وأيد هذا العمل من خلال تمويل لRAW مما يلي: المعاهد الوطنية للصحة منح K01 DK083512، DP2 OD008470، وR01 DK100237. مسيرة الدايمات باسل أوكونور كاتب الباحث جائزة منحة # 5 FY12-75. بدء الأموال من جامعة نوتردام كلية العلوم وقسم العلوم البيولوجية؛ وهدية سخية للجامعة نوتردام من إليزابيث ومايكل غالاغر نيابة عن غالاغر الأسرة لتعزيز أبحاث الخلايا الجذعية. كان الممولين أي دور في تصميم الدراسة وجمع البيانات وتحليلها، قرار نشر أو إعداد المخطوطة. نشكر الموظفين من قسم العلوم البيولوجية على دعمهم، ومركز للبحوث اسماك الزرد في نوتردام لتفانيهم المتميز في رعاية ورفاهية لدينا مستعمرة الزرد. أخيرا، نشكر أعضاء مختبر أبحاثنا على تعليقاتهم والمناقشات والرؤى عن هذا العمل.

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

هنا، التي وصفناها الأساليب التي تمكن التصور من مكونات قطاع كليون في الزرد الكبار. حقن تقارن ديكستران الفلورسنت يمكن وضع العلامات PCT تفضيلية بسبب خصائص التقامي هذه الخلايا نبيب الداني 30،38. هذه الطريقة لا يمكن أن يؤديها مع مرونة كبيرة بسبب وجود dextrans التي يمكن الحصول عليها مع سرب من تقارن الفلورسنت مختلفة. وبالإضافة إلى ذلك، فإن استخدام dextrans يسين قابل للتثبيت هو وسيلة مريحة وخاصة لتسمية قطاعات معاهدة التعاون بشأن البراءات، وليس مطلوبا من إجراءات وضع العلامات الثانوية. وهذا يتيح الكشف عن إشارة واضحة نسبيا ومتوافق مع العديد من العلامات الأخرى الفلورسنت، immunolabeling، واستخدام خطوط مراسل المعدلة وراثيا. وضع العلامات الفوسفاتيز القلوية يصادف أيضا نبيب الداني، مع تفاعل قوي في معاهدة التعاون بشأن البراءات وأضعف قليلا التفاعل في PST. أخيرا، وتلطيخ DBA يمكن وسم قطاعات أنبوب صغير البعيدة، والتي عرض الفصلaracteristic تشعبت التشكل. مختلف الجزيئات كتين، والتي هي بروتينات ملزمة السكر المنشأ nonimmune، وقد استخدمت على نطاق واسع للتمييز بين شرائح كليون الثدييات 47. ومن المثير للاهتمام أن DBA في الزرد يرتبط مع شرائح أنبوب صغير البعيدة، كما انها تستخدم للاحتفال القنوات جمع في الكلى الثدييات 47. أخذت معا، وهذه الأساليب يمكن استخدامها في تركيبات مختلفة لتوثيق تكوين الكلوي وظيفة. حيث أن جميع هذه الأساليب يمكن استخدامها في الأعمال التحضيرية الكلى كلها، لأنها توفر أدوات لتقييم هيكل كليون وظيفة في جميع أنحاء الجهاز دون الاعتماد كليا على استخدام المزيد من الوقت تستغرق وأساليب مملة، على سبيل المثال، العمل cryosection وimmunolabeling. ومع ذلك، فإن البقع الموضحة في هذه المقالة الأساليب هي قابلة للحياة في cryosection. تحليل عينات Cryosection يولد (مقارنة كله جبل) التي هي أكثر ملاءمة لالمناعية للكشف عن pepti محددةقصر، على الرغم بالطبع هذا النوع من التحليل يتطلب توافر الأجسام المضادة الأولية المناسبة. للأسف الحد رئيسي واحد في العمل مع نموذج حيواني الزرد يبقى توافر الفقراء من الأجسام المضادة. وهكذا تبقى WISH الأكثر استخداما، أي &quot;بأول ل،&quot; إجراء لتحليل التعبير الجيني. أتمنى باستخدام تفاعلات الركيزة BCIP، NBT، و / أو INT لإنتاج رواسب الأرجواني أو الأحمر غير متوافق مع تلطيخ الفلورسنت على cryosections. ويتمثل أحد الخيارات لاستدعاء استخدام الكشف WISH الفلورسنت، وهو الإجراء الذي تم الأمثل لعينات الجنينية الزرد، ويمكن أن تكون مصممة للاستخدام مع الكلى الكبار. وصف الأساليب في هذه المقالة الفيديو يجب أن تسمح لمزيد من التجارب مع تقنيات مثل WISH الفلورسنت في تركيبة مع خطوط الزرد المعدلة وراثيا التي وصفت شرائح الفردية مع مراسل مثل EGFP أو mCherry. بدلا من ذلك، الأساليب المذكورة هنا قد يزيد عدد الجياعد يتم اختبارها في تركيبة مع الأصباغ الحيوية الأخرى، على سبيل المثال، يكتينس الأخرى. وبالتالي، يمكن الاحتجاج مزيد من التكيف وتوسيع الطرق الموضحة هنا لتناسب احتياجات الباحث عن كامل الاستعدادات جبل الكلى والتحليل. على هذا النحو، وهذه الأساليب لها إمكانات العامة للتنفيذ مع نموذج الزرد للدراسات تجديد الجارية، وكذلك في النمذجة مرض وراثي. هناك حاجة ملحة للبحث والعلاجات المبتكرة للالآلام الكلوية. الملايين من الناس يعانون من شكل ما من أشكال أمراض الكلى في كل عام أن ينتج عن أسباب خلقية، الحادة و / أو المزمنة. وعلاوة على ذلك، وانتشار أمراض الكلى في ارتفاع مستمر في جميع أنحاء العالم، مما يجعل هذه الأمراض مشكلة صحية عامة عالمية 14،15. تتوفر العلاجات مثل غسيل الكلى حيث تخدم آلة غسيل الكلى الخارجية لتخليص دم المريض من النفايات الأيضية إذا كلاهم ليست قادرة على أداء هذا الدور. للأسف، هذا التدخل له حدود، والعلاج الجارية ضرورية من أجل البقاء. وعلاوة على ذلك، سوف تحتاج في نهاية المطاف مرضى زرع الكلى، والذي يمكن أن يستغرق سنوات للحصول مرة واحدة يتم وضع المريض على قائمة الانتظار. حتى بعد الحصول على عملية زرع الكلى، العديد من المرضى يعانون من آثار سلبية نتيجة لهذا الإجراء، ويجب أن المعركة هذه الآثار لبقية حياتهم. هذه الصعوبات تظهر الحاجة جادة لتطوير علاجات جديدة لمساعدة إما منع أمراض الكلى أو ربما إلى زيادة تجديد الأنسجة 8،16،52،53. نظرا للقيود أخلاقية واضحة لاستخدام اختبار المواضيع الإنسان في المختبرات الطبية الحيوية، النماذج الحيوانية ضرورية لدراسة الأمراض التي تصيب البشر والتسبب لاختبار علاجات جديدة. نتيجة لتشابهه التشريحية والقرب التطوري، أصبح الماوس النموذج الأكثر استخداما على نطاق واسع من الأمراض التي تصيب البشر 45. ومع ذلك، هناك بعض القيود مع هذا الحيوان، امبعجز جي لتصور تطوير الجهاز في الجسم الحي والتطبيق العملي استكمال شاشات جينية واسعة النطاق. الزرد هي نموذج كائن ذات صلة ومفيدة لدراسة تطوير الجهاز والنمذجة من الأمراض التي تصيب البشر 45،46. في ما يخص الأمراض التي تصيب البشر، homologs الوظيفية في الزرد وجود ما يقرب من 70٪ من جميع الجينات البشرية 54،55. وقد أبرزت الأعمال الأخيرة فائدة الزرد لكثير من مجالات البحث 31،37،56 الكلى. وتشير الدراسات إلى التجديد والإصلاح في الزرد بعد AKI أن تجديد أنبوب صغير الظهارية وneonephrogenesis نوعان من العمليات التي تحدث وتتداخل في جميع أنحاء تجديد timecourse 30،37. وقد استخدمت استخدام المضادات الحيوية أمينوغليكوزيد دعا جنتاميسين باعتبارها النموذج إصابة من خلالها لدراسة نتائج AKI في 29،30،37 الزرد الكبار. على مدى ما يقرب من أسبوعين من اصابة في الفترة التالية جنتاميسين، وtubul الدانيتجديد وفاق، وفي الوقت نفسه النيفرون جديدة تشكل في جميع أنحاء الجهاز 29،30،37. بشكل عام، فإن الآليات التي تنظم تجديد الظهارية لا تزال مثيرة للجدل. في واحدة آلية المقترحة من عملية الإصلاح، هناك حالة الإصابة الحادة الأولي تليها النزع من الخلايا الميتة في التجويف. بعد ذلك، هناك سلسلة من دي التمايز، والانتشار، وأحداث الهجرة، وبعد ذلك تفرق خلايا جديدة، إعادة إسكانها الغشاء القاعدي الجرحى واستعادة وظيفة إلى الموقع المصاب. بدلا من ذلك، واشارت دراسات أخرى أن الخلايا تنشأ من استبدال الخلايا الجذعية / السلف الموجودة داخل الأنابيب كليون. وفيما يتعلق بعملية neonephrogenesis في الزرد، وقد لوحظت المجاميع الخلوية التالي AKI بواسطة حقن جنتاميسين 29،30. هذه المجاميع تنضج لاحقا إلى النيفرون الجديدة التي راسيا في الأنابيب القائمة بالفعل 29،30. القاسم المشترك الذي يوحد كليون الظهارية تجديد وneonephrogenesis هو عامل الغموض الهائل من: في الوقت الحاضر هناك أضعافا مضاعفة المزيد من الأسئلة حول كيفية حدوث هذه المفاخر التجدد من هناك رؤى المتاحة. حتى الآن، ومع ذلك، العديد من خطوط مثيرة للأدلة تدعم فكرة أن الأبحاث تجديد الكلوي باستخدام الزرد يمكن أن توفر في الواقع رؤى المقارنة ذات الصلة في AKI الإنسان التي قد يكون لها أيضا متعدية المباشر المحتمل 56-58. الفحص الكيميائي لتحديد الجزيئات الصغيرة التي تزيد من انتشار الخلايا الكلوية السلف في الجنين الزرد أدى مؤخرا إلى تحديد deacetylase هيستون المانع ميثيل 4- (phenylthio) -butanoate (m4PTB) 56،57. كشفت إدارة هذا المجمع ليرقات الزرد مع الناجم عن جنتاميسين AKI أن بقاء اليرقات وزادت وتعززت أن انتشار أنبوبي كلوي 56،58. عندما عولجت فئران مع المعتدل الناجم عن نقص التروية AKI مع m4PTB، وتسارع الانتعاش في مساعدينتقم مع انخفاض في كل من ضمور أنبوبي ودورة الخلية القبض على الخلايا المتكاثرة أنبوبي كلوي 58. وتشير هذه النتائج إلى أن مسارات طبيعية المسؤولة عن تطوير الكلى الزرد و / أو استجابة التجدد إلى AKI سيتم حفظها مع الثدييات 56. وهكذا، في حين أن هناك حاجة إلى مزيد من الدراسات لندف بصرف النظر آليات تجديد وهما لتحديد مسارات الإشارات التي تشارك ويوفر لهم فهم التفاعلات الزرد واحد سيلة واعدة لتحقيق هذا الهدف المهم في مجال أمراض الكلى. أدوات مثل التسميات خلية كليون الموصوفة في هذا البروتوكول تمثل مجموعة من المقايسات التي يمكن استخدامها لتقييم تكوين الكلوي وظائف في نماذج AKI. علاوة على ذلك، يمكن تطبيقها لوصف النماذج المعدلة وراثيا من مرض في الكلى ويمكن أن توفر طرق لتحديد العلاجات الكيميائية قادرة على تعزيز استعادة هيكل كليون بعد سد الكلويالعمر.

