We would like to acknowledge and thank Tom Goddard at University of California San Francisco for his endless help with Chimera, Joel Mancuso and Chris Booth at Gatan, Inc. for their help with SBF-SEM data collection of bacteria dataset, Doug Wei at Zeiss, Inc. for his help with the FIB-SEM data collection of epithelial cell dataset, Kent McDonald at University of California Berkeley Electron Microscopy Lab for advice on sample preparation, TEM imaging and tomography, Roseann Csencsits at Lawrence Berkeley National Laboratory for her help taking the cryo-TEM image, Elena Bosneaga for cryo-sectioning of the plant dataset, Jocelyn Krey at Oregon Health and Science University for the dissection of utricle tissue, David Skinner at National Energy Research Scientific Computing Center (NERSC) and Jitendra Malik at University of California Berkeley for their advice in software infrastructure, and Pablo Arbelaez at&#160;University of California Berkeley&#160;for his codes contributions to the custom-tailored script presented in this article. 
Research was supported by the U.S. Department of Energy, Office of Science under contract No. DE-AC02-05CH11231 [David Skinner], as well as U.S. National Institutes of Health (NIH) grant No. P01 GM051487 [M.A.] for the inner ear hair cell project and microscopy instrumentation use.

<ol>
	<li>Auer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+electron+cryo-microscopy+as+a+powerful+structural+tool+in+molecular+medicine.">Three-dimensional electron cryo-microscopy as a powerful structural tool in molecular medicine.</a> J Mol Med (Berl). 78 (4), 191-202 (2000).</li><li>Johnson, M. C., Rudolph, F., Dreaden, T. M., Zhao, G., Barry, B. A., Schmidt-Krey, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+two-dimensional+crystallization+trials+of+small+membrane+proteins+for+structural+biology+studies+by+electron+crystallography.">Assessing two-dimensional crystallization trials of small membrane proteins for structural biology studies by electron crystallography.</a> Journal of visualized experiments JoVE. (44), e1846 (2010).</li><li>Jun, S., Zhao, G., Ning, J., Gibson, G. A., Watkins, S. C., Zhang, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlative+microscopy+for+3D+structural+analysis+of+dynamic+interactions.">Correlative microscopy for 3D structural analysis of dynamic interactions.</a> Journal of visualized experiments JoVE. (76), e50386 (2013).</li><li>Meng, X., Zhao, G., Zhang, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+HIV-1+capsid+assemblies+by+cryo-electron+microscopy+and+iterative+helical+real-space+reconstruction.">Structure of HIV-1 capsid assemblies by cryo-electron microscopy and iterative helical real-space reconstruction.</a> Journal of visualized experiments JoVE. (54), e3041 (2011).</li><li>Chen, S., McDowall, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+Cryotomography+of+Bacterial+Cells.">Electron Cryotomography of Bacterial Cells.</a> Journal of visualized experiments JoVE. (39), e1943 (2010).</li><li>Meyerson, J. R., White, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+molecular+structures+of+HIV+envelope+glycoproteins+using+cryo-electron+tomography+and+automated+sub-tomogram+averaging.">Determination of molecular structures of HIV envelope glycoproteins using cryo-electron tomography and automated sub-tomogram averaging.</a> Journal of visualized experiments JoVE. (58), e2770 (2011).</li><li>Lucic, V., Forster, F., Baumeister, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+studies+by+electron+tomography:+from+cells+to+molecules.">Structural studies by electron tomography: from cells to molecules.</a> Annu Rev Biochem. 74, 833-865 (2005).</li><li>Bajaj, C., Yu, Z., Auer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Volumetric+feature+extraction+and+visualization+of+tomographic+molecular+imaging.">Volumetric feature extraction and visualization of tomographic molecular imaging.</a> J Struct Biol. 144 (1-2), 132-143 (2003).</li><li>Lin, G., Adiga, U., Olson, K., Guzowski, J. F., Barnes, C. A., Roysam, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+hybrid+3D+watershed+algorithm+incorporating+gradient+cues+and+object+models+for+automatic+segmentation+of+nuclei+in+confocal+image+stacks.">A hybrid 3D watershed algorithm incorporating gradient cues and object models for automatic segmentation of nuclei in confocal image stacks.</a> Cytometry A. 56 (1), 23-36 (2003).</li><li>Volkmann, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+three-dimensional+variant+of+the+watershed+transform+for+segmentation+of+electron+density+maps.">A novel three-dimensional variant of the watershed transform for segmentation of electron density maps.</a> Journal of Structural Biology. 138 (1), 123-129 (2002).</li><li>Rigort, A., G&#252;nther, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+segmentation+of+electron+tomograms+for+a+quantitative+description+of+actin+filament+networks.">Automated segmentation of electron tomograms for a quantitative description of actin filament networks.</a> Journal of structural biology. 177 (1), 135-144 (2012).</li><li>Cremers, D., Rousson, M., Deriche, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Review+of+Statistical+Approaches+to+Level+Set+Segmentation.">A Review of Statistical Approaches to Level Set Segmentation.</a> Integrating Color, Texture, Motion and Shape. International Journal of Computer Vision. 72 (2), 195-215 (2007).</li><li>Lin, Z., Davis, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shape-based+human+detection+and+segmentation+via+hierarchical+part-template+matching.">Shape-based human detection and segmentation via hierarchical part-template matching.</a> IEEE Trans Pattern Anal Mach Intell. 32 (4), 604-618 (2010).</li><li>Pettersen, E. F., Goddard, T. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=UCSF+Chimera--a+visualization+system+for+exploratory+research+and+analysis.">UCSF Chimera--a visualization system for exploratory research and analysis.</a> J Comput Chem. 25 (13), 1605-1612 (2004).