المؤلفين أشكر مصادر تمويلها، هوارد برنامج التعليم المرحلة الجامعية علوم معهد هيوز الطبي في كلية وليام وماري؛ الراعي المنحة: المعاهد الوطنية للصحة (MSS)؛ عدد المنح: R15NS067566. كما يعترفون بدعم من كلية وليام وماري، قسم الأحياء وكلية الآداب والعلوم للحصول على المساعدة مع رعاية الحيوان.

<ol>
	<li>Eng, M. L., Elliott, J. E., MacDougall-Shackleton, S. A., Letcher, R. J., Williams, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+exposure+to+2,2',4,4',5-pentabromodiphenyl+ether+(BDE-99)+affects+mating+behavior+of+zebra+finches.">Early exposure to 2,2',4,4',5-pentabromodiphenyl ether (BDE-99) affects mating behavior of zebra finches.</a> Toxicol Sci. 127, 269-276 (2012).</li><li>Winter, V., Elliott, J. E., Letcher, R. J., Williams, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+an+egg-injection+method+for+embryotoxicity+studies+in+a+small,+model+songbird,+the+zebra+finch+(Taeniopygia+guttata).">Validation of an egg-injection method for embryotoxicity studies in a small, model songbird, the zebra finch (Taeniopygia guttata).</a> Chemosphere. 90, 125-131 (2013).</li><li>Maney, D. L., Goodson, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurogenomic+mechanisms+of+aggression+in+songbirds.">Neurogenomic mechanisms of aggression in songbirds.</a> Adv Genet. 75, 83-119 (2011).</li><li>Kirn, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+relationship+of+neurogenesis+and+growth+of+brain+regions+to+song+learning.">The relationship of neurogenesis and growth of brain regions to song learning.</a> Brain and Language. 115, 29-44 (2010).</li><li>Fisher, S. E., Scharff, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FOXP2+as+a+molecular+window+into+speech+and+language.">FOXP2 as a molecular window into speech and language.</a> Trends in Genetics. 25, 166-167 (2009).</li><li>Tokarev, K., Tiunova, A., Scharff, C., Anokhin, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Food+for+Song:+Expression+of+C-Fos+and+ZENK+in+the+Zebra+Finch+Song+Nuclei+during+Food+Aversion+Learning.">Food for Song: Expression of C-Fos and ZENK in the Zebra Finch Song Nuclei during Food Aversion Learning.</a> PLoS One. 6, (2011).</li><li>Vargha-Khadem, F., Gadian, D. G., Copp, A., Mishkin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FOXP2+and+the+neuroanatomy+of+speech+and+language.">FOXP2 and the neuroanatomy of speech and language.</a> Nat Rev Neurosci. 6, 131-138 (2005).</li><li>Schulz, S. B., Haesler, S., Scharff, C., Rochefort, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Knockdown+of+FoxP2+alters+spine+density+in+Area+X+of+the+zebra+finch.">Knockdown of FoxP2 alters spine density in Area X of the zebra finch.</a> Genes, Brain and Behavior. 9, 732-740 (2010).</li><li>Jarvis, E. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Avian+brains+and+a+new+understanding+of+vertebrate+brain+evolution.">Avian brains and a new understanding of vertebrate brain evolution.</a> Nat Rev Neurosci. 6, 151-159 (2005).</li><li>Brainard, M. S., Doupe, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translating+birdsong:+songbirds+as+a+model+for+basic+applied+medical+research.">Translating birdsong: songbirds as a model for basic applied medical research.</a> Annu Rev Neurosci. 36, 489-517 (2013).</li><li>Mayer, U., Watanabe, S., Bischof, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+memory+and+the+avian+hippocampus:+Research+in+zebra+finches.">Spatial memory and the avian hippocampus: Research in zebra finches.</a> J Physiol Paris. , (2012).</li><li>Warren, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genome+of+a+songbird.">The genome of a songbird.</a> Nature. 464, 757-762 (2010).</li><li>Agate, R. J., Scott, B., Haripal, B., Lois, C., Nottebohm, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+songbirds+offer+an+opportunity+to+develop+a+genetic+model+for+vocal+learning.">Transgenic songbirds offer an opportunity to develop a genetic model for vocal learning.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 106, 17963-17967 (2009).</li><li>Birkhead, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Internal+incubation+and+early+hatching+in+brood+parasitic+birds.">Internal incubation and early hatching in brood parasitic birds.</a> Proceedings of the Royal Society Biological Sciences. 278, 1019-1024 (2011).</li><li>Haesler, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FoxP2+expression+in+avian+vocal+learners+and+non-learners.">FoxP2 expression in avian vocal learners and non-learners.</a> J Neurosci. 24, 3164-3175 (2004).</li><li>Godsave, S. F., Lohmann, R., Vloet, R. P. M., Gahr, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Androgen+receptors+in+the+embryonic+zebra+finch+hindbrain+suggest+a+function+for+maternal+androgens+in+perihatchingsurvival.">Androgen receptors in the embryonic zebra finch hindbrain suggest a function for maternal androgens in perihatchingsurvival.</a> Journal of Comparative Neurology. 453, 57-70 (2002).</li><li>Stern, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chick;+a+great+model+system+becomes+even+greater.">The chick; a great model system becomes even greater.</a> Dev Cell. 8, 9-17 (2005).</li><li>Kuenzel, W. J., Medina, L., Csillag, A., Perkel, D. J., Reiner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+avian+subpallium:+new+insights+into+structural+and+functional+subdivisions+occupying+the+lateral+subpallial+wall+and+their+embryological+origins.">The avian subpallium: new insights into structural and functional subdivisions occupying the lateral subpallial wall and their embryological origins.</a> Brain Research. 1424, 67-101 (2011).</li><li>Tickle, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+contribution+of+chicken+embryology+to+the+understanding+of+vertebrate+limb+development.">The contribution of chicken embryology to the understanding of vertebrate limb development.</a> Mech Dev. 121, 1019-1029 (2004).</li><li>Vergara, M. N., Canto-Soler, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rediscovering+the+chick+embryo+as+a+model+to+study+retinal+development.">Rediscovering the chick embryo as a model to study retinal development.</a> Neural Development. 7, (2012).</li><li>Davey, M. G., Tickle, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chicken+as+a+model+for+embryonic+development.">The chicken as a model for embryonic development.</a> Cytogenet Genome Research. 117, 231-239 (2007).</li><li>Murray, J. R., Varian-Ramos, C. W., Welch, Z. S., Saha, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryological+staging+of+the+zebra+finch,+Taeniopygia+guttata.">Embryological staging of the zebra finch, Taeniopygia guttata.</a> J Morphol. , (2013).</li><li>Hawkins, P., Morton, D. B., Cameron, D., Cuthill, I., Francis, R., Freire, R., Gosler, A., Healy, S., Hudson, A., Inglis, I., Jones, A., Kirkwood, J., Lawton, M., Monaghan, P., Sherwin, C., Townsend, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laboratory+birds:+refinements+in+husbandry+and+procedures.+Fifth+report+of+BVAAWF/FRAME+/RSPCA/UFAW+Joint+Working+Group+on+Refinement.">Laboratory birds: refinements in husbandry and procedures. Fifth report of BVAAWF/FRAME /RSPCA/UFAW Joint Working Group on Refinement.</a> Lab Anim. , (2001).</li><li>Pearse II, R. V., Esshaki, D., Tabin, C. J., Murray, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+expression+analysis+of+intra-+and+extraarticular+connective+tissue.">Genome-wide expression analysis of intra- and extraarticular connective tissue.</a> Journal of Orthopaedic Research. 27, 427-434 (2009).</li><li>Pizard, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-mount+in+situ+hybridization+and+detection+of+RNAs+in+vertebrate+embryos+and+isolated+organs.">Whole-mount in situ hybridization and detection of RNAs in vertebrate embryos and isolated organs.</a> Current Protocols in Molecular Biology. 66, (2004).</li><li>Warren, M., Puskarczyk, K., Chapman, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chick+embryo+proliferation+studies+using+EdUlabeling.">Chick embryo proliferation studies using EdUlabeling.</a> Developmental Dynamics. 238, 944-949 (2009).</li><li>Salic, A., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+chemical+method+for+fast+and+sensitive+detection+of+DNA+syntesis+in+vivo.">A chemical method for fast and sensitive detection of DNA syntesis in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 105, 2415-2420 (2008).</li><li>Hoogesteijn, A. L., DeVoogd, T. J., Quimby, F. W., De Caprio, T., Kollias, G. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reproductive+impairment+in+zebra+finches+(Taeinopygia+guttata).">Reproductive impairment in zebra finches (Taeinopygia guttata).</a> Environmental Toxicology and Chemistry. 24, 219-223 (2005).</li><li>Winter, V., Williams, T. D., Elliott, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+three-generational+study+of+In+ovo+exposure+to+PBDE-99+in+the+zebra+finch.">A three-generational study of In ovo exposure to PBDE-99 in the zebra finch.</a> Environmental Toxicology and Chemistry. 32, 562-568 (2013).</li><li>Kitulagodage, M., Buttemer, W. A., Astheimer, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adverse+effects+of+fipronil+on+avian+reproduction+and+development:+maternal+transfer+of+fipronil+to+eggs+in+zebra+finch+Taeinopygia+guttata+and+in+ovo+exposure+in+chickens+Gallus+domesticus.">Adverse effects of fipronil on avian reproduction and development: maternal transfer of fipronil to eggs in zebra finch Taeinopygia guttata and in ovo exposure in chickens Gallus domesticus.</a> Ecotoxicology. 20, 653-660 (2011).</li><li>Hallinger, K. K., Zabransky, D. J., Kazmer, K. A., Cristol, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Birdsong+differs+between+mercury-polluted+and+reference+sites.">Birdsong differs between mercury-polluted and reference sites.</a> The Auk. 127, 156-161 (2010).</li><li>Chen, C. C., Wada, K., Jarvis, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radioactive+in+situ+Hybridization+for+Detecting+Diverse+Gene+Expression+Patterns+in+Tissue.">Radioactive in situ Hybridization for Detecting Diverse Gene Expression Patterns in Tissue.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2012).</li><li>Chen, C. C., Balaban, E., Jarvis, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interspecies+Avian+Brain+Chimeras+Reveal+That+Large+Brain+Size+Differences+Are+Influenced+by+Cell&#8211;Interdependent+Processes.">Interspecies Avian Brain Chimeras Reveal That Large Brain Size Differences Are Influenced by Cell&#8211;Interdependent Processes.</a> PLoS One. 7, (2012).</li><li>Chen, C. C., Winkler, C. M., Pfenning, A. R., Jarvis, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+profiling+of+the+developing+avian+telencephalon:+Regional+timing+and+brain+subdivision+continuities.">Molecular profiling of the developing avian telencephalon: Regional timing and brain subdivision continuities.</a> The Journal of Comparative Neurology. 521, 3666-3701 (2013).</li></ol>