الكلى هو الجهاز المعقد الذي يحقق العديد من الوظائف الفسيولوجية في الجسم. أهم وظيفة الكلى هي إفراز النفايات الأيضية، وتتشابك هذه المهمة بشكل وثيق مع الحفاظ على توازن السوائل. الكلى يؤدي هذه الوظائف من خلال تصفية الدم وتشكيل البول، في حين تنظم بالتزامن ضغط الدم، ومستويات المنحل بالكهرباء، والتوازن الحمضي القاعدي. الأنابيب الظهارية درجة عالية من التخصص ودعا النيفرون بمثابة وحدة وظيفية أساسية في الكلى 1،2. في الفقاريات الكبار، ويتم تنظيم النيفرون عادة في ترتيب ملفوف بإحكام المحيطة بها نظام الصرف الصحي المركزي، مما يسمح لكثير من الأنابيب لحزمة إلى الجهاز صغير إلى حد ما. على سبيل المثال، يمكن أن تحتوي كل كلية البشري أكثر من 1 مليون النيفرون 3. الثدييات الأخرى مثل الماوس تمتلك بناء على أمر من 8-10000 النيفرون في الكلى 4. درجة التعقيد الكلوي تختلف بين هذه الثدييات وغيرها من نبات أخضرebrates بسبب الاختلافات في إجمالي عدد كليون والتصميم المعماري في غضون الكلى. أنواع الفقاريات تشكل ما يصل الى ثلاثة هياكل الكلى المتعاقبة خلال التنمية، ويعرض كل شكل زيادة التعقيد فيما يتعلق الوقف كليون وترتيب: للسليفة الكلوة، mesonephros، والكلوة التالية. هيكل الكلوي الماضي ليتم الاحتفاظ بمثابة الكلى الكبار الجهاز، عادة mesonephros أو الكلوة التالية 2. كل شكل الكلى، ولكن لديه تكوين القائم على كليون 2. النيفرون هو العمود الفقري في الكلى وهو المسؤول عن ترشيح الدم جنبا إلى جنب مع إفراز الأيض واستيعابهم. النيفرون هي هياكل أنبوبية بسيطة تتألف من الخلايا الظهارية ولها تنظيم المجزأ، التي المنفصلة، ​​مجالات متخصصة للغاية من ظهائر متباينة أداء مهام محددة. في ترتيب تدفق الترشيح من خلال كليون، هناك عادة ثلاثة أجزاء رئيسية comprisالبريد لكل وحدة: (1) كرية الكلى، (2) مع أنبوب صغير القريبة والمتوسطة والبعيدة قطاعات، و (3) جمع القناة 1. نبيب الداني هو المسؤول عن استيعاب من المواد المذابة العضوية، وأهمها الجلوكوز والأحماض الأمينية 1. نبيب المتوسطة (أو حلقة من هنلي) هو موقع كبير من الملح والماء التنظيم 1. أخيرا، صقل من الملح والأيونات الأخرى يحدث في نبيب القاصي وجمع القناة ويتم تنظيم كبير من قبل نظام الغدد الصماء 1. من هناك، ويسافر الراشح من خلال الحالب والمثانة، والخروج في نهاية المطاف الجسم كمنتج النفايات 1. فقدان وظائف الكلى يمكن أن تنبع من العديد من الأسباب التي تمنع النشاط كليون العادي. يمكن أن تحدث هذه الأسباب أثناء التطور الكلى، مثل العيوب الخلقية التي تؤدي إلى تشوه من النيفرون 5، أو لأسباب من أنواع مختلفة من الإصابة (النابعة من كلا الوراثية وenvironmeأصول ntal). تصنف على نطاق واسع الإصابات المكتسبة وإصابة حادة في الكلى وكالة (آكي) أو إصابة الكلى المزمن (CKD). AKI ينطوي على خسارة مفاجئة من وظيفة الكلى، غالبا ما ينتج عن نقص التروية أو السم التعرض 6،7. في الثدييات، وإصلاح الظهارية كليون ممكن بعد مثل هذه الإصابات 8، وكثير من الناس تظهر الاستعادة الكاملة من وظيفة الكلى بعد AKI. ومع ذلك، يرتبط AKI أيضا مع ارتفاع معدلات المراضة والوفيات التي تم الإبلاغ عنها عبر واسع 30 - 70٪ النطاق الإصابة 6،7. CKD، في المقابل، ويرتبط مع الفقدان التدريجي لوظائف الكلى الناتج عن سنوات من الضرر لفترات طويلة، التي ترتبط عادة مع التليف 8،9. وعلاوة على ذلك، يوجد تفاعل بين AKI وCKD، وإما يمكن لأحد أن يهيئ الفرد للآخرين 10-12. على سبيل المثال، أولئك الذين عانوا من AKI هم أكثر عرضة للCKD وحتى الموت 13. الإصابة بأمراض الكلى، سواء في الولايات المتحدة وجميع أنحاء العالم، وقد بلغ epideومن المتوقع النسب وهيئة التصنيع العسكري في الارتفاع مع توسع-بالتالي السكان الذين تتراوح أعمارهم بين أن هناك حاجة متزايدة لتحديد التدخلات الطب التجديدي ل14،15 الكلى. على الرغم من معرفة أن المرضى AKI يمكن استرداد، منذ فترة طويلة يعتقد أن الكلى هو الجهاز دون صلاحيات التجدد الفطرية. تم عرض هذه النظرة التقليدية المعدلة بشكل كبير في السنوات الأخيرة 16. وقد أظهرت دراسات التحقيق الضرر الكلوي في الفئران والجرذان بعد AKI أن الخلايا الظهارية كليون أنبوب صغير يمكن أن تتكاثر وإعادة بناء النيفرون الوظيفية 17-20. على الرغم من أن الثدييات تمتلك هذه القدرة على التكيف لتجديد النيفرون، وهناك قيود ملحوظة والاستجابات غير القادرة على التأقلم يمكن أن تسبب التي تؤدي إلى التليف الكلوي وCKD 21. على سبيل المثال، أظهرت دراسة حديثة أن تكرار الاجتثاث الخلايا الظهارية في النيفرون الفئران ارتبط تجديد تقلص والنيفرون، مما يشير إلى تليف الكلى هفعصام محدودة تجديد عتبة 22. ليس هناك أدلة على أن البالغين الكلى الثدييات يشكل النيفرون جديدة لتحل محل تلك المفقودة أو التالفة، وبالتالي تدميرها يؤدي إلى عجز دائم 8،9 كليون. ومن المثير للاهتمام، وبعض الفقاريات لا تستجيب لAKI بواسطة ظهائر تجديد كليون وأيضا إنتاج النيفرون الجديدة، المشار إليها باسم عملية neonephrogenesis أو كليون neogenesis 23. Neonephrogenesis يحدث في الأسماك بعد التعرض للسموم