Zhang, C., Barthelson, R. A., Lambert, G. M., Galbraith, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+characterization+of+cell-specific+gene+expression+through+fluorescence-activated+sorting+of+nuclei.">Global characterization of cell-specific gene expression through fluorescence-activated sorting of nuclei.</a> Plant Physiol. 147, 30-40 (2008).</li><li>Deal, R. B., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+INTACT+method+for+cell+type-specific+gene+expression+and+chromatin+profiling+in+Arabidopsis+thaliana.">The INTACT method for cell type-specific gene expression and chromatin profiling in Arabidopsis thaliana.</a> Nat. Protoc. 6, 56-68 (2011).</li><li>Deal, R. B., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+gene+expression+and+chromatin+profiling+of+individual+cell+types+within+a+tissue.">A simple method for gene expression and chromatin profiling of individual cell types within a tissue.</a> Dev Cell. 18, 1030-1040 (2010).</li><li>Steiner, F. A., Talbert, P. B., Kasinathan, S., Deal, R. B., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-type-specific+nuclei+purification+from+whole+animals+for+genome-wide+expression+and+chromatin+profiling.">Cell-type-specific nuclei purification from whole animals for genome-wide expression and chromatin profiling.</a> Genom. Res. 22, 766-777 (2012).</li><li>Brand, A. H., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+gene+expression+as+a+means+of+altering+cell+fates+and+generating+dominant+phenotypes.">Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes.</a> Development. 118, 401-415 (1993).</li><li>Henry, G. L., Davis, F. P., Picard, S., Eddy, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+type-specific+genomics+of+Drosophila+neurons.">Cell type-specific genomics of Drosophila neurons.</a> Nucleic Acids res. 40, 9691-9704 (2012).</li><li>Starr, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KASH+and+SUN+proteins.">KASH and SUN proteins.</a> Curr Biol. 21, 414-415 (2011).</li><li>Fischer, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+klarsicht+has+distinct+subcellular+localization+domains+for+nuclear+envelope+and+microtubule+localization+in+the+eye.">Drosophila klarsicht has distinct subcellular localization domains for nuclear envelope and microtubule localization in the eye.</a> Genetics. 168, 1385-1393 (2004).</li><li>Patterson, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+functions+of+Klarsicht+and+nuclear+lamin+in+developmentally+regulated+nuclear+migrations+of+photoreceptor+cells+in+the+Drosophila+eye.">The functions of Klarsicht and nuclear lamin in developmentally regulated nuclear migrations of photoreceptor cells in the Drosophila eye.</a> Mol. Biol. Cell. 15, 600-610 (2004).</li><li>Yu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+KASH+domain+protein+MSP-300+plays+an+essential+role+in+nuclear+anchoring+during+Drosophila+oogenesis.">The KASH domain protein MSP-300 plays an essential role in nuclear anchoring during Drosophila oogenesis.</a> Dev. Biol. 289, 336-345 (2006).</li><li>Bischof, J., Maeda, R. K., Hediger, M., Karch, F., Basler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+transgenesis+system+for+Drosophila+using+germ-line-specific+phiC31+integrases.">An optimized transgenesis system for Drosophila using germ-line-specific phiC31 integrases.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 3312-3317 (2007).</li><li>Kracklauer, M. P., Banks, S. M., Xie, X., Wu, Y., Fischer, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+klaroid+encodes+a+SUN+domain+protein+required+for+Klarsicht+localization+to+the+nuclear+envelope+and+nuclear+migration+in+the+eye.">Drosophila klaroid encodes a SUN domain protein required for Klarsicht localization to the nuclear envelope and nuclear migration in the eye.</a> Fly. 1, 75-85 (2007).</li><li>Markstein, M., Pitsouli, C., Villalta, C., Celniker, S. E., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploiting+position+effects+and+the+gypsy+retrovirus+insulator+to+engineer+precisely+expressed+transgenes.">Exploiting position effects and the gypsy retrovirus insulator to engineer precisely expressed transgenes.</a> Nat. Genet. 40, 476-483 (2008).</li><li>Sepp, K. J., Schulte, J., Auld, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripheral+glia+direct+axon+guidance+across+the+CNS/PNS+transition+zone.">Peripheral glia direct axon guidance across the CNS/PNS transition zone.</a> Dev. Biol. 238, 47-63 (2001).</li><li>Fujita, S. C., Zipursky, S. L., Benzer, S., Ferrus, A., Shotwell, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monoclonal+antibodies+against+the+Drosophila+nervous+system.">Monoclonal antibodies against the Drosophila nervous system.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 79, 7929-7933 (1982).</li></ol>

والكتاب ليس لديهم ما يكشف.