والكتاب ليس لديهم ما يكشف.

التطورات الأخيرة في دليل التدريج الجنينية 22 والجينوم الشرح جعل فينش حمار وحشي كائن النموذج المرغوب فيه للدراسات التنموية. ومع ذلك، فإن صغر الحجم والهشاشة من الأجنة حمار وحشي فينش، والتي تتراوح من 3 إلى 7 ملم في مراحل 1 - 10 22، يمكن أن تجعل من الصعب تشريح 11 و 14. يمكن تحديد موقع وإزالة نظيفة الأجنة من سطح الصفار أن يكون تحديا. يوفر هذا البروتوكول تفاصيل كافية لتنفيذ الإجراء مع سهولة. هذا البروتوكول يوضح الخطوات الحاسمة التي لا تعرف عادة، ولكنها ضرورية لضمان تشريح ناجحة. على سبيل المثال، فمن الضروري أن تترك طبقة صغيرة من صفار بين الجنين ورقة من الورق تزن لمنع الالتصاق. كل من تحديد وإزالة الجنين يمكن أن يكون صعبا. لاستكشاف وتحديد الجنين على سطح الصفار، وتألق الضوء مباشرة فوق صفار البيض بعد أن لديهأزيلت من البيض، وإلقاء نظرة على صفار في زاوية 45 درجة إلى العثور على الجنين. مرة واحدة ويقع الجنين، وقطع صفار على وزن الورق مع الحرص على عدم المسيل للدموع الجنين. إذا تشمل المزيد من تطبيقات التصوير الاختلافات التشريحية، التهجين في الموقع، أو المقايسات تكاثر الخلايا، فمن المهم لإزالة الغشاء المحي في مرحلة 1-8 (22) لتصور أفضل للهياكل. إذا تواجه صعوبات عند إزالة صفار البيض أو الغشاء المحي في المراحل المبكرة، وتحديد الجنين في PFA 4٪ قبل غسله في برنامج تلفزيوني 1X للحد من هشاشة الجنينية. الأولى عن طريق إزالة الغشاء المحي أثناء تشريح كما هو موضح، وهياكل واضحة للعيان وسليمة في الأجنة فينش حمار وحشي بعد إجراء عملية التهجين في الموقع. وجود قيود على EDU هو أن إدارة كميات الجرعة أكثر من 478 NL يؤدي إلى الوفاة الجنينية. ومع ذلك، فإن مجموعة الجرعة العظمى يسمح varyinمستويات غرام من علامات الخلية التكاثري. و&quot;فوق&quot; رد فعل المستخدمة في هذه المجموعة هو النحاس (I) حفزت-آلكاين أزيد-إضافة حلقية (النحاس (I) AAC). في هذا ردة فعل معينة، يتم تضمينها جزيء ثيميدين التماثلية التي تحتوي على آلكاين (EDU) عن طريق قسمة بنشاط الخلايا. المجموعة آلكاين في EDU يبرز من بنية حلزونية من الحمض النووي، ويتم الكشف عن التعرض لجزيء أزيد مترافق إلى الأخضر، الذي يربط جزيء نيون إلى مجموعة آلكاين الحرة. مضان أخضر يدل على الخلايا المتكاثرة حديثا في الجنين. للالتعامد الحيوي من أزيد والمجموعات آلكاين يمنع تلطيخ غير محددة لأن هذه الأنواع رد الفعل ليست موجودة بشكل طبيعي في الكائنات الحية. أيضا، وذلك لأن الحمض النووي لا بد من التشويه والتحريف من أجل رد الفعل أن تحدث، ويمكن إجراء مزيد من التحليل المعتمدة على الحمض النووي يكون من السهل تنفيذها 27. بقصور هذا الأسلوب هو الحجم الصغير وفرجility من حمار وحشي فينش الأجنة. إزالة الغشاء المحي من الأجنة مراحل 1 - 15 22 يمكن أن يؤدي إلى هياكل الجنينية مدمرة إذا لم يتم تنفيذ بحذر. ومع ذلك، هذا البروتوكول يبسط طريقة تشريح، مما يسمح للمحققين لاستخدام المراحل الجنينية المبكرة لدراسة التشوهات الهيكلية والتعبير الجيني التي لم يتم دراستها سابقا في العمق. هذا البروتوكول يفتح الطريق أمام مجموعة كبيرة من المقايسات الخلوية الجزيئية التي من شأنها أن تسمح للمحققين لتحديد أصول التنموية من الظواهر الكبار. على سبيل المثال، سيكون من الممكن لدراسة التعبير الجيني المتورطين في التعلم صخبا تحت ظروف بيئية مختلفة أو بعد العلاجات الدوائية في المراحل الأولى من التطوير 28، 29،30،31. وإن لم يكن هو موضح في هذه الورقة، وهذه الطريقة يمكن أن تكون يسمح لإجراءات أخرى مثل المشعة التهجين في الموقع على حمار وحشي فينش أقسام الأنسجة و electroporation / في اوفس 32 عملية جراحية، 33،34. بالنظر إلى أن تم تأسيس فينش حمار وحشي كما كائن نموذجا هاما ضمن هيئة واسعة من المؤلفات، وتوفير مثل هذه الدراسات الفرص غير المستغلة لربط الآليات التنموية مع علم وظائف الأعضاء والسلوك الكبار، ولا سيما تطور اللغة 7 و 9.

الهدف العام من هذه التقنية هو الحصول على حمار وحشي فينش (Taeniopygia الرقشاء) الأجنة منذ المراحل الأولى من التطور الجنيني للاستخدام في مجموعة واسعة من الدراسات التنموية. أصبحت حمار وحشي فينش السائد نموذج مطربة الحي واستخدمت على نطاق واسع في مجموعة متنوعة من المجالات، بما في ذلك علم السموم 1،2، 3 السلوك والذاكرة والتعلم 4،5،6، 7،8 مقارنة التشريح العصبي، وتطوير اللغة 9،10 . كما مطربة فقط مع الجينوم التسلسل، وحمار وحشي فينش يسمح الدراسة الجزيئية والجينية من أجل Passeriformes، وهو ما يمثل أكثر من 50٪ من أنواع الطيور المعروفة 11، 12،13. على الرغم من استخدام الكبار والأحداث حمار وحشي فينش في مجموعة متنوعة من المجالات، وقد أجريت دراسات قليلة على الأجنة حمار وحشي فينش، وخصوصا خلال المراحل الأولى من التنمية. ويمكن أن يعزى ذلك إلى صغر حجم بيضها والثانية الأجنة، وضعهم أحدث كنموذج حي 14،15،16 للدراسات التي الدجاج (الداجن جالوس جالوس) كان يستخدم سابقا بمثابة نموذج 17،18،19،20،21 نظام السائد. لكن، وكما المتعلمين غير الصوتية، والدجاج ليست نظاما نموذج مناسب لدراسة الأساس الجيني للتعليم الصوتية، وتطوير التعلم الصوتية، والتوريث، والسلوك، والعقد القاعدية الدوائر-القشرية الحركية المشاركة في التعلم 10. من المهم أن نلاحظ أن الأجنة حمار وحشي فينش هي أكثر حساسية التالفة بكثير وأكثر سهولة من خلال تشريح افراخ الدجاج والإجراءات الجزيئية. على وجه الخصوص، الأمر يتطلب عناية أكبر عند تنفيذ الخطوات permeabilization على حمار وحشي فينش الأجنة. يمكن المنظفات والإنزيمات القوية التي لن تضر الجنين الفرخ يضر الأجنة فينش حمار وحشي. من حيث الرعاية العامة، فمن الضروري وضع البيض حمار وحشي فينش في أكواب صغيرة قبل وضعه في حاضنةلمنعهم من كسر عندما المتداول خلال الحضانة. حمار وحشي فينش قابلة للدراسات السلوكية، بسهولة وبغزارة تولد على مدار السنة في الأسر، ويتعلمون الصوتية. هذه الخصائص تسمح باستخدام حمار وحشي فينش لتلبية الحاجة إلى كائن النموذج الذي يجمع بين التنمية، وعلم الوراثة، والجوانب السلوكية للغة. أساليب تشريح مفصل أدناه، جنبا إلى جنب مع دليل التدريج وضعت مؤخرا محددة لحمار وحشي فينش 22، وجعل فينش حمار وحشي ومفيدة على نحو متزايد موحدة نموذج التنموية الحي. ومع ذلك، والحصول على أجنة في مراحل مبكرة يمكن ان تكون شاقة. هذا البروتوكول يسمح للمحققين بسهولة الحصول على الأجنة في مرحلة مبكرة. دراسات التحقيق في التنمية في وقت مبكر والأساس الجزيئي للالتنموية السلوكيات المعقدة في حمار وحشي فينش، أو الآثار السمية على التنمية في الأخرى الصغيرة، وسوف تجد الطيور الجواثم منهجية تشريح هذا مفيد.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="573">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Chicken egg incubator</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">We use a Picture Window Hova-Bator Incubator, Circulated Air Model&#160;&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Imaging kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C10337</td>