أو بتر جزئي، وشملت نماذج إصابة تاريخيا ذهبية 24،25، البلطي 26، 27 تزلج، الميداكا 28، ومؤخرا، الزرد 29،30. من هذه، الزرد تقدم نموذجا قابلا للتطبيق الأبحاث الجينية لاكتشاف مسارات الخلوية والجزيئية المسؤولة عن تجديد الكلوي. في هذه المقالة الفيديو، ونحن لشرح كيفية تسمية قطاعات كليون في الزرد الكبار. علم التشريح كليون، وميزات الجزيئية،والخصائص الفنية ضرورية للدراسات المستقبلية الكلى ناجحة باستخدام الزرد. الكلى الزرد الكبار هو بنية mesonephros وبطبيعتها هي أقل تعقيدا من حيث عدد كليون وتنظيم من هيكل الكلوة التالية وجدت في الثدييات الكبار، avians، والزواحف 31. ومع ذلك، الزرد تنظيم قطاع كليون يماثل إلى الثدييات، وثقت لأول مرة في الكلى الجنينية استنادا إلى دراسات التعبير الجيني 31-35. النيفرون الجنين الزرد تحتوي على شرائح خطية نبيب التي تشمل نبيب الملتوية القريبة (PCT)، النبيبات الدانية على التوالي (PST)، البعيدة في وقت مبكر (DE)، والقاصي الراحل (DL) 31-35 (الشكل 1). النيفرون الزرد الكبار تمتلك قطاعات أنبوبي مماثلة 30،31،36،37 (الشكل 1). كما يمكن التعرف على معاهدة التعاون بشأن البراءات من قبل النمط الظاهري وظيفية: سوف الخلايا الظهارية في المعاهدة تتضمن مركبات ديكستران fluorescently المسمى (10-70 كيلو دالتون في حجم) موجودة فيالتداول، التي استخدمت في كل من الجنينية والكبار الكلى الزرد لتقييم امتصاص التقامي بواسطة هذه الخلايا نبيب الداني 38-41 (الشكل 1). فارق واحد في قطاعات كليون بين الزرد والثدييات هو أن الزرد تفتقر إلى أنبوب صغير وسيطة، أو حلقة من هنلي 30-37. لأن هذا جزء ظائف في الثدييات للحفاظ على المياه، والزرد هي أنواع المياه العذبة دون حاجة ملحة للتركيز البول، فإنه ليس من المستغرب أن الزرد تفتقر هذه الشريحة 32،33. وهكذا، فإن الحفاظ تكوين كليون العام إلى حد كبير بين الزرد والكلى الثدييات 32،33. وقد مكنت هذه التشابهات الزرد أن يكون أداة بحث فعالة للتحقيق وظائف الجينات وأعرب الكلوي خلال التنموية 32-35،42 تكون الكلية ونموذج العديد من أمراض الكلى 43،44، مما يضيف إلى قائمة كبيرة من الشروط البشرية التي يمكن أن تكون التحقيق باستخدامالزرد 45،46. اليوم، الكلى الزرد الكبار هو نموذج جذاب للدراسات المقارنة للتجديد الكلوي بسبب قابلية الإستطراق لها الجيني والحنك توسيع الموارد التكنولوجية المتاحة لاستجواب وظيفة الجين ومسارات الإشارات في هذا النوع. وقد استخدمت العديد من الدراسات وmesonephros الزرد للتحقيق في آليات تجديد بعد AKI 29،30،37. لمواصلة البحث AKI باستخدام الكلى الزرد الكبار، فمن الضروري أن يكون طرق رائعة لتسمية المناطق كليون مختلفة وأساليب لدراسة وظائف كليون. وقد تم تكييف عدة طرق للتحليل الكلى البالغين من بروتوكولات الكلى الجنينية. حقن داخل الصفاق من ديكستران fluorescently المسمى في الزرد الكبار تسميات ظهارة معاهدة التعاون بشأن البراءات في mesonephros النيفرون عبر الإلتقام 30، كما في الأجنة الزرد 38-41 (الشكل 1). وقد استخدم هذا الأسلوب لvisualizه عندما الأنابيب القريبة استعادة الممتلكات إمتصاص ثانية في أعقاب AKI، والتي تمكن من تقييم واحد استعادة وظيفة فسيولوجية 30 (الشكل 1). ميزة أخرى من كليون نبيب الداني هي أن الخلايا الظهارية في هذا القطاع تمتلك الحدود فرشاة 37 التي تظهر مستويات عالية من النشاط الذاتية الفوسفاتيز القلوية. وهكذا، فإن ظهارة القريبة يمكن أن تكون مترجمة بصريا في الكلى الكبار الزرد باستخدام تقنية القائم على مضان المعروفة باسم ELF- (انزيم المسمى الإسفار) 47 -97. هنا، نحن تصف كيفية تنفيذ المقايسات امتصاص الفلورسنت ديكستران 30،48 في الكلى الكبار الزرد، وذلك للحصول على التقييم الوظيفي للنبيب الداني ورسم خريطة للحجم وملامح هذه الشريحة أنبوب صغير. المقبل، ونحن تصف التقنيات لتسمية المناطق نبيب القريبة من كليون الكبار مع الفلورسنت الفوسفاتيز القلوية التسمية. الثالث، وتبين لنا لأول مرة أن rhodأمين الموسومة كتين Dolichos biflorus راصة (DBA)، والتي تم استخدامها كعلامة العامة للمجاري جمع في الكلى الثدييات 49، يصادف الأنابيب البعيدة للبالغين الكلى الزرد. كما DBA تبادلية لالفوسفاتيز القلوية تلطيخ، هذه التسميات توفر وسيلة للتمييز على نطاق واسع لعموم الداني مقابل تمتد لعموم البعيدة للكليون الكبار الزرد. من خلال تنفيذ هذه البقع الفلورية في كل من جبل بأكمله والمقاطع النسيجية ناظم البرد، فإننا ربط هذه التسميات مع مجالات التعبير عن الجينات نقل المذاب التي تنفرد بتحديد كل قطعة كليون. لذا يحتوي هذا البروتوكول أيضا دليل لإجراءات معالجة الأنسجة تعديل لأنسجة البالغين جبل بأكمله في الموقع التهجين (WISH) في التحليل القائم على موقعنا على الجنين بروتوكول WISH 50. يمكن استخدام هذه الإجراءات في توليفات مختلفة (الشكل 2) لتوثيق الصفات المورفولوجية والوظيفية سو الكبار النيفرون الكلى الزرد. وبالتالي، هذه البروتوكولات يمكن تطبيقها على الدراسات تجديد، وتوصيف المظهري من غيرها من النماذج مرض الكلى، وحتى تستخدم لدراسة تشكيل الكلى الكبار.