</li><li>Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computer+visualization+of+three-dimensional+image+data+using+IMOD.">Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD.</a> J Struct Biol. 116 (1), 71-76 (1996).</li><li>Zhang, Q., Bettadapura, R., Bajaj, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macromolecular+structure+modeling+from+3D+EM+using+VolRover+2.0.">Macromolecular structure modeling from 3D EM using VolRover 2.0.</a> Biopolymers. 97 (9), 709-731 (2012).</li><li>Giannuzzi, L. A., Stevie, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+focused+ion+beam+milling+techniques+for+TEM+specimen+preparation.">A review of focused ion beam milling techniques for TEM specimen preparation.</a> Micron. 30 (3), 197-204 (1999).</li><li>Heymann, J. A. W., Hayles, M., Gestmann, I., Giannuzzi, L. A., Lich, B., Subramaniam, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specific+3D+imaging+of+cells+and+tissues+with+a+dual+beam+microscope.">Site-specific 3D imaging of cells and tissues with a dual beam microscope.</a> Journal of structural biology. 155 (1), 63-73 (2006).</li><li>Knott, G., Rosset, S., Cantoni, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Focussed+ion+beam+milling+and+scanning+electron+microscopy+of+brain+tissue.">Focussed ion beam milling and scanning electron microscopy of brain tissue.</a> Journal of visualized experiments JoVE. (53), e2588 (2011).</li><li>Wirth, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Focused+Ion+Beam+(FIB)+combined+with+SEM+and+TEM:+Advanced+analytical+tools+for+studies+of+chemical+composition,+microstructure+and+crystal+structure+in+geomaterials+on+a+nanometre+scale.">Focused Ion Beam (FIB) combined with SEM and TEM: Advanced analytical tools for studies of chemical composition, microstructure and crystal structure in geomaterials on a nanometre scale.</a> Chemical Geology. 261 (3-4), 217-229 (2009).</li><li>Denk, W., Horstmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+block-face+scanning+electron+microscopy+to+reconstruct+three-dimensional+tissue+nanostructure.">Serial block-face scanning electron microscopy to reconstruct three-dimensional tissue nanostructure.</a> PLoS Biol. 2 (11), e329 (2004).</li><li>Frangakis, A. S., Hegerl, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noise+reduction+in+electron+tomographic+reconstructions+using+nonlinear+anisotropic+diffusion.">Noise reduction in electron tomographic reconstructions using nonlinear anisotropic diffusion.</a> Journal of structural biology. 135 (3), 239-250 (2001).</li><li>Jiang, W., Baker, M. L., Wu, Q., Bajaj, C., Chiu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+a+bilateral+denoising+filter+in+biological+electron+microscopy.">Applications of a bilateral denoising filter in biological electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 144 (1), 114-122 (2003).</li><li>Van der Heide, P., Xu, X. P., Marsh, B. J., Hanein, D., Volkmann, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+automatic+noise+reduction+of+electron+tomographic+reconstructions+based+on+iterative+median+filtering.">Efficient automatic noise reduction of electron tomographic reconstructions based on iterative median filtering.</a> Journal of structural biology. 158 (2), 196-204 (2007).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li><li>Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>MathWorks. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> MATLAB. , (2012).</li><li>Otsu, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Threshold+Selection+Method+from+Gray-Level+Histograms.">A Threshold Selection Method from Gray-Level Histograms.</a> Systems, Man and Cybernetics, IEEE Transactions on. 9, 62-66 (1979).</li><li>Vedaldi, A., Fulkerson, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> VLFeat: An Open and Portable Library of Computer Vision Algorithms. , (2008).</li><li>Zhu, S. C., Guo, C., Wang, Y., Xu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+are+Textons?.">What are Textons?.</a> International Journal of Computer Vision. 62 (1-2), 121-143 (2005).</li><li>Gagnon, L. H., Longo-Guess, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chloride+intracellular+channel+protein+CLIC5+is+expressed+at+high+levels+in+hair+cell+stereocilia+and+is+essential+for+normal+inner+ear+function.">The chloride intracellular channel protein CLIC5 is expressed at high levels in hair cell stereocilia and is essential for normal inner ear function.</a> The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 26 (40), 10188-10198 (2006).</li><li>Briand, P., Petersen, O. W., Van Deurs, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+diploid+nontumorigenic+human+breast+epithelial+cell+line+isolated+and+propagated+in+chemically+defined+medium.">A new diploid nontumorigenic human breast epithelial cell line isolated and propagated in chemically defined medium.</a> In vitro cellular &amp; developmental biology journal of the Tissue Culture Association. 23 (3), 181-188 (1987).</li><li>Petersen, O. W., R&#248;nnov-Jessen, L., Howlett, A. R., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+with+basement+membrane+serves+to+rapidly+distinguish+growth+and+differentiation+pattern+of+normal+and+malignant+human+breast+epithelial+cells.">Interaction with basement membrane serves to rapidly distinguish growth and differentiation pattern of normal and malignant human breast epithelial cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89 (19), 9064-9068 (1992).</li><li>Shin, J. B., Krey, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+architecture+of+the+chick+vestibular+hair+bundle.">Molecular architecture of the chick vestibular hair bundle.</a> Nature neuroscience. 16 (3), 365-374 (2013).</li><li>Yang, W., Zeng, Z., Max, N., Auer, M., Crivelli, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simplified+Surface+Models+of+Tubular+Bacteria+and+Cytoskeleta.">Simplified Surface Models of Tubular Bacteria and Cytoskeleta.</a> Journal of Information &amp; Computational Science. 9 (6), 1589-1598 (2012).</li></ol>