هذا البروتوكول يمكن استخدامها لعزل أو إثراء للغاية على وجه التحديد نوى الموسومة من السكان الخلية المختلطة في ذبابة الفاكهة أو الأنسجة الجنينية اليرقات. باستخدام هذا البروتوكول، يمكن عزل نواة من أنسجة تشريح في حوالي 1 ساعة. يجب تحديد نقاء والعائد من النوى معزولة...

الأنسجة ذبابة الفاكهة مثل الجهاز العصبي المركزي تحتوي على خليط معقد من أنواع الخلايا. وبالتالي، لتحليل خلية محددة ملامح التعبير الجيني من الأنسجة ذبابة الفاكهة، فمن الضروري أولا لعزل السكان متجانسة من خلايا معينة بكميات كافية لتمكين التطبيقات المصب. وتشمل وسائل لعزل الخلايا من أنسجة سليمة تسليخ مجهري ليزر، والخلية مضان تنشيط الفرز (FACS) من الخلايا بأكملها. بينما نظام مراقبة الأصول الميدانية قد استخدمت لعزل الخلايا ونوى من أجنة ذبابة الفاكهة وانواع معينة ايليجانس من لونين والتعبير الجيني التنميط 1-3، ونظام مراقبة الأصول الميدانية تسليخ مجهري ليزر يمكن أن يكون صعبا لتنفيذ بنجاح في الأنسجة التي تحتوي على أنواع الخلايا تتشابك غاية أو أن الخلايا تحتوي على مع مورفولوجيا غير النظامية، مثل الخلايا العصبية. للتغلب على هذه الصعوبة، بدلا من نوى الخلايا يمكن أن تكون معزولة عن أنواع معينة من الخلايا واستخدامها لاحقا الجنراله التنميط التعبير. الأهم من ذلك، مرنا تحليل التعبير المستندة ميكروأري باستخدام عينات الحمض النووي الريبي النووي تظهر نتائج مماثلة عموما مع أن تنفيذها باستخدام الحمض النووي الريبي مجموع 4 و 5. وعلاوة على ذلك، وتحليل التعبير الجيني باستخدام الحمض النووي الريبي النووي وقد استخدم بنجاح لدراسة التعبير الجيني في الكائنات متعددة بما في ذلك C. ايليجانس، نبات الأرابيدوبسيس thaliana، ذبابة الفاكهة، والبشر 4، 5 2، 3. وقد تم مؤخرا وصفت عدة طرق لعزل السكان محددة من النوى وصفت من الأنسجة ذبابة الفاكهة التي هي مناسبة لتحليل التعبير الجيني و / أو لونين مناعي. العزلة دفعة من لونين الأنسجة محددة لطريقة مناعي (بت رقاقة) يستخدم نظام مراقبة الأصول الميدانية لعزل نواة ثابتة على أساس خلية من نوع معين من التعبير GFP المترجمة النووية 2. وكان هذا النهج سوتستخدم ccessfully لتحليل توزيع التعديلات هيستون وعوامل النسخ باستخدام لونين مناعي معزولة من نوى من الأديم المتوسط ​​من أجنة ذبابة الفاكهة 2. ومع ذلك، قد يكون النهج القائمة على نظام مراقبة الأصول الميدانية أقل مناسبة لعزل نواة المسمى التي تشكل إلا نسبة صغيرة من السكان مختلطة بسبب زيادة وقت الفرز اللازمة للحصول على أرقام مناسبة للتطبيقات المصب. للتغلب على هذه القيود، وقد استخدمت عدة جماعات تقنيات العزل القائم على تقارب لتنقية نوى التي وصفت مع حاتمة محددة في نوع خلية معينة. وقد تم مؤخرا تكييفها عزل نواة الموسومة في أنواع معينة الخلية (سليمة) طريقة تم تطويرها للاستخدام في نبات الأرابيدوبسيس thaliana 6، 7 لاستخدامها في ذبابة الفاكهة 8. في هذا الأسلوب، وهو بروتين مغلف الاندماج النووي الذي هو الركيزة لفي الجسم الحي هو biotinylation coexpresااا مع كولاي البيوتين يغاز البيرة في أنواع معينة من الخلايا. نوى المسمى البيوتين يمكن تنقيته في وقت لاحق من السكان مختلطة باستخدام القائمة على streptavidin تقارب العزلة. باستخدام هذا النهج، وصفت بنجاح نوى ومعزولة عن الأديم المتوسط ​​من أجنة ذبابة الفاكهة التي أعرب عن البروتين المغلف الانصهار النووي في ظل رقابة من الأديم المتوسط ​​محسن محددة 8. إنشاء الكتاب أيضا البروتينات المغلف النووية الانصهار التي يمكن التعبير عنها في أي نوع من الخلايا تحت سيطرة تسلسل GAL4 التنظيمية، UAS 9. هذا النهج قادر على عزل مجموعات فرعية من النوى بسرعة وصفت من السكان مختلطة، ولكن يتطلب ثلاثة بنيات منفصلة المعدلة وراثيا، وبالتالي قد تكون غير مناسبة لتطبيقات خاصة الوراثية. في الآونة الأخيرة، وقد وصفت هذا النهج الذي تم الموسومة SUN (S AD1 و C-84 للامم المتحدة) والبروتينات التي تحتوي على المجال الذي توطين إلى الغشاء الداخلي من المغلف النووية معوأعرب عن البروتينات الفلورية تحت سيطرة النظام GAL4/UAS 10. تم عزل نواة في وجود المنظفات غير أيوني لإزالة الغشاء الخارجي المغلف النووية، وتنقية تقارب باستخدام الخرز المغناطيسي لجانب