<table><tbody><tr><td>1X PBS</td><td></td><td></td><td>Made by diluting 10 X PBS in distilled water.</td></tr><tr><td>1X PBST</td><td></td><td></td><td>0.1% Tween-20 detergent in 1 X PBS.</td></tr><tr><td>1X PBS with 0.05 % Tween</td><td></td><td></td><td>0.05% Tween-20 detergent in 1 X PBS.</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB02038</td><td></td></tr><tr><td>4% PFA/1X PBS</td><td></td><td></td><td>Dissolve 4% PFA (w/v) (Electron Microscopy Sciences, Cat # 19210) in 1 X PBS, bring to boil on a hot plate in a fume hood. Cool and freeze the aliquots for storage in the freezer at -20&amp;deg;C. Thaw just before use and do not refreeze stocks.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Fine Forceps</td><td>Roboz</td><td>RS-1050</td><td>Dumont Tweezers Pattern #55&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Glass slide</td><td>Thermo-Fisher</td><td>4445</td><td>White Frost&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Glass coverslip</td><td>Thermo-Fisher</td><td>12-540A</td><td>18 x 18 mm</td></tr><tr><td>Modeling clay</td><td>Hasbro</td><td>Playdoh</td><td>Other modeling clays can be substituted and work similarly</td></tr><tr><td>Slide holder</td><td>Thermo-Fisher</td><td>12-587</td><td>Optional: cardboard tray to store slides flat</td></tr><tr><td>Bleaching solution</td><td></td><td></td><td>Bleach mix formula (for a 20 ml solution):&lt;br/&gt; 1.6 ml of 10% Potassium hydroxide solution&lt;br/&gt; 0.6 ml of 30% Hydrogen peroxide solution&lt;br/&gt; 100 &amp;mu;l of 20% Tween&lt;br/&gt; Fill to 20 ml with distilled water</td></tr><tr><td>Potassium hydroxide</td><td>Sigma</td><td>221473</td><td></td></tr><tr><td>Hydrogen peroxide</td><td>Sigma</td><td>H1009</td><td></td></tr><tr><td>Blocking solution</td><td></td><td></td><td>Blocking Solution (for a 10 ml solution):&lt;br/&gt; 8 ml of 1X PBS with 0.05% Tween&lt;br/&gt; 2 ml of fetal calf serum&lt;br/&gt; 150 &amp;mu;l of DMSO</td></tr><tr><td>Alkaline phosphatase activity detection</td><td>Invitrogen</td><td>E6601</td><td>We utilize the ELF 97 Endogenous Phosphatase Detection Kit.&amp;nbsp; To prepare the working substrate solution, dilute the substrate 20-fold in the detection buffer, according to the manufacturer&#039;s instructions.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Alkaline phosphatase wash solution</td><td></td><td></td><td>Recipe for Wash Buffer Solution (for a 100 ml solution):&lt;br/&gt; 5 ml of 0.5 M EDTA&lt;br/&gt; 120 mg of Levamisole&lt;br/&gt; 95 ml of 1X PBS</td></tr><tr><td>Dextran, fluorescein, 40,000 MW</td><td>Invitrogen</td><td>D1844</td><td>Dilute with distilled water to make a 50 mg/ml stock solution, and store aliquots in the freezer at -20&amp;deg;C.</td></tr><tr><td>Dextran, cascade blue, 10,000 MW</td><td>Invitrogen</td><td>D1976</td><td>Dilute with distilled water to make a 50 mg/ml stock solution, and store aliquots in the freezer at -20&amp;deg;C.</td></tr><tr><td>Dextran, lucifer yellow, 10,000 MW</td><td>Invitrogen</td><td>D1825</td><td>Dilute with distilled water to make a 50 mg/ml stock solution, and store aliquots in the freezer at -20&amp;deg;C.</td></tr><tr><td>Dextran, tetramethylrhodamine (fluoro-ruby), 10,000 MW</td><td>Invitrogen</td><td>D1817</td><td>Dilute with distilled water to make a 50 mg/ml stock solution, and store aliquots in the freezer at -20&amp;deg;C.</td></tr><tr><td>Dolichos biflorus agglutinin (DBA)-rhodamine</td><td>Vector laboratories</td><td>RL-10-32</td><td>DBA Staining Solution (for a 100 &amp;mu;l solution):&lt;br/&gt; 1 &amp;mu;l of DBA&lt;br/&gt; 99 &amp;mu;l of 1X PBS</td></tr><tr><td>Propidium iodide</td><td>Invitrogen</td><td>E6601</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>P1304MP</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield hard set mounting medium</td><td>Vector laboratories</td><td>H-1400</td><td></td></tr><tr><td>Micro cover glass</td><td>VWR</td><td>48393081</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide, DMSO</td><td>American Bioanalytical</td><td>67-68-5</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma</td><td>S0289</td><td></td></tr><tr><td>EDTA, 0.5 M solution, pH 8.0</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB00502</td><td></td></tr><tr><td>Levamisole</td><td>Sigma</td><td>L-9756</td><td></td></tr><tr><td>Tissue freezing medium</td><td>Triangle Biomedical Sciences, Inc.</td><td>TFM-C</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek Cryomold Biopsy, 10 x 10x 5 mm</td><td>Sakura Finetek</td><td>4565</td><td></td></tr><tr><td>TruBond 380 adhesive microscope slides</td><td>Tru Scientific</td><td>0380W</td><td></td></tr><tr><td>Liquid blocker &amp;ndash; super PAP pen</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>71312</td><td></td></tr><tr><td>Immuno stain moisture chamber</td><td>Evergreen Scientific</td><td>240-9020-Z10</td><td></td></tr><tr><td>Cryostat</td><td>Therm</td><td>Microm&amp;trade; HM 525 Cryostat</td><td></td></tr><tr><td>Stereomicroscope</td><td>Nikon</td><td>SMZ645; SMZ1000; 83455 P-Blue GFP/DAPI; 83457 P-Endow GFP/FITC; 83457 P-TRITC</td><td>Filter set used was as follows: Hoechst/DAPI filter was used for DAPI, propidium iodide, dextran-cascade blue and alkaline phosphatase detection. GFP/FITC filter was used for dextran-FITC, dextran lucifer yellow, and anti-GFP detection. The TRITC filter was used for dextran-fluoro-ruby, PI, and DBA detection.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Compound microscope</td><td>Nikon</td><td>96310 C-FL UV-2E/C DAPI; 96311 C-FL B-2E/C FITC; 96313 C-FL Y-2E/C Texas Red</td><td>Filter set used was as follows: Hoechst/DAPI filter was used for DAPI, propidium iodide, dextran-cascade blue and alkaline phosphatase detection. GFP/FITC filter was used for dextran-FITC, dextran lucifer yellow, and anti-GFP detection. The Texas Red filter was used for dextran-fluoro-ruby, PI, and DBA detection.&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr></tbody></table>