The authors declare they have no competing financial interests.

تقليديا، والمجهر الإلكتروني تم تقسيم (EM) في حقل 1) فرع علم الأحياء الهيكلي باستخدام عالية وفائقة عالية الدقة TEM، جنبا إلى جنب مع البيانات عادة صريحة أو ضمنية في المتوسط ​​للتحقيق في ثلاثي الأبعاد (3D) هيكل المجمعات الجزيئات مع تركيبة محددة وعادة ما يكون صغير الحجم نسبيا 1-4، و 2) فرع في التصوير الخلوي التي تصور المناظر الخلوية كامل 1،5،6. في حين أن فرع البيولوجيا البنيوية شهدت تطورا مذهلة على مدى العقود الأربعة الماضية، كان فرع بيولوجيا الخلايا يقتصر في معظمه على بعدين، في كثير من الأحيان على عينات أقل من أمثل الحفاظ عليها. فقط مع ظهور التصوير المقطعي الإلكترون في العقد الأخير لديه خلية التصوير التركيبية البيولوجي سعت إلى البعد الثالث 5،7، حيث بلغ متوسطها عادة لا يمكن إجراء مثل المناظر الخلوية، وبالتالي ملامح الفائدة، هي فريدة من نوعها عادة. على الرغم من مشاهد تصور الخلوية وغالبا ما تكون مذهلة للعين، واستخراج كفاءة من السمات من الاهتمام والتحليل الكمي لاحق من هذه الكميات الخلوية معقدة للغاية تتخلف، وذلك جزئيا بسبب تكوين البروتين الدقيق هو عادة غير معروف، مما يجعل صعوبة في تفسير هذه الخلوية أحجام 3D. إلى هذا التاريخ، كثيرا ما يحتاج الأمر الخبرات البيولوجية واسعة من أجل تفسير tomograms المعقدة، أو حتى لتحديد المناطق الهامة والعناصر الأساسية في حجم 3D. نتيجة مضاعفات أخرى، تصور حجم 3D هو ملحوظ غير تافهة. يمكن اعتبار كميات من 3D وبالتالي تصور وأكوام من الصور 2D. تفتيش من قبل شريحة شريحة من الصور 2D متتابعة يقلل من تعقيد، ولكنه أيضا ميزة حدود استخراج وتحليل كمي وبالتالي إلى البعدين. ومع ذلك، بالنسبة لمعظم الأجسام 3D، تصوير مجلدات 3D على أنه مجرد كومة من الطائرات متتالية يؤدي إلى غير مكتملة ومنظور مشوه د في نظام معين طبيعة 3D. تتطلب طرق بديلة من الفحص البصري إما جعل حجم أو تقديم السطح، والتي تعطى-طبيعة كثير من الأحيان كثيفة من حجم الخلوي يمكن أن يؤدي بسهولة إلى وجهة نظر عرقلة من الأشياء المتداخلة أو تطغى مستخدم تماما، مما يجعل من الصعب التفاعلية تجزئة اليدوية. لمعالجة هذه الحواجز، ومجموعة متنوعة كبيرة من ميزة استخراج الآلي وقد تم تطوير (تجزئة) النهج التي عادة ما تكون إما density- أو 8-10 القائم على التدرج. ومع ذلك، هذه الأساليب تميل إلى شريحة وحدة التخزين بالكامل بغض النظر عن أي مناطق أو الميزات التي تهم الخبراء، على الرغم من أن بعض الطرق الحديثة يمكن أن تستهدف ميزة معينة من الاهتمام مثل خيوط الأكتين 11. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن للبرامج المنفذة تجزئة الآلي يؤدي أحيانا في إنتاج عدد كبير من وحدات التخزين الفرعية (على سبيل المثال، عند تطبيق immersio مستجمعات المياهن تجزئة) التي تحتاج في كثير من الأحيان المراد دمجها يدويا مرة أخرى تضم ميزة كاملة من الفائدة أو أن تخضع لمزيد من التجزئة. هذا ينطبق بشكل خاص للمجموعات البيانات المعقدة والمزدحمة، مما جعل معظم خوارزميات الكمبيوتر غير قادرة على استخراج فقط ملامح المصالح مع الإخلاص، وجهود كرأيشن كبيرة من قبل خبير في كثير من الأحيان اللازمة لإنتاج حجم مجزأة المطلوب. وعلاوة على ذلك، غالبا ما يتم نشر حلول مخصصة لمشكلة محددة