الأجسام المضادة للGFP. وقد استخدم هذا النهج بنجاح لعزل المجموعات الصغيرة من النوى وصفت من أنواع فرعية محددة الخلايا العصبية في الدماغ الكبار ذبابة الفاكهة 10. هنا، يوصف بروتوكول لعزل نواة صفت من السكان خليط من الخلايا من الأنسجة ذبابة الفاكهة اليرقات. وقد تم تطوير هذه الطريقة بشكل مستقل، ولكن هو مماثل لنهج وصفها هنري وآخرون 10 الأولى، وصفت نوى مع علامة الفلورسنت التي يتم التعبير فقط في أنواع معينة من الخلايا في ذبابة الفاكهة السوداء البطن لتسهيل العزلة لاحقة من نوى الموسومة من السكان مختلطة استخدام النهج القائم على النسب. لتسمية نوى،وقد استخدمت KASH (K larsicht / A-NC 1 / S yne ح omology) المجال. المجال هو مجال KASH عبر الغشاء الذي يموضع إلى الغشاء الخارجي المغلف النووية، في جزء منه من خلال التفاعل مع SUN البروتينات التي تحتوي على النطاق داخل الفضاء محيط بالنواة 11. المجال KASH C-محطة من البروتينات مثل ذبابة الفاكهة MSP-300 وKlarsicht المراسي هذه البروتينات إلى الغشاء النووي الخارجي، في حين أن التفاعل المجالات-N محطة مع بروتينات الهيكل الخلوي الأكتين مثل الأنابيب الدقيقة أو في السيتوبلازم 12-14. تم إنشاؤها في بنيات الذي تنصهر المجال KASH من ذبابة الفاكهة MSP-300 إلى C-محطة من EGFP، تحت سيطرة تسلسل تنظيمي GAL4، UAS في pUAST-attB ناقلات 15 و 16. باستخدام التكامل في مواقع محددة phiC31، تم إنشاؤها الذباب المعدل وراثيا الذي UAS-EGFP :: تم إدراج MSP-300 KASH التحوير في مواضع attP2 على الصبغي3L 17. وUAS-EGFP :: MSP-300 KASH الذباب يمكن تجاوزه مع الذباب التي تعبر عن السائق GAL4 في نوع خلية معينة، مما أدى إلى التعبير المستهدفة من EGFP على الغشاء النووي الخارجي في نوع من الخلايا في المصالح. ويمكن بعد ذلك أن وصفت نوى تنقيته من السكان الخلية المختلطة باستخدام الأجسام المضادة ضد GFP جانب لحبات المغناطيسي. في هذا النهج، لا يلزم استخدام المنظفات غير أيوني لأن يتم ترجمة العلامة EGFP إلى الجانب حشوية من الغشاء النووي الخارجي، ويمكن الوصول إلى الأجسام المضادة وبالتالي. البروتوكول هو موضح أدناه يمكن استخدامها لعزل / إثراء نوى المسمى EGFP من أنواع معينة من الخلايا في أنسجة اليرقات ذبابة الفاكهة، لقياس العائد من النقاء والنوى معزولة، واستخراج الحمض النووي الريبي النووي مناسبة لكمية العكسية النسخ البلمرة سلسلة من ردود الفعل (QRT -PCR) تحليل التعبير الجيني. عزل وتنقية تقارب من نوى (باستثناء TISSUه تشريح) لا يمكن أن يؤديها في أقل من ساعة واحدة. يتم عرض النتائج تبين أن نوى الدبقية يمكن أن تكون معزولة بنجاح من الفص البصري اليرقات والعين القرص تخيلي، وتستخدم لاحقة تحليل التعبير الجيني. ومن المتوقع أن هذا النهج سوف يكون من المفيد لعزل / إثراء نوى صفت من الأنسجة الجنينية واليرقات في الخلايا المستهدفة التي تشكل أقل من 5٪ من إجمالي عدد السكان. تتوفر جميع الأسهم ذبابة الفاكهة والبلازميدات ولدت في هذه الدراسة من الكتاب عند الطلب.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1884">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:599px;">Anti-chaoptin antibody (mouse, monoclonal)</td>
			<td style="width:263px;">Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td style="width:195px;">mAB24B10</td>
			<td style="width:828px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Anti-GFP antibody (mouse, monoclonal)</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11814460001</td>
			<td>This specific antibody is recommended for this protocol. However, alternative antibodies could also be used.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:599px;">2X Bullseye EvaGreen qPCR Mastermix with ROX</td>
			<td>MidSci</td>