analysis of nephron composition and function in the adult zebrafish kidney

وقد برز نموذج الزرد كنظام ذات الصلة لدراسة تطوير الكلى، وتجديد والمرض. كلا تتكون الكلى الزرد الجنينية والكبار من الوحدات الوظيفية المعروفة باسم النيفرون، والتي يتم حفظها للغاية مع الفقاريات الأخرى، بما في ذلك الثدييات. وقد أظهرت الأبحاث في الزرد مؤخرا أن اثنين من الظواهر المميزة ارشح بعد النيفرون الكبار تكبد الضرر: أولا، هناك تجديد قوي داخل النيفرون القائمة التي تحل محل الخلايا الظهارية أنبوب صغير تدميرها؛ الثانية، يتم إنتاج النيفرون جديدة كليا من الأسلاف الكلى في عملية تعرف باسم neonephrogenesis. في المقابل، البشر والثدييات الأخرى يبدو أن لديها سوى قدرة محدودة لكليون الظهارية التجدد. حتى الآن، الآليات المسؤولة عن هذه الظواهر تجديد الكلى لا تزال ضعيفة مفهومة. منذ الكلى الزرد الكبار على حد سواء الخضوع كليون الظهارية تجديد وneonephrogenesis، أنها توفر الفقرة التجريبية المتميزةdigm لدراسة هذه الأحداث. وعلاوة على ذلك، هناك مجموعة واسعة من الأدوات الوراثية والدوائية المتوفرة في نموذج الزرد التي يمكن استخدامها لتحديد الآليات الخلوية والجزيئية التي تنظم تجديد الكلوي. واحد جانبا أساسيا من هذه البحوث هو تقييم هيكل كليون وظيفة. يصف هذا البروتوكول مجموعة من تقنيات وضع العلامات التي يمكن استخدامها لقياس وظائف الكلى تكوين اختبار نفرون في الكلى الزرد الكبار. وهكذا، وهذه الأساليب قابلة للتطبيق على نطاق واسع على توصيف المظهري المستقبل الزرد نماذج الكبار إصابة الكلى، والتي تشمل ولكن لا تقتصر على الأنظمة التعرض nephrotoxicant أو الأساليب الوراثية لموت الخلايا المستهدفة مثل nitroreductase بوساطة تقنية الاجتثاث الخلية. وعلاوة على ذلك، يمكن استخدام هذه الأساليب لدراسة الاضطرابات الوراثية في تشكيل الكلى الكبار ويمكن أن تطبق أيضا على تقييم الوضع الكلوي خلال النمذجة المرض المزمن.