			<td>Detection of cell proliferation.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dissection microscope&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>We use Olympus SZ61</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">7&#39;&#39; Drummond capillary for Nanoject II injector</td>
			<td>Drummond</td>
			<td>3-00-203-G/X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Drummond Nanoject II microinjector</td>
			<td colspan="2">Drummond</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dumont Tweezers #55</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td align="right">14099</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethanol (EtOH)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">50mL Falcon tube (polypropylene)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>06-443-18&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FastPrep Lysis Matrix H tubes</td>
			<td>MP biomedicals</td>
			<td>6917-100</td>
			<td>Used for RNA extraction, used to homogenize embryos</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fiber optic illuminator lamps (High Intensity Illuminator)</td>
			<td>Dolan-Jenner Industries&#160;</td>
			<td colspan="2">Fiber-Lite MI-150&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glass vials with screw cap (DEPC treated)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>03-338A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microcentrifuge eppe tube (1.5 mL)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-408-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mineral oil</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M-8410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Modeling Clay</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Any brand</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Narshige PB-7 needle puller</td>
			<td>Narshige</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Omni Bead Ruptor Homogenizer</td>
			<td style="width:71px;">OMNI International</td>
			<td>19-010</td>
			<td>Used for RNA extraction</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td colspan="3" height="25" style="height:25px;">4% Paraformaldehyde (4% PFA): 20 mL 8% PFA (32g paraformaldehyde, 350mL sdd H2O, adjust pH to 7.6, 400mL sdd H2O), 20mL 2xPBS</td>
			<td>Fixation of embryos. Caution, is harmful and do not inhale.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td colspan="4" height="25" style="height:25px;">Phosphate buffered saline (1xPBS): 200mL 10X PBS, 1800 mL Barnstead H2O, adjust pH to 7.4</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td colspan="4" height="25" style="height:25px;">Phosphate buffered saline (10xPBS): 800mL Barnstead, 2.013g KCL, 80.063g NaCl, 2.722g KH2PO4 monobasic, 14.196g Na2HPO4 dibasic, 200mL Barnstead H2O, adjust pH to 6.5</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td colspan="4" height="25" style="height:25px;">Phosphate buffered saline with 0.1% Tween-20 (1xPTw): 1800mL Barnstead H2O, 200mL 10X PBS, adjust pH to 7.4, 2mL Tween-20</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">35mL Plastic petri dish&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-757-100A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">plastic wrap</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Any brand</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Prepease RNA Spin Kit</td>
			<td>PrepEase, Affymetrix</td>
			<td>78766 1 KT</td>
			<td>Used for RNA extraction, used to homogenize embryos</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Reaction Mix: 875&#956;L 1xPBS, 100mM 20&#956;L CuSO4 (Kit Component E), 5&#956;L Alexa Fluor 488 azide (Kit Component B), 100&#956;L diluted reaction buffer additive (Kit Component F)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C10337</td>
			<td>Detection of cell proliferation.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">sdd H2O</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Seed cup&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>We use it as a container when incubating eggs</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Stainless steel scalpel&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Standard nest box</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>We use Abba Plastic Finch Nestboxes</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">4mL, Teflon Lined Cap, Glass Vials</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-912-352</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Transfer pipettes (polyethylene)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-711-7M&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">4x4 weigh paper</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>09-898-12B</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dissection and downstream analysis of zebra finch embryos at early stages of development