			<td>BEQPCR-R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DAPI (4&#39;,6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride salt)</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>40011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dounce Homogenizer (1 ml)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>62400-595</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dumont #5 Tweezers, 11 cm</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>14095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dynabeads Protein G for Immunoprecipitation</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10003D</td>
			<td>This specific brand of magnetic beads is recommended for this protocol.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">EpiScript Reverse Transcriptase</td>
			<td>Epicentre</td>
			<td>ERT12910K</td>
			<td><a href="http://www.epibio.com/docs/default-source/protocols/episcript-reverse-transcriptase.pdf">http://www.epibio.com/docs/default-source/protocols/episcript-reverse-transcriptase.pdf</a></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Falcon cell strainers, 40 &#956;m pore size</td>
			<td>VWR</td>
			<td>21008-949</td>
			<td>Alternative pore sizes could be used, depending on the size of the target cell nuclei.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Magnetic stand (8 x 1.5 ml tubes)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>LSKMAGS08&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:599px;">Mini tube rotator</td>
			<td style="width:263px;">Genemate</td>
			<td style="width:195px;">H-6700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:599px;">Qubit starter kit</td>
			<td style="width:263px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:195px;">Q32871</td>
			<td style="width:828px;">Similar fluorescence-based methods for quantifying RNA yield could be used. <a href="http://tools.invitrogen.com/content/sfs/manuals/mp32852.pdf">http://tools.invitrogen.com/content/sfs/manuals/mp32852.pdfZ</a></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:599px;">RNAsecure (Ambion)</td>
			<td style="width:263px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:195px;">AM7010</td>
			<td style="width:828px;">The use of this reagent to inactivate RNAses is optional.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:599px;">RT-PCR machine Thermal Cycler</td>
			<td style="width:263px;">BioRad</td>
			<td style="width:195px;">CFX Connect Thermal Cycler</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Siliconized 9 well glass plate</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR3-134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:599px;">Stereomicroscope Fluorescence Adapter (Royal Blue (440 - 460nm) excitation + yellow barrier</td>
			<td style="width:263px;">Nightsea</td>
			<td style="width:195px;"></td>
			<td>This adaptor enables GFP fluorescence to be examined using a typical dissecting microscope (eg Nikon)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:599px;">StereoZoom Microscope 83604 Set with 10X Wide Field Eyepieces and Universal Boom Stand</td>
			<td style="width:263px;">Nikon</td>
			<td style="width:195px;">SMZ 745</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:599px;">Thermal Cycler</td>
			<td style="width:263px;">BioRad</td>
			<td style="width:195px;">T100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Trizol reagent</td>
			<td style="width:263px;">Life Technologies</td>
			<td>15596018</td>
			<td>CAUTION; Alternative RNA extraction methods can be used. <a href="http://tools.invitrogen.com/content/sfs/manuals/trizol_reagent.pdf" >http://tools.invitrogen.com/content/sfs/manuals/trizol_reagent.pdf</a></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tween 20</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0777-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