للغاية كورقة اجتماع العلمية، مع قليل من دون التركيز على جعلها واسعة وشاملة الأدوات في متناول الباحثين الذين ليس لديهم معرفة وثيقة من مجالات الرياضيات وعلوم الكمبيوتر و / أو رسومات الحاسوب. وتخصيص بيئة البرمجيات والبرمجة، وتحتوي على مجموعة من المكتبات تحليل الصور، يمكن أن يكون مجموعة أداة قوية تتيح للمستخدمين إرسال وحدات خاصة بهم بكفاءة لتجزئة دقيقة. ومع ذلك، فإن هذا النهج يتطلب تحويلةالتدريب ensive وخلفية في علوم الكمبيوتر من أجل الاستفادة من العديد من معالمه أو قدرات لتحليل الصور. يمكن للمرء أن يعمل ضمن هذه البيئة البرمجيات تنوعا لمجموعات بيانات معينة حيث الميزات هي أكثر متفرق، على سبيل المثال، من خلال استخدام النهج القائم على الشكل القوية التي تعتمد على الهندسة الفريدة &quot;قوالب&quot; لفصل الأشياء من الاهتمام من محيطهم 12،13 . مجموعة متنوعة العادلة للحزم التصور رسومات الحاسوب التفاعلية موجودة لتجزئة اليدوية وبناء نموذج. بعض الحزم المتوفرة تجاريا، والبعض الآخر من أصل الأكاديمي وتوزيعه مجانا، مثل: جامعة كاليفورنيا في سان فرانسيسكو الوهم 14، جامعة كولورادو IMOD 15، وجامعة تكساس أوستن VolumeRover 16. ومع ذلك، فإن مجموعة واسعة وتعقيد ميزات وقدرات هذه البرامج تمتلك تفاقم حالة منحنى التعلم لعصامالفصل. توفر برامج التصور بعض نماذج هندسية بسيطة مثل الكرات والعصي من مختلف الأحجام، والتي يمكن وضعها في خرائط الكثافة من أجل خلق نموذج مبسط لحجم 3D المعقدة. هذه النماذج ثم تسمح قياسات هندسية والحجمي بسيطة وبالتالي تتجاوز مجرد &quot;صورة جميلة&quot;. مثل هذا التعقب اليدوي للكائنات يعمل بشكل جيد للأحجام التي يحتاج فيها سوى عدد قليل من الكائنات التي سيتم تتبعها واستخراجها. ومع ذلك، فإن التطورات الأخيرة من الحجم الكبير التركيبية التصوير 3D باستخدام شعاع مركز أيون المجهر الإلكتروني (الاكذوبه-SEM) 17-20 أو كتلة التسلسلي المجهر الإلكتروني الماسح وجه (SBF-SEM) 21 يعرض مضاعفات إضافية أن حجم البيانات 3D يمكن للمجموعات تتراوح بين غيغابايت إلى عشرات ومئات غيغابايت، وحتى تيرابايت. لذلك، مثل هذه الكميات 3D كبيرة لا يمكن الوصول إليها عمليا ميزة استخراج اليدوي، وبالتالي كفاءة الفذ شبه الآلي الموجهة المستخدمسوف استخراج لدى عودتهم يكون واحدا من الاختناقات للتحليل الفعال للمجلدات 3D في المستقبل المنظور. قدمت هنا هي أربعة نهج تجزئة المختلفة التي تستخدم بشكل روتيني على طائفة واسعة من أنواع الصور البيولوجية. هذه الأساليب ثم يتم مقارنة لفعاليتها لأنواع مختلفة من مجموعات البيانات، والسماح لتجميعها في دليل لمساعدة علماء الأحياء تقرر ما يمكن أن يكون أفضل نهج تجزئة للميزة استخراج الفعال للبيانات الخاصة بهم. كما هي أدلة المستخدم بالتفصيل المتاحة لمعظم البرامج المذكورة، والهدف من ذلك هو عدم جعل المستخدمين المحتملين مألوفة مع أي من هذه الحزم معينة. بدلا من ذلك، فإن الهدف هو إظهار القوة والضعف لكل من هذه الاستراتيجيات تجزئة مختلفة من قبل تطبيقها على مجموعات البيانات ستة سبيل المثال ذات الخصائص المتنوعة. من خلال هذه المقارنة، تم وضع مجموعة من المعايير التي تستند إما على خصائص الصورة الموضوعية للمجموعات البيانات 3D، مثل تباين البيانات، هشاشة، الاكتظاظ، والتعقيد، أو تنبع من اعتبارات ذاتية، مثل