أصبح فينش حمار وحشي (Taeniopygia الرقشاء) كائن نموذجا متزايد الأهمية في العديد من مجالات البحوث بما في ذلك علم السموم 1، 2، 3 السلوك، والذاكرة والتعلم 4،5،6. كما مطربة فقط مع الجينوم التسلسل، وفينش حمار وحشي لديها امكانات كبيرة لاستخدامها في الدراسات التنموية؛ ومع ذلك، فإن المراحل الأولى من التنمية فينش حمار وحشي لم يتم دراستها جيدا. ويمكن أن يعزى عدم وجود بحوث في مجال التنمية فينش حمار وحشي لصعوبة تشريح البيضة الصغيرة والجنين. طريقة تشريح التالية يقلل من تلف الأنسجة الجنينية، والذي يسمح للتحقيق في التشكل والتعبير الجيني في جميع مراحل التطور الجنيني. هذا يسمح كل من حقل مشرق والتصوير مضان نوعية الأجنة، استخدم في إجراءات الجزيئية مثل الموقع التهجين (ISH)، المقايسات تكاثر الخلايا، واستخراج الحمض النووي الريبي لفحوصات الكمي مثل الجرمية الكمي فيL-PCR الوقت (qtRT-PCR). يسمح هذا الأسلوب المحققين لدراسة المراحل الأولى من التنمية التي كان من الصعب الوصول إليها سابقا.