affinity-based isolation of tagged nuclei from drosophila tissues for gene expression analysis

غالبا ما تحتوي على الأنسجة الجنينية واليرقات ذبابة الفاكهة السوداء البطن خليط غير متجانس للغاية من أنواع الخلايا، والتي يمكن تعقيد تحليل التعبير الجيني في هذه الأنسجة. وبالتالي، لتحليل خلية محددة ملامح التعبير الجيني من الأنسجة ذبابة الفاكهة، فإنه قد يكون من الضروري عزل أنواع معينة من الخلايا مع نقاء عالية وعلى عوائد كافية للتطبيقات المصب مثل النسخي والكروماتين مناعي. ومع ذلك، فإن التشكل الخلوية في أنسجة غير النظامية مثل الجهاز العصبي المركزي، إلى جانب السكان نادرة من أنواع معينة من الخلايا في هذه الأنسجة، يمكن أن تشكل تحديات للطرق التقليدية من العزلة الخلية مثل تسليخ مجهري الليزر والخلية مضان تنشيط الفرز (FACS) . هنا، وهو نهج بديل للتميز ملامح التعبير الجيني خلية محددة باستخدام العزلة القائم على تقارب من نوى الموسومة، بدلا من خلايا كله، يوصف. نوى في ج محددةنوع الذراع من الفائدة وصفت وراثيا مع المغلف النووية المترجمة علامة EGFP باستخدام نظام ثنائي التعبير GAL4/UAS. هذه النوى الموسومة EGFP يمكن أن تكون معزولة باستخدام الأجسام المضادة ضد GFP التي تقترن لحبات المغناطيسي. النهج الموصوفة في هذا البروتوكول يتيح العزلة ثابت من نوى من أنواع معينة من الخلايا في النظام المركزي اليرقات ذبابة الفاكهة العصبي في نقاء عالية وعلى مستويات كافية لتحليل التعبير، حتى عندما تشكل هذه أنواع الخلايا أقل من 2٪ من مجموع السكان في الخلية الأنسجة. ويمكن استخدام هذا النهج لعزل نواة من طائفة واسعة من ذبابة الفاكهة وأنواع الخلايا الجنينية اليرقات باستخدام برامج تشغيل GAL4 محددة، وربما يكون مفيدا في عزل نواة من أنواع الخلايا التي ليست مناسبة لنظام مراقبة الأصول الميدانية أو تسليخ مجهري الليزر.

وأعرب السائق الريبو-GAL4 (بلومنجتون الأسهم رقم 7415) وتحديدا في الخلايا الدبقية في الجهاز العصبي ذبابة الفاكهة في مراحل متعددة من التنمية 18. تم إنشاؤها الذباب التي تعبر عن ثابت UAS-EGFP :: MSP-300 KASH تحت سيطرة السائق الريبو-GAL4 باستخدام تقنيات وراثي...

Watch this Scientific Journal Video about Affinity-based Isolation of Tagged Nuclei from Drosophila Tissues for Gene Expression Analysis at JoVE.com

عزل النوى الموسومة من أنسجة ذبابة الفاكهة لتحليل التعبير الجيني على أساس التقارب | الأحياء | فيديو

Affinity-based Isolation of Tagged Nuclei from Drosophila Tissues for Gene Expression Analysis

غالبا ما تحتوي على الأنسجة ذبابة الفاكهة خليط غير متجانس من أنواع الخلايا. لدراسة التعبير الجيني في أنواع معينة من الخلايا من الأنسجة وجه الخصوص، يمكن الموسومة نوى وراثيا وعزل في وقت لاحق باستخدام النهج القائم على النسب. نواة معزولة يمكن استخدامها لتطبيقات المصب مثل تحليل التعبير الجيني والكروماتين مناعي.