الهدف المنشود للتجزئة، والأشكال التضاريسية من الميزات لتكون مجزأة، والكثافة السكانية من سمات الفائدة، وهذا يعني جزء من حجم المحتلة بواسطة ميزة المصالح، وكيف يمكن للمرء العائدات على النحو الأمثل مع الموارد المحدودة مثل الوقت وتوفر للموظفين. هذه مجموعات البيانات المختلفة المثال توضح كيف يمكن لهذه المعايير الموضوعية والذاتية بالتتابع تطبيقها في مجموعة متنوعة من التشكيلات لتسفر عن الاقتران بعض النهج مع ميزة استخراج أنواع معينة من مجموعات البيانات. التوصيات المقدمة سيساعد نأمل المبتدئين واجهت مع مجموعة كبيرة ومتنوعة من الخيارات تجزئة اختيار النهج الأكثر فعالية لتجزئة حجم 3D الخاصة. في حين أن التركيز في هذه الورقة هو ميزة استخراج، والانتباه إلى جمع البيانات وقبل تجهيز البيانات أمر بالغ الأهمية لكفاءة قegmentation. في كثير من الأحيان تلطيخ عينات يمكن أن يكون متساويا، وبالتالي، ينبغي النظر التحف تلطيخ المحتملة في إجراءات تجزئة. ومع ذلك، وصمة عار عادة يعطي أعلى إشارة إلى الضجيج، وبالتالي تتطلب أقل الترشيح وغيره من ضروب المعاملة الرياضية كميات الخلوية، والتي يحتمل أن يؤدي أيضا إلى التحف. مجموعات بيانات الصورة الخام منها تحتاج إلى الحصول عليها في إعدادات التباين وبيكسل الصحيحة، الانحياز، وأعيد بناؤها في حجم 3D. لtomograms، يتم بناؤها الصور الانحياز عادة ما تستخدم المرجحة الخلفية الإسقاط، ثم عادة ما تعرض مجموعة البيانات إلى خوارزميات مثل تقليل الضوضاء غير الخطية متباين الخواص نشر 22، 23 تصفية الثنائية، أو متوسط ​​عودي تصفية 24. يتم محاذاة البيانات التصوير الاكذوبه-SEM وSBF-SEM بواسطة شرائح عبر ربط متتالية في برامج الاستفادة XY مثل يماغيج 25. تعزيز التباين وتصفية يمكن تطبيقها على تعزيز ملامحالفائدة وبالتالي لاجتثاث الضوضاء صورة المكدس. تصفية يمكن أن يؤديها إما على وحدة التخزين بالكامل قبل subvolume اختيار أو على subvolumes المختارة، مع اقتراب تصفية يمكن أن تكون مكلفة حسابيا. أسفل عينة من البيانات (binning)، والذي يستخدم في بعض الأحيان للحد من الضوضاء و / أو تخفيض حجم الملف، ويوصى فقط إذا كانت البيانات قد تم oversampled بشكل ملحوظ مقارنة مع القرار المتوقع. بعد الحد من الضوضاء، والصور يمكن بعد ذلك معالجتها مجزأة بطرق مختلفة، والتركيز في هذه الدراسة على الأربعة التالية: (1) نموذج الجيل اليدوي المستخرجة من خلال خلق نموذج الكرة والعصا، (2) تتبع اليدوي من الميزات المصالح، (3) الكثافة الآلي القائم على عتبة، و (4) بمواصفات محددة تجزئة الآلي عبر برنامج نصي للتجزئة محددة المشروع. تجزئة حدود 8 و 10 تجزئة غامرة مستجمعات المياه هي بدائل أفضل لالعتبة بسيطة، ولكن ريا تنتمي في نفس الفئة والتي لم تدرج صراحة في هذه المناقشة. تتبع اليدوي للكثافة يتطلب تحدد ملامح الفائدة، شريحة تلو شريحة، والذي يسمح الإبقاء على الكثافة الأصلية للمناطق الفرعية الخلوية منها. هذا النهج يتيح السيطرة القصوى من عملية تجزئة، بل هي عملية شاقة وكثيفة العمالة. النهج كثافة تجزئة الآلي (وذات الصلة) القائم على عتبة هي نصف آلية، حيث تختار خوارزمية بكسل استنادا إلى مجموعة من المعلمات المعرفة من قبل المستخدم. هي عدة الأكاديمية (مجاني) حزم التصور، مثل UCSF الوهم، IMOD، فيجي 26، وVolumeRover المتاحة، وكذلك