الخطوات تخطيطي في الشكل 1 تشير إلى ظهور الجنين بينما تعلق على الغشاء المحي (A) وشرح الطريقة الصحيحة لفصل الجنين من صفار البيض (B). يمكن التعرف على الجنين من منطقة مفرق، وهي أخف بكثير من الغشاء المحي. الجنين نفسه في كثير من الأحيان من الصعب التمييز حتى يتم قطع صفار بعيدا. مرة واحدة يتم تشريح الجنين من البيضة، ويمكن أن تكون ثابتة أو فلاش المجمدة لاستخدامها في المستقبل. إذا كان التهجين في الموقع ومن المخطط لتشريح الجنين، فمن الضروري إزالة الغشاء المحي التي انضمت إلى الجنين عبر منطقة مفرق الشكل 2 يوضح الرؤية المحسنة من الجنين مرة واحدة تتم إزالة هذا الغشاء (C)، والطريقة الصحيحة لقشر الغشاء المحي (A، B). بعد تشريح والتثبيت، جبل بأكمله في الموقع التهجين أجريت كما رأينا في الشكل 3 (A، A &#39;، B، B&#39;) والشكل (4) (A، A&#39;، B، B &#39;) والشكل (5) (A، B، C) للكشف عن الاختلافات في orthodenticle homeobox 2 (Otx2) التعبير في الأجنة تتعرض تنمويا لجرعات منخفضة من ميثيل الزئبق. الشكل 5 يظهر نتائج التحقيق الشعور، وعدم التظاهر من الخلفية. في الشكل 4، على الرغم من تشريح من البيضة في نقطة الوقت نفسه، فإن الجنين يتعرض تنمويا لميثيل الزئبق (ميثيل الزئبق) تقدمت إلى مرحلة 5 22 (B، B &#39;)، في حين أن الجنين السيطرة المتقدمة لاستضافة 6 22 (A، A &#39;). تم جمع مجموعة من الأجنة تشريح ويظهر في الشكل 4 من العش والتي اتخذت من حاضنة في الأوقات نفسها. على الرغم من بعض الاختلاف الطبيعي موجود في التنمية، استنادا إلى بيانات تشريح السابقة، فمن غير المرجح أن التقلبات في درجات الحرارة في الحاضنة لن تؤدي سوى إلى 2.4 جزء في المليون الأجنة ميثيل الزئبق لتكون develo<html> تأخر pmentally. الاختلافات في مراحل توضح التغييرات في تكاثر الخلايا في الأجنة تتعرض تنمويا لميثيل الزئبق. قبل التشريح، تم حقن EDU في يوم 2 بيضة وسمح لاحتضان بين عشية وضحاها. بعد تشريح وتثبيت للمرحلة 16 22 الجنين، وتصور EDU باستخدام &quot;فوق&quot; الكيمياء، مما يسمح للكشف عن الخلايا المتكاثرة كما رأينا في الشكل 6 (A، B، C). من المهم أن ترصد بدقة نقاط الوقت عند وضع البيض في الحاضنة وخلال تشريح، والتعرض لميثيل الزئبق أو أداء الفحص EDU قد يعطل التقدم التنموي. تم إجراء أقرب حقن في اليوم 0، وهو اليوم من جمع كما هو محدد في الخطوة 1.3. وكان تشريح هذا الجنين في وقت لاحق ما يقرب من 38 ساعة (المرحلة 7 22). تم العثور على معدل البقاء على قيد الحياة إلى أن ما يقرب من 90٪ (بنفس معدل الأجنة السيطرة) طالما كان المبلغ الحقن تحت 478 NL. &quot;jove_content&quot;&gt; هذه المنهجية تشريح يسمح أيضا لاستخراج الحمض النووي الريبي جودة عالية. بعد تشريح المرحلة 16 22 الأجنة، أجريت عملية استخراج الحمض النووي الريبي وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة مع عدم وجود التحسين المطلوبة، كما رأينا في الشكل 7. كان إزالة الغشاء المحي لا لزوم لها لاستخراج الحمض النووي الريبي في وقت لاحق والتطبيقات QRT-PCR. ملاحظة: يتم توجيه جميع الأرقام الجنين بحيث المناطق الأمامية والخلفية هي في الجزء العلوي والسفلي من الصور، على التوالي. <img alt="الشكل 1" src="/files/ftp_upload/51596/51596fig1highres.jpg" /> الشكل 1. إجراء تشريح لتحديد الأجنة وحمار وحشي فينش، مراحل 1-10 22. تحديد موقع الجنين قبل المتداول بلطف صفار البيض حتى القرص الأبيض خافت هو واضح (A). مرة واحدة فييقع الجنين في وسط صفار البيض، يتم تشريح صفار البيض بطريقة تدريجية (B) حيث أول خفض يخفف من الضغط من الغشاء المحي (1) وتخفيضات لاحقة (2) الحدود في منطقة (ZJ) وهو تقاطع انضمت إلى الغشاء المحي. تمثل القضبان نطاق 1 مم. <img alt="الرقم 2" src="/files/ftp_upload/51596/51596fig2highres.jpg" /> الشكل 2. إزالة الغشاء المحي وضوح الهياكل الجنينية. بعد إزالة الجنين من صفار البيض، ومكان الجنين في طبق بتري تحتوي على 4٪ PFA. إذا كان التهجين في الموقع يحتاج إلى أن يؤديها، والرؤية من الهياكل الجنينية هو أمر ضروري ويمكن تحقيقه عن طريق إزالة الغشاء المحي (A). قبضة الغشاء المحي مع غرامة اضافية يميل ملقط وقشر بلطف بعيدا من الجنين من خلال التعامل مع الجنين مباشرة على حافة الأبعد، إذا لزم الأمر(B). إزالة الغشاء المحي يزيد ضوح الهياكل الجنينية، ويسمح ليمكن تصوير الأجنة أو معالجتها مع الموقع التهجين (C) في. تمثل القضبان نطاق 1 مم. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51596/51596fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الرقم 3" src="/files/ftp_upload/51596/51596fig3highres.jpg" /> الرقم 3. جبل الجامع في الموقع التهجين التي تجرى على الأجنة فينش حمار وحشي يتعرض تنمويا لميثيل الزئبق. أنماط التعبير من orthodenticle homeobox 2 (Otx2) تميزت في الأجنة تتعرض ل0.0 جزء في المليون ميثيل الزئبق (A، A &#39;) و 2.4 جزء في المليون ميثيل الزئبق (B، B &#39;) عن طريق اتباع نظام غذائي الوالدين. افعلRSAL (A) وبطني (A &#39;) التعبير عن Otx2 مرئيا في جميع أنحاء الدماغ المتوسط ​​والبصرية الحويصلات خلال مرحلة 12 22. تم تشريح الأجنة مجموعة العلاج عند نقطة الوقت نفسه، لكنه تأخر في النمو كما رأينا في الظهرية (B) وبطني (B &#39;) نظرا لهياكل الرأس، والتي هي سمة من مرحلة 11 22 المختصرات:. ميغابايت، الدماغ المتوسط؛ المرجع، الحويصلة البصرية. تمثل القضبان نطاق 1 مم. <img alt="الرقم 4" src="/files/ftp_upload/51596/51596fig4highres.jpg" /> الشكل 4. جبل الجامعة &#160; في الموقع &#160; إجراء التهجين على الأجنة حمار وحشي فينش يتعرض تنمويا لميثيل الزئبق. أنماط التعبير من orthodenticle homeobox 2 (Otx2) تميزت في المرحلة 6 22 امبري<html> السراج يتعرض ل0.0 جزء في المليون ميثيل الزئبق (A، A &#39;) والمرحلة 5 22 الأجنة تتعرض إلى 2.4 جزء في المليون ميثيل الزئبق (B، B&#39;) عن طريق اتباع نظام غذائي الوالدين. الاختصارات: صباحا، الحافة الأمامية من الأديم المتوسط؛ لا، الحبل الظهري، الأديم المتوسط ​​الحبل الظهري؛ بو، مقدم السلى، مسم الأريمة الأمامي؛ ملاحظة، خط بدائية 22. تمثل القضبان نطاق 1 مم. <img alt="الرقم 5" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51596/51596fig5highres.jpg" width="600" /> جبل الرقم 5. الجامع في الموقع &#160; إجراء التهجين على حمار وحشي فينش أجنة باستخدام الحس التحقيق. (A) المرحلة 5 22 الجنين. (B) المرحلة المبكرة 6 22 الجنين. (C) المرحلة 11 22 الجنين. تمثل القضبان نطاق 1 مم. 6 &quot;سرك =&quot; / files/ftp_upload/51596/51596fig6highres.jpg &quot;/&gt; الرقم 6. EDU التأسيس وبحماية المناخ دي في فينش حمار وحشي الأجنة. EDU &quot;فوق&quot; تم استخدام الكيمياء للكشف عن الخلايا المتكاثرة في مرحلة الجنين 16 22 (A، B، C). أدرج EDU في الحمض النووي في مكان ثيميدين 26 و 27 و تم الكشف عن استخدام بنقرة الكيمياء 27. انتشار غير واضحة للعيان في الحواف الجانبية للو somites، وtailbud. لوحة ويظهر انتشار تحدث حصرا في الخلفي من الجنين ويظهر أيضا الخلايا التكاثري الفردية. لوحة B يظهر مواقع التكاثري في الجنين كله. لوحة C يظهر في المنطقة الأمامية، ويظهر لل telencephalon التكاثري للغاية (الشركة المصرية للاتصالات) بمزيد من التفصيل. المختصرات: AF، أضعاف الذي يحيط بالجنين؛ بنك الإجارة الأول، forelimb برعم؛ HLB، hindlimb برعم؛ جنيه، عدسة حويصلة؛ مللي، الدماغ المتوسط؛ طن متري، الدماغ التالي؛ بمسانده، كوب البصرية؛ سنويا، البلعوم القوس؛ كيلومتر، الأديم المتوسط ​​الجسيدة؛ السل، tailbud؛ الشركة المصرية للاتصالات، الدماغ الانتهائي. تمثل القضبان نطاق 1 مم. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51596/51596fig6large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الرقم 7" src="/files/ftp_upload/51596/51596fig7highres.jpg" /> تم تشريح الرقم 7. الجودة من الحمض النووي الريبي المستخرج من تشريح الأجنة حمار وحشي فينش. التحكم (0.0 جزء في المليون) و 1.2 جزء في المليون الأجنة المجمدة ميثيل الزئبق والفلاش كما هو موضح في الخطوة 3.8. يظهر كل حارة الحمض النووي الريبي المستخرج من اثنين من الأجنة المتجانس من كل مجموعة العلاج.