عزل القائم على تقارب من معلم النواة من<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; الأنسجة لتحليل التعبير الجيني

Drosophila melanogaster embryonic and larval tissues often contain a highly heterogeneous mixture of cell types, which can complicate the analysis of gene ...

affinity-based-isolation-tagged-nuclei-from-drosophila-tissues-for

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Biology

Affinity-based Isolation of Tagged Nuclei from Drosophila Tissues for Gene Expression Analysis

Genetics

Gene Expression

SCIENTISTS IN ACTION

14.6K Views.  Purdue University.  غالبا ما تحتوي على الأنسجة ذبابة الفاكهة خليط غير متجانس من أنواع الخلايا. لدراسة التعبير الجيني في أنواع معينة من الخلايا من الأنسجة وجه الخصوص، يمكن الموسومة نوى وراثيا وعزل في وقت لاحق باستخدام النهج القائم على النسب. نواة معزولة ي...

Video: Affinity-based Isolation of Tagged Nuclei from Drosophila Tissues for Gene Expression Analysis

Bacterial Gene Expression Analysis Using Microarrays

التحليل الجرثومي التعبير الجيني عن طريق ميكروأرس]

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell  electroporation system and Gene Pulser  electroporation buffer were specifically developed to transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells.This video demonstrates how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow, and then prepare them for electroporation in the MXcell system. We begin by isolating femur and tibia. Bone marrow from both femur and tibia are then harvested and cultures are established. Cultured bone marrow cells are then transfected and analyzed.

This procedure describes how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow and is followed by transfection using the Gene Pulser MXCell electroporation system.

التحضير لزراعة الخلايا المكونة للدم الابتدائية من نخاع عظام الفئران لElectroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

RNA Isolation from Embryonic Zebrafish and cDNA Synthesis for Gene Expression Analysis

Many important and complex laboratory procedures require an input of high quality, intact RNA.  A degraded sample or the presence of impurities can lead to disastrous results in downstream experimental applications.  It is therefore, of utmost importance to use solid techniques with numerous safeguards and quality control checks to ensure a superior sample.  Herein, we detail a protocol to isolate total RNA from whole zebrafish embryos using a commercially available chemical denaturant and subsequent cleanup to remove traces of DNA and impurities using a commercial RNA isolation kit. As RNA is relatively unstable and easily prone to cleavage by RNAses, most protocols assay gene expression using a cDNA product that is directly synthesized from an RNA template. We detail a procedure to convert RNA into the more stable cDNA product using a commercially available kit. Throughout these procedures there are numerous quality control checks to ensure that the sample is not degraded or contaminated.  The end product of these protocols is cDNA that is suitable for microarray analysis, RT-PCR or long-term storage.    

The isolation of high quality, intact RNA is an essential step in many laboratory protocols. Here, we demonstrate RNA extraction from whole zebrafish embryos and cDNA synthesis for subsequent application in various experimental procedures including gene expression microarray analysis.

عزل الحمض النووي الريبي من الجنينية التجميعي واسماك الزرد [كدنا] لتحليل الجينات

Many important and complex laboratory procedures require an input of high quality, intact RNA.  A degraded sample or the presence of impurities can lead ...

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell electroporation system and Gene Pulser electroporation buffer (Bio-Rad) were specifically developed to easily transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells. We will demonstrate how to perform a simple experiment to quickly identify the best electroporation conditions. We will demonstrate how to run several samples through a range of electroporation conditions so that an experiment can be conducted at the same time as optimization is performed. We will also show how optimal conditions identified using 96-well electroporation plates can be used with standard electroporation cuvettes, facilitating the switch from electroporation plates to electroporation cuvettes while maintaining the same electroporation efficiency. In the video, we will also discuss some of the key factors that can lead to the success or failure of electroporation experiments.

This procedure shows how to use the Gene Pulser MXcell electroporation system to rapidly and easily identify the best electroporation conditions for mouse embryonic fibroblasts (MEFs) or other primary cells. Considerations for troubleshooting are also discussed in the associated video.