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Nephron Composition and Function in the Adult Zebrafish Kidney at JoVE.com

Analysis of Nephron Composition and Function in the Adult Zebrafish Kidney

الكلى الكبار الزرد هو نظام ممتاز للتجديد وأمراض الكلى الدراسات. جانبا أساسيا من هذه البحوث هو تقييم هيكل كليون وظيفة. يصف هذا البروتوكول عدة المنهجيات التي يمكن تنفيذها لتقييم تكوين كليون أنبوب صغير وتقييم استيعاب الكلوي.

تحليل التركيب كليون وظيفة في الكلى اسماك الزرد الكبار

The zebrafish model has emerged as a relevant system to study kidney development, regeneration and disease. Both the embryonic and adult zebrafish kidneys ...

analysis-nephron-composition-function-adult-zebrafish

Research

JoVE Journal

Biology

44.4K Views.  University of Notre Dame.  الكلى الكبار الزرد هو نظام ممتاز للتجديد وأمراض الكلى الدراسات. جانبا أساسيا من هذه البحوث هو تقييم هيكل كليون وظيفة. يصف هذا البروتوكول عدة المنهجيات التي يمكن تنفيذها لتقييم تكوين كليون أنبوب صغير وتقييم استيعاب الكلوي. 

Video: Analysis of Nephron Composition and Function in the Adult Zebrafish Kidney

Kidney Regeneration in Adult Zebrafish by Gentamicin Induced Injury

The kidney is essential for fluid homeostasis, blood pressure regulation and filtration of waste from the body. The fundamental unit of kidney function is the nephron. Mammals are able to repair existing nephrons after injury, but lose the ability to form new nephrons soon after birth. In contrast to mammals, adult fish produce new nephrons (neonephrogenesis) throughout their lives in response to growth requirements or injury. Recently, lhx1a has been shown to mark nephron progenitor cells in the adult zebrafish kidney, however mechanisms controlling the formation of new nephrons after injury remain unknown. Here we show our method for robust and reproducible injury in the adult zebrafish kidney by intraperitoneal (i.p.) injection of gentamicin, which uses a noninvasive visual screening process to select for fish with strong but nonlethal injury. Using this method, we can determine optimal gentamicin dosages for injury and go on to demonstrate the effect of higher temperatures on kidney regeneration in zebrafish.

Here we present a reliable method to study adult kidney regeneration by inducing acute kidney injury by gentamicin injection. We show that injury is dependent on gentamicin dosage and environmental temperature using in situ hybridization to label lhx1a+ developing new nephrons.

التجديد الكلى في اسماك الزرد الكبار قبل جنتاميسين المستحثة الإصابات

The kidney is essential for fluid homeostasis, blood pressure regulation and filtration of waste from the body. The fundamental unit of kidney function is ...

Developmental Biology

Analysis of Zebrafish Kidney Development with Time-lapse Imaging Using a Dissecting Microscope Equipped for Optical Sectioning

In order to understand organogenesis, the spatial and temporal alterations that occur during development of tissues need to be recorded. The method described here allows time-lapse analysis of normal and impaired kidney development in zebrafish embryos by using a fluorescence dissecting microscope equipped for structured illumination and z-stack acquisition. To visualize nephrogenesis, transgenic zebrafish (Tg(wt1b:GFP)) with fluorescently labeled kidney structures were used. Renal defects were triggered by injection of an antisense morpholino oligonucleotide against the Wilms tumor gene wt1a, a factor known to be crucial for kidney development.
The advantage of the experimental setup is the combination of a zoom microscope with simple strategies for re-adjusting movements in x, y or z direction without additional equipment. To circumvent focal drift that is induced by temperature variations and mechanical vibrations, an autofocus strategy was applied instead of utilizing a usually required environmental chamber. In order to re-adjust the positional changes due to a xy-drift, imaging chambers with imprinted relocation grids were employed.
In comparison to more complex setups for time-lapse recording with optical sectioning such as confocal laser scanning&#160;or light sheet microscopes, a zoom microscope is easy to handle. Besides, it offers dissecting microscope-specific benefits such as high depth of field and an extended working distance.
The method to study organogenesis presented here can also be used with fluorescence stereo microscopes not capable of optical sectioning. Although limited for high-throughput, this technique offers an alternative to more complex equipment that is normally used for time-lapse recording of developing tissues and organ dynamics.

The method described here allows time-lapse analysis of organ development in zebrafish embryos by using a fluorescence dissecting microscope capable of performing optical sectioning and simple strategies of readjustment to correct focal and planar drift.

تحليل التنمية الكلى الزرد مع الوقت الفاصل بين التصوير باستخدام مجهر تشريح مجهزة لباجتزاء البصري

In order to understand organogenesis, the spatial and temporal alterations that occur during development of tissues need to be recorded. The method ...

Dissection of Organs from the Adult Zebrafish

Over the last 20 years, the zebrafish has become a powerful model organism for understanding vertebrate development and disease.  Although experimental analysis of the embryo and larva is extensive and the morphology has been well documented, descriptions of adult zebrafish anatomy and studies of development of the adult structures and organs, together with techniques for working with adults are lacking. The organs of the larva undergo significant changes in their overall structure, morphology, and anatomical location during the larval to adult transition.  Externally, the transparent larva develops its characteristic adult striped pigment pattern and paired pelvic fins, while internally, the organs undergo massive growth and remodeling.  In addition, the bipotential gonad primordium develops into either testis or ovary.  This protocol identifies many of the organs of the adult and demonstrates methods for dissection of the brain, gonads, gastrointestinal system, heart, and kidney of the adult zebrafish. The dissected organs can be used for in situ hybridization, immunohistochemistry, histology, RNA extraction, protein analysis, and other molecular techniques.  This protocol will assist in the broadening of studies in the zebrafish to include the remodeling of larval organs, the morphogenesis of organs specific to the adult and other investigations of the adult organ systems.

This protocol describes a procedure for identifying and dissecting organs from the adult zebrafish.

تشريح هيئات من اسماك الزرد الكبار

Over the last 20 years, the zebrafish has become a powerful model organism for understanding vertebrate development and disease.  Although experimental ...