Watch this Scientific Journal Video about Dissection and Downstream Analysis of Zebra Finch Embryos at Early Stages of Development at JoVE.com

Dissection and Downstream Analysis of Zebra Finch Embryos at Early Stages of Development

The zebra finch (Taeniopygiaguttata) is a valuable model organism; however, early stages of zebra finch development have not been extensively studied. The protocol describes how to dissect early embryos for developmental and molecular applications.

تشريح وتحليل المصب من زيبرا فينش الأجنة في المراحل الأولى من التطوير

The zebra finch (Taeniopygiaguttata) has become an increasingly important model organism in many areas of research including toxicology1,2, behavior3, and ...

dissection-downstream-analysis-zebra-finch-embryos-at-early-stages

Research

JoVE Journal

Biology

10.8K Views.  College of William and Mary. The zebra finch (Taeniopygiaguttata) is a valuable model organism; however, early stages of zebra finch development have not been extensively studied. The protocol describes how to dissect early embryos for developmental and molecular applications. 

Video: Dissection and Downstream Analysis of Zebra Finch Embryos at Early Stages of Development

Dissection of 6.5 dpc Mouse Embryos

Analysis of gene expression patterns during early stages of mammalian embryonic development can provide important clues about gene function, cell-cell interaction and signaling mechanisms that guide embryonic patterning. However, dissection of the mouse embryo from the decidua shortly after implantation can be a challenging procedure, and detailed step-by-step documentation of this process is lacking.

Here we demonstrate how post-implantation (6.5 dpc) embryos are isolated by first dissecting the uterus of a pregnant mouse (detection of the vaginal plug was designated day 0.5 poist coitum) and subsequently dissecting the embryo from maternal decidua. The dissection of Reichert's membrane is described as well as the removal of the ectoplacental cone.

Isolation of postimplantation-stage embryos allows one to study gene patterning and analyze cell-lineage decision making processes during embryonic development, but proper dissection of the early embryo can be challenging. This protocol describes a method for isolating early primitive-streak-stage embryos (~6.5 days post coitum [dpc]).

تشريح 6.5 أجنة الفئران DPC

Analysis of gene expression patterns during early stages of mammalian embryonic development can provide important clues about gene function, cell-cell ...

Preparation of Neuronal Cultures from Midgastrula Stage Drosophila Embryos

This video illustrates the procedure for making primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. The methods for collecting embryos and their dechorionation using bleach are demonstrated. Using a glass pipet attached to a mouth suction tube, we illustrate the removal of all cells from single embryos. The method for dispersing cells from each embyro into a small (5 l) drop of medium on an uncoated glass coverslip is demonstrated. A view through the microscope at 1 hour after plating illustrates the preferred cell density. Most of the cells that survive when grown in defined medium are neuroblasts that divide one or more times in culture before extending neuritic processes by 12-24 hours. A view through the microscope illustrates the level of neurite outgrowth and branching expected in a healthy culture at 2 days in vitro. The cultures are grown in a simple bicarbonate based defined medium, in a 5% CO2 incubator at 22-24&deg;C. Neuritic processes continue to elaborate over the first week in culture and when they make contact with neurites from neighboring cells they often form functional synaptic connections. Neurons in these cultures express voltage-gated sodium, calcium, and potassium channels and are electrically excitable. This culture system is useful for studying molecular genetic and environmental factors that regulate neuronal differentiation, excitability, and synapse formation/function.

This video demonstrates the preparation of primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. Views of live cultures show cells 1 hour after plating and differentiated neurons after 2 days of growth in a bicarbonate-based defined medium. The neurons are electrically excitable and form synaptic connections.

التحضير للثقافات متعلق بالخلايا العصبية من أجنة ذبابة الفاكهة المرحلة Midgastrula

This video illustrates the procedure for making primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. The methods for collecting embryos ...

Placing Growth Factor-Coated Beads on Early Stage Chicken Embryos

The neural tube expresses many proteins in specific spatiotemporal patterns during development. These proteins have been shown to be critical for cell fate determination, cell migration, and formation of neural circuits. Neuronal induction and patterning involve bone morphogenetic protein (BMP), sonic hedgehog (SHH), fibroblast growth factor (FGF), among others. In particular, the expression pattern of Fgf8 is in close proximity to regions expressing BMP4 and SHH. This expression pattern is consistent with developmental interactions that facilitate patterning in the telencephalon.