باستخدام الجينات Electroporation MXcell بولسير النظام لTransfect الخلايا الأولية ذات الكفاءة العالية

Robotics and Dynamic Image Analysis for Studies of Gene Expression in Plant Tissues

Gene expression in plant tissues is typically studied by destructive extraction of compounds from plant tissues for in vitro analyses. The methods presented here utilize the green fluorescent protein (gfp) gene for continual monitoring of gene expression in the same pieces of tissues, over time. The gfp gene was placed under regulatory control of different promoters and introduced into lima bean cotyledonary tissues via particle bombardment. Cotyledons were then placed on a robotic image collection system, which consisted of a fluorescence dissecting microscope with a digital camera and a 2-dimensional robotics platform custom-designed to allow secure attachment of culture dishes. Images were collected from cotyledonary tissues every hour for 100 hours to generate expression profiles for each promoter. Each collected series of 100 images was first subjected to manual image alignment using ImageReady to make certain that GFP-expressing foci were consistently retained within selected fields of analysis. Specific regions of the series measuring 300 x 400 pixels, were then selected for further analysis to provide GFP Intensity measurements using ImageJ software. Batch images were separated into the red, green and blue channels and GFP-expressing areas were identified using the threshold feature of ImageJ. After subtracting the background fluorescence (subtraction of gray values of non-expressing pixels from every pixel) in the respective red and green channels, GFP intensity was calculated by multiplying the mean grayscale value per pixel by the total number of GFP-expressing pixels in each channel, and then adding those values for both the red and green channels. GFP Intensity values were collected for all 100 time points to yield expression profiles. Variations in GFP expression profiles resulted from differences in factors such as promoter strength, presence of a silencing suppressor, or nature of the promoter. In addition to quantification of GFP intensity, the image series were also used to generate time-lapse animations using ImageReady. Time-lapse animations revealed that the clear majority of cells displayed a relatively rapid increase in GFP expression, followed by a slow decline. Some cells occasionally displayed a sudden loss of fluorescence, which may be associated with rapid cell death. Apparent transport of GFP across the membrane and cell wall to adjacent cells was also observed. Time lapse animations provided additional information that could not otherwise be obtained using GFP Intensity profiles or single time point image collections.

We report a method for introduction, tracking and quantitative analysis of GFP expression in plant cells. This method utilizes a custom-designed robotics system for semi-continuous image collection from large numbers of samples, over time. We also demonstrate the use of ImageJ and ImageReady for analysis of image series.

الروبوتات والتحليل الديناميكي صورة للدراسات في التعبير الجيني في أنسجة النبات

Gene expression in plant tissues is typically studied by destructive extraction of compounds from plant tissues for in vitro analyses. The methods ...

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only to study the effects of downregulating single genes, but also to interrogate signaling pathways and other complex interaction networks.  These pathway analyses require both the use of relevant cellular models and methods that cause less perturbation to the cellular physiology.  Electroporation is increasingly being used as an effective way to introduce siRNA and other nucleic acids into difficult to transfect cell lines and primary cells without altering the signaling pathway under investigation. There are multiple critical steps to a successful siRNA experiment, and there are ways to simplify the work while improving the data quality at several experimental stages.  To help you get started with your siRNA mediated gene knockdown project, we will demonstrate how to perform a pathway study complete from collecting and counting the cells prior to electroporation through post transfection real-time PCR gene expression analysis.  The following study investigates the role of the transcriptional activator STAT6 in IL-4 dependent gene expression of CCL17 in a Burkitt lymphoma cell line (Namalwa).  The techniques demonstrated are useful for a wide range of siRNA-based experiments on both adherent and suspension cells.  We will also show how to streamline cell counting with the TC10 automated cell counter, how to electroporate multiple samples simultaneously using the MXcell electroporation system, and how to simultaneously assess RNA quality and quantity with the Experion automated electrophoresis system.

This procedure describes a quick and easy workflow to introduce siRNA into difficult to transfect cell lines and follow gene expression by real-time PCR. Use of an automated cell counter, multi-well electroporation plate, and automated electrophoresis station provide quick and reliable results without the need for expensive robotic handling.