التجارية (التي تتطلب تراخيص المدفوعة) حزم، وعادة ما تشمل كلا النوعين واحد أو أكثر من هذه الطرق تجزئة. وتشمل حزم البرمجيات المستخدمة في هذا العمل لتوضيح هذه الأساليب المختلفة كلا البرنامجين التجارية وق الأكاديمية المفتوحةource برامج لتوليد نموذج مجردة، وكذلك اليدوي والآلي كثافة تجزئة يدويا. ومع ذلك، يمكن للبرمجيات المصدر المفتوح في بعض الأحيان تقديم خيارات أكثر تقدما من خلال إمكانية التخصيص. وأدت المقارنة بين هذه التقنيات باستخدام أنواع مختلفة من مجموعات البيانات إلى العرض التالية من القواعد والتوجيهات بشأن كيفية التعامل مع تجزئة كميات متنوعة 3D البيانات البيولوجية، والتي على حد علمنا لم يتم نشرها. وهكذا، وهذا هو المقارنة المنهجية الأولى من المناهج المختلفة وفائدتها على مجموعات البيانات ذات خصائص مختلفة بالنسبة للمستخدمين مع أهداف مختلفة.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="647">
	<tbody>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:99px;">Material Name</td>
			<td style="width:151px;">Company</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td style="width:248px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:99px;">Amira</td>
			<td style="width:151px;">FEI Visualization Sciences Group</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td>http://www.vsg3d.com/amira/overview</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:99px;">Chimera</td>
			<td style="width:151px;">UCSF</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td style="width:248px;"><a href="http://www.cgl.ucsf.edu/chimera/">http://www.cgl.ucsf.edu/chimera/</a></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:99px;"><a name="RANGE!A4">Fiji/ImageJ</a></td>
			<td style="width:151px;">National Institute of Health</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td style="width:248px;">http://fiji.sc/Fiji, http://rsbweb.nih.gov/ij/</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:99px;">IMOD</td>
			<td style="width:151px;">Boulder Laboratory for 3D Electron Microscopy of Cells</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td style="width:248px;">http://bio3d.colorado.edu/imod/</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:99px;">Photoshop</td>
			<td style="width:151px;">Adobe</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td style="width:248px;"><a href="http://www.adobe.com/products/%20photoshopfamily.html">http://www.adobe.com/products/ photoshopfamily.html</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:99px;">MATLAB</td>
			<td style="width:151px;">MathWorks</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td style="width:248px;"><a href="http://www.mathworks.com/">http://www.mathworks.com/</a></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">VLFeat</td>
			<td>VLFeat</td>
			<td></td>
			<td>http://www.vlfeat.org/</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