Here we provide a visual demonstration of a method in which an in ovo preparation can be used to test the effects of Fgfs in the formation of the forebrain. Beads are coated with protein and placed in the developing neural tube to provide sustained exposure. Because the procedure uses small, carefully placed beads, it is minimally invasive and allows several beads to be placed within a single neural tube. Moreover, the method allows for continued development so that embryos can be analyzed at a more mature stage to detect changes in anatomy and in neural patterning. This simple but useful protocol allows for real time imaging. It provides a means to make spatially and temporally limited changes to endogenous protein levels.

A variety of growth factors and proteins interact to induce cells to take on different cell fates during development. Here we demonstrate the use of an in ovo preparation to address possible interactions between different proteins in development by placing beads on E2.5 chick embryos.

وضع عامل النمو المغلفه الخرز على أجنة الدجاج المرحلة المبكرة

The neural tube expresses many proteins in specific spatiotemporal patterns during development.   These proteins have been shown to be critical for cell ...

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo (New Culture)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  the formation and patterning of brain, neural tube, somite and heart primordia. Applications of chick embryo culture include electroporation of DNA or RNA constructs in order to analyze gene function, grafts of growth factor coated beads such as FGFs and BMPs , as well as whole mount in situ hybridization and immunohistochemistry. This video demonstrates the different steps in chick embryo culture; First, the embryo is explanted in saline. Then, the embryo is centered on a glass ring. The membranes surrounding the embryo are lifted along the walls of the ring. The ring is then placed in a culture dish containing a pool of albumine. The culture dish is sealed and placed in a humid chamber, where the embryo is cultured for up to 24 hrs. Finally, the embryo is removed from the ring, fixed and processed for further applications. A troubleshooting guide is also presented.

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo New Culture

This video demonstrates New culture, a method by which chick embryos are cultured outside the egg for up to 24 hr. This method enables one to study early development (primitive streak to 14 som.), a period corresponding to E7-9 in mouse. Applications of this technique include electroporation, in situ hybridization and immunohistochemistry.

طريقة لثقافة الفرخ المبكر فيفو السابقين الأجنة (الثقافة الجديدة)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Double Whole Mount in situ Hybridization of Early Chick Embryos

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  gene expression in brain, neural tube, somite and heart primordia formation. This video demonstrates the different steps in 2-color whole mount in situ hybridization; First, the embryo is dissected from the egg and fixed in paraformaldehyde. Second, the embryo is processed for prehybridization. The embryo is then hybridized with two different probes, one coupled to DIG, and one coupled to FITC.  Following overnight hybridization, the embryo is incubated with DIG coupled antibody. Color reaction for DIG substrate is performed, and the region of interest appears blue. The embryo is then incubated with FITC coupled antibody. The embryo is processed for color reaction with FITC, and the region of interest appears red. Finally, the embryo is fixed and processed for phtograph and sectioning. A troubleshooting guide is also presented.

This video demonstrates 2-color whole mount in situ hybridization, a method by which the spatial and temporal expression pattern of 2 different genes can be visualized in young chick embryos. This method was originally introduced by David Wilkinson, Domingos Henrique, Phil Ingham and David Ish -Horowicz.

الجامعة جبل مزدوجة في الموقع التهجين لافراخ الدجاج في وقت مبكر

A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing measurement of multiple cellular phenotypes within a single assay. In this study, we utilized HCA to develop a novel assay for neurotoxicity. Neurotoxicity assessment represents an important part of drug safety evaluation, as well as being a significant focus of environmental protection efforts. Additionally, neurotoxicity is also a well-accepted in vitro marker of the development of neurodegenerative diseases such as Alzheimer's and Parkinson's diseases. Recently, the application of HCA to neuronal screening has been reported. By labeling neuronal cells with &beta;III-tubulin, HCA assays can provide high-throughput, non-subjective, quantitative measurements of parameters such as neuronal number, neurite count and neurite length, all of which can indicate neurotoxic effects. However, the role of astrocytes remains unexplored in these models. Astrocytes have an integral role in the maintenance of central nervous system (CNS) homeostasis, and are associated with both neuroprotection and neurodegradation when they are activated in response to toxic substances or disease states. GFAP is an intermediate filament protein expressed predominantly in the astrocytes of the CNS. Astrocytic activation (gliosis) leads to the upregulation of GFAP, commonly accompanied by astrocyte proliferation and hypertrophy. This process of reactive gliosis has been proposed as an early marker of damage to the nervous system. The traditional method for GFAP quantitation is by immunoassay. This approach is limited by an inability to provide information on cellular localization, morphology and cell number. We determined that HCA could be used to overcome these limitations and to simultaneously measure multiple features associated with gliosis - changes in GFAP expression, astrocyte hypertrophy, and astrocyte proliferation - within a single assay. In co-culture studies, astrocytes have been shown to protect neurons against several types of toxic insult and to critically influence neuronal survival. Recent studies have suggested that the use of astrocytes in an in vitro neurotoxicity test system may prove more relevant to human CNS structure and function than neuronal cells alone. Accordingly, we have developed an HCA assay for co-culture of neurons and astrocytes, comprised of protocols and validated, target-specific detection reagents for profiling &beta;III-tubulin and glial fibrillary acidic protein (GFAP). This assay enables simultaneous analysis of neurotoxicity, neurite outgrowth, gliosis, neuronal and astrocytic morphology and neuronal and astrocytic development in a wide variety of cellular models, representing a novel, non-subjective, high-throughput assay for neurotoxicity assessment. The assay holds great potential for enhanced detection of neurotoxicity and improved productivity in neuroscience research and drug discovery.

This article describes a novel protocol and reagent set designed for sensitive measurement of neurotoxic effects of compounds and treatments on co-cultures of neurons and astrocytes using high content analysis. Results demonstrate that high content analysis represents an exciting novel technology for neurotoxicity assessment.

والخلايا العصبية ونجمية المشارك الثقافة الفحص لتحليل محتوى عال من العصبية

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

Efficient and Rapid Isolation of Early-stage Embryos from Arabidopsis thaliana Seeds

In flowering plants, the embryo develops within a nourishing tissue - the endosperm - surrounded by the maternal seed integuments (or seed coat). As a consequence, the isolation of plant embryos at early stages (1 cell to globular stage) is technically challenging due to their relative inaccessibility. Efficient manual dissection at early stages is strongly impaired by the small size of young Arabidopsis seeds and the adhesiveness of the embryo to the surrounding tissues. Here, we describe a method that allows the efficient isolation of young Arabidopsis embryos, yielding up to 40 embryos in 1 hr to 4 hr, depending on the downstream application. Embryos are released into isolation buffer by slightly crushing 250-750 seeds with a plastic pestle in an Eppendorf tube. A glass microcapillary attached to either a standard laboratory pipette (via a rubber tube) or a hydraulically controlled microinjector is used to collect embryos from droplets placed on a multi-well slide on an inverted light microscope. The technical skills required are simple and easily transferable, and the basic setup does not require costly equipment. Collected embryos are suitable for a variety of downstream applications such as RT-PCR, RNA sequencing, DNA methylation analyses, fluorescence in situ hybridization (FISH), immunostaining, and reporter gene assays.