In Situ Hybridization in Zebrafish Larvae and Juveniles during Mesonephros Development

The zebrafish forms two kidney structures in its lifetime. The pronephros (embryonic kidney) forms during embryonic development and begins to function at 2 days post fertilization. Consisting of only two nephrons, the pronephros serves as the sole kidney during larval life until more renal function is required due to the increasing body mass. To cope with this higher demand, the mesonephros (adult kidney) begins to form during metamorphosis. The new primary nephrons fuse to the pronephros and form connected lumens. Then, secondary nephrons fuse to primary ones (and so on) to create a branching network in the mesonephros. The vast majority of research is focused on the pronephros due to the ease of using embryos. Thus, there is a need to develop techniques to study older and larger larvae and juvenile fish to better understand mesonephros development. Here, an in situ hybridization protocol for gene expression analysis is optimized for probe penetration, washing of probes and antibodies, and bleaching of pigments to better visualize the mesonephros. The Tg(lhx1a-EGFP) transgenic line is used to label progenitor cells and the distal tubules of nascent nephrons. This protocol fills a gap in mesonephros research. It is a crucial model for understanding how new kidney tissues form and integrate with existing nephrons and provide insights into regenerative therapies.

In Situ Hybridization in Zebrafish Larvae and Juveniles during Mesonephros Development

The zebrafish is an important model for understanding kidney development. Here, an in situ hybridization protocol is optimized to detect gene expression in zebrafish larvae and juveniles during mesonephros development.

في سيتو التهجين في يرقات حمار وحشي والأحداث خلال تطوير Mesonephros

The zebrafish forms two kidney structures in its lifetime. The pronephros (embryonic kidney) forms during embryonic development and begins to function at ...

Dissection of the Adult Zebrafish Kidney

Researchers working in the burgeoning field of adult stem cell biology seek to understand the signals that regulate the behavior and function of stem cells during normal homeostasis and disease states. The understanding of adult stem cells has broad reaching implications for the future of regenerative medicine1. For example, better knowledge about adult stem cell biology can facilitate the design of therapeutic strategies in which organs are triggered to heal themselves or even the creation of methods for growing organs in vitro that can be transplanted into humans1. The zebrafish has become a powerful animal model for the study of vertebrate cell biology2. There has been extensive documentation and analysis of embryonic development in the zebrafish3. Only recently have scientists sought to document adult anatomy and surgical dissection techniques4, as there has been a progressive movement within the zebrafish community to broaden the applications of this research organism to adult studies. For example, there are expanding interests in using zebrafish to investigate the biology of adult stem cell populations and make sophisticated adult models of diseases such as cancer5. Historically, isolation of the zebrafish adult kidney has been instrumental for studying hematopoiesis, as the kidney is the anatomical location of blood cell production in fish6,7. The kidney is composed of nephron functional units found in arborized arrangements, surrounded by hematopoietic tissue that is dispersed throughout the intervening spaces. The hematopoietic component consists of hematopoietic stem cells (HSCs) and their progeny that inhabit the kidney until they terminally differentiate8. In addition, it is now appreciated that a group of renal stem/progenitor cells (RPCs) also inhabit the zebrafish kidney organ and enable both kidney regeneration and growth, as observed in other fish species9-11. In light of this new discovery, the zebrafish kidney is one organ that houses the location of two exciting opportunities for adult stem cell biology studies. It is clear that many outstanding questions could be well served with this experimental system. To encourage expansion of this field, it is beneficial to document detailed methods of visualizing and then isolating the adult zebrafish kidney organ. This protocol details our procedure for dissection of the adult kidney from both unfixed and fixed animals.
Dissection of the kidney organ can be used to isolate and characterize hematopoietic and renal stem cells and their offspring using established techniques such as histology, fluorescence activated cell sorting (FACS)11,12, expression profiling13,14, and transplantation11,15. 
We hope that dissemination of this protocol will provide researchers with the knowledge to implement broader use of zebrafish studies that ultimately can be translated for human application.

The zebrafish kidney is home to both renal and hematopoietic adult stem/progenitor cells, and represents an outstanding opportunity to study these cell types and their progeny in a vertebrate model organism. Here, we demonstrate a detailed dissection procedure that enables the researcher to identify and surgically remove the adult zebrafish kidney, which can be used for applications such as cell isolation, transplantation, and expression studies of kidney and/or blood cell populations.

تشريح الكلى اسماك الزرد الكبار

Researchers working in the burgeoning field of adult stem cell biology seek to understand the signals that regulate the behavior and function of stem ...

Laser Ablation of the Zebrafish Pronephros to Study Renal Epithelial Regeneration

Acute kidney injury (AKI) is characterized by high mortality rates from deterioration of renal function over a period of hours or days that culminates in renal failure1. AKI can be caused by a number of factors including ischemia, drug-based toxicity, or obstructive injury1. This results in an inability to maintain fluid and electrolyte homeostasis. While AKI has been observed for decades, effective clinical therapies have yet to be developed. Intriguingly, some patients with AKI recover renal functions over time, a mysterious phenomenon that has been only rudimentally characterized1,2. Research using mammalian models of AKI has shown that ischemic or nephrotoxin-injured kidneys experience epithelial cell death in nephron tubules1,2, the functional units of the kidney that are made up of a series of specialized regions (segments) of epithelial cell types3. Within nephrons, epithelial cell death is highest in proximal tubule cells. There is evidence that suggests cell destruction is followed by dedifferentiation, proliferation, and migration of surrounding epithelial cells, which can regenerate the nephron entirely1,2. However, there are many unanswered questions about the mechanisms of renal epithelial regeneration, ranging from the signals that modulate these events to reasons for the wide variation of abilities among humans to regenerate injured kidneys.
The larval zebrafish provides an excellent model to study kidney epithelial regeneration as its pronephric kidney is comprised of nephrons that are conserved with higher vertebrates including mammals4,5. The nephrons of zebrafish larvae can be visualized with fluorescence techniques because of the relative transparency of the young zebrafish6. This provides a unique opportunity to image cell and molecular changes in real-time, in contrast to mammalian models where nephrons are inaccessible because the kidneys are structurally complex systems internalized within the animal. Recent studies have employed the aminoglycoside gentamicin as a toxic causative agent for study of AKI and subsequent renal failure: gentamicin and other antibiotics have been shown to cause AKI in humans, and researchers have formulated methods to use this agent to trigger kidney damage in zebrafish7,8. However, the effects of aminoglycoside toxicity in zebrafish larvae are catastrophic and lethal, which presents a difficulty when studying epithelial regeneration and function over time. Our method presents the use of targeted cell ablation as a novel tool for the study of epithelial injury in zebrafish. Laser ablation gives researchers the ability to induce cell death in a limited population of cells. Varying areas of cells can be targeted based on morphological location, function, or even expression of a particular cellular phenotype. Thus, laser ablation will increase the specificity of what researchers can study, and can be a powerful new approach to shed light on the mechanisms of renal epithelial regeneration. This protocol can be broadly applied to target cell populations in other organs in the zebrafish embryo to study injury and regeneration in any number of contexts of interest.