from voxels to knowledge: a practical guide to the segmentation of complex electron microscopy 3d-data

وقد سمحت النهج الحديثة المجهر الإلكتروني 3D مؤخرا فكرة غير مسبوقة في المنظمة 3D التركيبية للخلايا والأنسجة، مما يمكن التصور من آلات الجزيئات الكبيرة مثل المجمعات الالتصاق، فضلا عن الهياكل العليا، مثل الهيكل الخلوي والعضيات الخلوية في حياتهم خلية منها والسياق الأنسجة. بالنظر إلى التعقيد الكامن من وحدات التخزين الخلوية، فمن الضروري لاستخراج أول ملامح الفائدة من أجل السماح التصور، الكمي، وبالتالي فهم تنظيم 3D بهم. يتم تعريف كل مجموعة من البيانات الخصائص المميزة، على سبيل المثال، نسبة، هشاشة (الحدة) إشارة إلى الضجيج للبيانات، عدم تجانس معالمه، زحام ميزات، وجود أو عدم وجود الأشكال المميزة التي تسمح لسهولة تحديد الهوية، ونسبة من حجم كامل أن منطقة محددة من الفائدة تحتل. لا بد من النظر في جميع هذه الخصائصعند اتخاذ قرار بشأن التي تقترب لاتخاذ لتجزئة. مجموعات 3D مختلفة ستة البيانات التركيبية عرض تم الحصول عليها من قبل ثلاثة التصوير نهج مختلف: الراتنج جزءا لا يتجزأ من التصوير المقطعي الإلكترون الملون، ركز ايون beam- وكتلة تسلسلي المسح face- المجهر الإلكتروني (SEM-الاكذوبه، SBF-SEM) من عينات الملون والمعشق أقل ما يقال بشدة ، على التوالي. لهذه مجموعات البيانات، تم تطبيق أربعة نهج تجزئة مختلفة: (1) جاء اليدوي بالكامل بناء نموذج فقط من التصور للنموذج، (2) تتبع تجزئة اليدوي للبيانات تليها تقديم السطح، (3) نهج شبه الآلي جاءت قبل تقديم السطح، أو (4) الآلي خوارزميات تجزئة مصمم خصيصا تليها تقديم السطحية والتحليل الكمي. اعتمادا على مزيج من خصائص مجموعة البيانات، تبين أن عادة واحد من هذه الطرق الأربعة الفئوية يتفوق على الآخرين، ولكن اعتمادا على التسلسل الدقيق للمعايير، موقد يكون نهج إعادة من واحد ناجح. بناء على هذه المعطيات، فإننا نقترح مخطط الفرز أن يصنف كلا موضوعية خصائص مجموعة البيانات الشخصية ومعايير موضوعية لتحليل مجموعات البيانات المختلفة.