Efficient and Rapid Isolation of Early-stage Embryos from Arabidopsis thaliana Seeds

We report an efficient and simple method to isolate embryos at early stages of development from Arabidopsis thaliana seeds. Up to 40 embryos can be isolated in 1 hr to 4 hr, depending on the downstream application. The procedure is suitable for transcriptome, DNA methylation, reporter gene expression, immunostaining and fluorescence in situ hybridization analyses.

العزلة الفعالة والسريعة من الأجنة المبكرة مرحلة من<em&gt; thaliana نبات الأرابيدوبسيس</em&gt; بذور

In flowering plants, the embryo develops within a nourishing tissue - the endosperm - surrounded by the maternal seed integuments (or seed coat). As a ...

A Protocol for Lentiviral Transduction and Downstream Analysis of Intestinal Organoids

Intestinal crypt-villus structures termed organoids, can be kept in sustained culture three dimensionally when supplemented with the appropriate growth factors. Since organoids are highly similar to the original tissue in terms of homeostatic stem cell differentiation, cell polarity and presence of all terminally differentiated cell types known to the adult intestinal epithelium, they serve as an essential resource in experimental research on the epithelium. The possibility to express transgenes or interfering RNA using lentiviral or retroviral vectors in organoids has increased opportunities for functional analysis of the intestinal epithelium and intestinal stem cells, surpassing traditional mouse transgenics in speed and cost. In the current video protocol we show how to utilize transduction of small intestinal organoids with lentiviral vectors illustrated by use of doxycylin inducible transgenes, or IPTG inducible short hairpin RNA for overexpression or gene knockdown. Furthermore, considering organoid culture yields minute cell counts that may even be reduced by experimental treatment, we explain how to process organoids for downstream analysis aimed at quantitative RT-PCR, RNA-microarray and immunohistochemistry. Techniques that enable transgene expression and gene knock down in intestinal organoids contribute to the research potential that these intestinal epithelial structures hold, establishing organoid culture as a new standard in cell culture.

In this video protocol we give a step by step explanation of lentiviral transduction in organoids of primary intestinal epithelium and of processing and downstream analysis of these cultures by quantitative RT-PCR, RNA-microarray and immunohistochemistry.

بروتوكول لLentiviral تنبيغ وتحليل المصب من المعوية Organoids

Intestinal crypt-villus structures termed organoids, can be kept in sustained culture three dimensionally when supplemented with the appropriate growth ...

Xenopus laevis as a Model to Identify Translation Impairment

Protein synthesis is a fundamental process to gene expression impacting diverse biological processes notably adaptation to environmental conditions. The initiation step, which involves the assembly of the ribosomal subunits at the mRNA initiation codon, involved initiation factor including eIF4G1. Defects in this rate limiting step of translation are linked to diverse disorders. To study the potential consequences of such deregulations, Xenopus laevis oocytes constitute an attractive model with high degrees of conservation of essential cellular and molecular mechanisms with human. In addition, during meiotic maturation, oocytes are transcriptionally repressed and all necessary proteins are translated from preexisting, maternally derived mRNAs. This inexpensive model enables exogenous mRNA to become perfectly integrated with an effective translation. Here is described a protocol for assessing translation with a factor of interest (here eIF4G1) using stored maternal mRNA that are the first to be polyadenylated and translated during oocyte maturation as a physiological readout. At first, mRNA synthetized by in vitro transcription of plasmids of interest (here eIF4G1) are injected in oocytes and kinetics of oocyte maturation by Germinal Vesicle Breakdown detection is determined. The studied maternal mRNA target is the serine/threonine-protein-kinase mos. Its polyadenylation and its subsequent translation are investigated together with the expression and phosphorylation of proteins of the mos signaling cascade involved in oocyte maturation. Variations of the current protocol to put forward translational defects are also proposed to emphasize its general applicability. In light of emerging evidence that aberrant protein synthesis may be involved in the pathogenesis of neurological disorders, such a model provides the opportunity to easily assess this impairment and identify new targets.

Xenopus laevis as a Model to Identify Translation Impairment

Protein synthesis control occurs mainly at the translation initiation step, deficiencies in which are linked to diverse disorders. To better understand their etiology, we described here a protocol using Xenopus laevis oocytes assessing the translation of mos transcript in the presence of a mutant of translation initiation factor eIF4G1.

القيطم المورق نموذجا لتحديد الترجمة انخفاض قيمة

Protein synthesis is a fundamental process to gene expression impacting diverse biological processes notably adaptation to environmental conditions. The ...

Visualizing the Early Stages of Phagocytosis

The mammalian body is equipped with various layers of mechanisms that help to defend itself from pathogen invasions. Professional phagocytes of the immune system &#8212; such as neutrophils, dendritic cells, and macrophages &#8212; retain the innate ability to detect and clear such invading pathogens through phagocytosis1. Phagocytosis involves choreographed events of membrane reorganization and actin remodeling at the cell surface2,3. Phagocytes successfully internalize and eradicate foreign molecules only when all stages of phagocytosis are fulfilled. These steps include recognition and binding of the pathogen by pattern recognition receptors (PRRs) residing at the cell surface, formation of phagocytic cup through actin-enriched membranous protrusions (pseudopods) to surround the particulate, and scission of the phagosome followed by phagolysosome maturation that results in the killing of the pathogen3,4.
Imaging and quantification of various stages of phagocytosis is instrumental for elucidating the molecular mechanisms of this cellular process. The present manuscript reports methods to study the different phases of phagocytosis. We describe a microscope-based approach to visualize and quantify the binding, phagocytic cup formation, and the internalization of particulate by phagocytes. As phagocytosis occurs when innate receptors on phagocytic cells encounter ligands on a target particle bigger than 0.5 &#181;m, the assays we present here comprise the use of pathogenic fungi Candida albicans and other particulates such as zymosan and IgG-coated beads.

Here we describe a microscope-based technique to visualize and quantify the early cascades of events during phagocytosis of pathogens such as the fungi Candida albicans and particulates that are larger than 0.5 &#181;m including zymosan and IgG-coated beads.

تصور المراحل المبكرة من البلعمة

The mammalian body is equipped with various layers of mechanisms that help to defend itself from pathogen invasions. Professional phagocytes of the immune ...