Acute kidney injury (AKI) in humans is a common clinical problem caused by damage to the epithelial cells that comprise kidney nephrons, and AKI is associated with high mortality rates of 50-70%1. Following epithelial cell destruction, nephrons have a limited ability to regenerate, though the mechanisms and limitations that guide this phenomenon remain poorly understood. In this video article, we describe our technique for targeted laser ablation of kidney nephron cells in the zebrafish embryo kidney, or pronephros. Our new method can be used to complement nephrotoxicity-induced models of AKI and gain a high-resolution understanding of the cell and molecular alterations that are associated with epithelial regeneration in the kidney nephron.

تذرية الليزر للاسماك الزرد سليفة الكلوة لدراسة التجديد طلائي الكلوي

Acute kidney injury (AKI) is characterized by high mortality rates from deterioration of renal function over a period of hours or days that culminates in ...

Acute Kidney Injury Model Induced by Cisplatin in Adult Zebrafish

Cisplatin is commonly used as chemotherapy. Although it has positive effects in cancer-treated individuals, cisplatin can easily accumulate in the kidney due to its low molecular weight. Such accumulation causes the death of tubular cells and can induce the development of Acute Kidney Injury (AKI), which is characterized by a quick decrease in kidney function, tissue damage, and immune cells infiltration. If administered in specific doses cisplatin can be a useful tool as an AKI inducer in animal models. The zebrafish has appeared as an interesting model to study renal function, kidney regeneration, and injury, as renal structures conserve functional similarities with mammals. Adult zebrafish injected with cisplatin shows decreased survival, kidney cell death, and increased inflammation markers after 24 h post-injection (hpi). In this model, immune cells infiltration and cell death can be assessed by flow cytometry and TUNEL assay. This protocol describes the procedures to induce AKI in adult zebrafish by intraperitoneal cisplatin injection and subsequently demonstrates how to collect the renal tissue for flow cytometry processing and cell death TUNEL assay. These techniques will be useful to understand the effects of cisplatin as a nephrotoxic agent and will contribute to the expansion of AKI models in adult zebrafish. This model can also be used to study kidney regeneration, in the search for compounds that treat or prevent kidney damage and to study inflammation in AKI. Moreover, the methods used in this protocol will improve the characterization of tissue damage and inflammation, which are therapeutic targets in kidney-associated comorbidities.

This protocol describes the procedures to induce Acute Kidney Injury (AKI) in adult zebrafish using cisplatin as a nephrotoxic agent. We detailed the steps to evaluate the reproducibility of the technique and two techniques to analyze inflammation and cell death in the renal tissue, flow cytometry and TUNEL, respectively.

نموذج إصابة الكلى الحادة الناجمة عن سيسبلاتين في حمار وحشي الكبار

Cisplatin is commonly used as chemotherapy. Although it has positive effects in cancer-treated individuals, cisplatin can easily accumulate in the kidney ...

Medicine

Evaluation of Zebrafish Kidney Function Using a Fluorescent Clearance Assay

The zebrafish embryo offers a tractable model to study organogenesis and model human genetic disease. Despite its relative simplicity, the zebrafish kidney develops and functions in almost the same way as humans. A major difference in the construction of the human kidney is the presence of millions of nephrons compared to the zebrafish that has only two. However, simplifying such a complex system into basic functional units has aided our understanding of how the kidney develops and operates. In zebrafish, the midline located glomerulus is responsible for the initial blood filtration into two pronephric tubules that diverge to run bilaterally down the embryonic axis before fusing to each other at the cloaca. The pronephric tubules are heavily populated by motile cilia that facilitate the movement of filtrate along the segmented tubule, allowing the exchange of various solutes before finally exiting via the cloaca2-4. Many genes responsible for CKD, including those related to ciliogenesis, have been studied in zebrafish5. However, a major draw back has been the difficulty in evaluating zebrafish kidney function after genetic manipulation. Traditional assays to measure kidney dysfunction in humans have proved non translational to zebrafish, mainly due to their aquatic environment and small size. For example, it is not physically possible to extract blood from embryonic staged fish for analysis of urea and creatinine content, as they are too small. In addition, zebrafish do not produce enough urine for testing on a simple proteinuria &#8216;dipstick&#8217;, which is often performed during initial patient examinations. We describe a fluorescent assay that utilizes the optical transparency of the zebrafish to quantitatively monitor the clearance of a fluorescent dye, over time, from the vasculature and out through the kidney, to give a read out of renal function1,6-9.

The zebrafish is a popular tool to model chronic kidney disease (CKD). However, their small size makes it impossible to evaluate renal function using traditional methods. We describe a fluorescent dye kidney clearance assay1 that allows quantitative analysis of zebrafish kidney function in CKD.

تقييم الزرد وظائف الكلى باستخدام التخليص الفحص الفلورسنت

The zebrafish embryo offers a tractable model to study organogenesis and model human genetic disease. Despite its relative simplicity, the zebrafish ...

Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid decline in renal function and development of the clinical syndrome known as acute kidney injury (AKI). Pharmacological agents used to treat medical circumstances ranging from bacterial infection to cancer, when administered individually or in combination with other drugs, can initiate AKI. Zebrafish are a useful animal model to study the chemical effects on renal function in vivo, as they form an embryonic kidney comprised of nephron functional units that are conserved with higher vertebrates, including humans. Further, zebrafish can be utilized to perform genetic and chemical screens, which provide opportunities to elucidate the cellular and molecular facets of AKI and develop therapeutic strategies such as the identification of nephroprotective molecules. Here, we demonstrate how microinjection into the zebrafish embryo can be utilized as a paradigm for nephrotoxin studies.

Renal injuries incurred from nephrotoxins, which include drugs ranging from antibiotics to chemotherapeutics, can result in complex disorders whose pathogenesis remains incompletely understood. This protocol demonstrates how zebrafish can be used for disease modeling of these conditions, which can be applied to the identification of renoprotective measures.

سم كلوي حقن مكروي في الزرد لنموذج قصور كلوي حاد

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid ...

Depigmentation and Prestaining of Zebrafish Kidney: A Technique to Prepare Adult Zebrafish Kidney for Staining

Source: McCampbell, K. K. et al. <a href="https://www.jove.com/video/51644" target="_blank">Analysis of Nephron Composition and Function in the Adult Zebrafish Kidney.</a> J. Vis. Exp. (2014)
In this video, we demonstrate the depigmentation of adult zebrafish kidney and its subsequent preparation for staining procedures. Post-staining, the adult zebrafish kidney can be used for studying kidney regeneration, phenotypic characterization of renal disease models, and nephron functionality.

تحليل التركيب كليون وظيفة في الكلى اسماك الزرد الكبار

Summary

Explore More Videos

PLAYLIST