باستخدام خلية مكافحة الآلي لتبسيط دراسات التعبير الجيني : ضربة قاضية سيرنا من IL - 4 التعبير الجيني في الخلايا التابعة Namalwa

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of muscle specification, formation and function in model systems has provided valuable insight into muscle physiology. Therefore, identifying and characterizing molecular mechanisms that underlie muscle damage is critical. The structure of adult Drosophila multi-fiber muscles resemble vertebrate striated muscles 1 and the genetic tractability of Drosophila has made it a great system to analyze dystrophic muscle morphology and characterize the processes affecting muscular function in ageing adult flies 2. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. These preparations allow for the tissue to be stained with classical histological stains and labeled with protein detecting dyes, and specifically cryosections are ideal for immunohistochemical detection of proteins in intact muscles. This allows for analysis of muscle tissue structure, identification of morphological defects, and detection of the expression pattern for muscle/neuron-specific proteins in Drosophila adult muscles. These techniques can also be slightly modified for sectioning of other body parts.

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

Identification of mechanisms underlying muscle damage is crucial. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. This allows analysis of muscle morphology and localization of protein and other muscle cell components.

البارافين ، جزءا لا يتجزأ من والمجمدة أقسام ذبابة الفاكهة</emالعضلات الكبار>

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of ...

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.
Telomerase is a specialized reverse transcriptase1 that adds short DNA repeats, called telomeres, to the 3' end of linear chromosomes2 that serve to protect them from end-to-end fusion and degradation. Following DNA replication, a short segment is lost at the end of the chromosome3 and without telomerase, cells continue dividing until eventually reaching their Hayflick Limit4. Additionally, telomerase is dormant in most somatic cells5 in adults, but is active in cancer cells6 where it promotes cell immortality7.
The minimal telomerase enzyme consists of two core components: the protein subunit (TERT), which comprises the catalytic subunit of the enzyme and an integral RNA component (TER), which contains the template TERT uses to synthesize telomeres8,9. Prior to 2008, only structures for individual telomerase domains had been solved10,11. A major breakthrough in this field came from the determination of the crystal structure of the active12, catalytic subunit of T. castaneum telomerase, TcTERT1.
Here, we present methods for producing large quantities of the active, soluble TcTERT for structural and biochemical studies, and the reconstitution of the telomerase RNP complex in vitro for telomerase activity assays. An overview of the experimental methods used is shown in Figure 1.

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.

إعادة إعماره في المختبر من أحدث T. castaneum تيلوميراز

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a particular transcriptional program in order to mount an appropriate and coordinated cellular response. The cell possesses several oxygen sensor enzymes that require molecular oxygen as cofactor for their activity. These range from prolyl-hydroxylases to histone demethylases. The majority of studies analyzing cellular responses to hypoxia are based on cellular populations and average studies, and as such single cell analysis of hypoxic cells are seldom performed. Here we describe a method of analysis of global RNA synthesis at the single cell level in hypoxia by using Click-iT RNA imaging kits in an oxygen controlled workstation, followed by microscopy analysis and quantification.&nbsp; Using cancer cells exposed to hypoxia for different lengths of time, RNA is labeled and measured in each cell. This analysis allows the visualization of temporal and cell-to-cell changes in global RNA synthesis following hypoxic stress.

We describe a technique for analysis of global RNA synthesis in hypoxia using imaging. Click-chemistry labeling of RNA has not previously been performed under hypoxia and allows visualization of global RNA changes at the single cell level. This approach complements the existing averaged RNA techniques, allowing direct visualization of cell-to-cell changes in global RNA synthesis.

تحليل الحمض النووي الريبي العالمي التجميعي على مستوى خلية واحدة نقص الأكسجة التالي

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Metabolic disorders are a frequent problem affecting human health. Therefore, understanding the mechanisms that regulate metabolism is a crucial scientific task. Many disease causing genes in humans have a fly homologue, making Drosophila a good model to study signaling pathways involved in the development of different disorders. Additionally, the tractability of Drosophila simplifies genetic screens to aid in identifying novel therapeutic targets that may regulate metabolism. In order to perform such a screen a simple and fast method to identify changes in the metabolic state of flies is necessary. In general, carbon dioxide production is a good indicator of substrate oxidation and energy expenditure providing information about metabolic state. In this protocol we introduce a simple method to measure CO2 output from flies. This technique can potentially aid in the identification of genetic perturbations affecting metabolic rate.

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Metabolic disorders are among one of the most common diseases in humans. The genetically tractable model organism D. melanogaster can be used to identify novel genes that regulate metabolism. This paper describes a relatively simple method which allows studying the metabolic rate in flies by measuring their CO2 production.