Watch this Scientific Journal Video about From Voxels to Knowledge: A Practical Guide to the Segmentation of Complex Electron Microscopy 3D-Data at JoVE.com

From Voxels to Knowledge: A Practical Guide to the Segmentation of Complex Electron Microscopy 3D-Data

عنق الزجاجة للالخلوي المجهر الإلكتروني 3D هو ميزة استخراج (تجزئة) في غاية التعقيد خرائط كثافة 3D. قمنا بتطوير مجموعة من المعايير، التي توفر توجيهات بشأن النهج الذي تجزئة (دليل، وشبه الآلي، أو الآلي) هو الانسب لأنواع مختلفة من البيانات، وبالتالي توفير نقطة انطلاق لتجزئة فعالة.

من Voxels إلى المعرفة: دليل عملي للتجزئة مجمع المجهر الإلكتروني 3D-البيانات

Modern 3D electron microscopy approaches have recently allowed unprecedented insight into the 3D ultrastructural organization of cells and tissues, ...

from-voxels-to-knowledge-practical-guide-to-segmentation-complex

Research

JoVE Journal

Bioengineering

24.3K Views.  Lawrence Berkeley National Laboratory.  عنق الزجاجة للالخلوي المجهر الإلكتروني 3D هو ميزة استخراج (تجزئة) في غاية التعقيد خرائط كثافة 3D. قمنا بتطوير مجموعة من المعايير، التي توفر توجيهات بشأن النهج الذي تجزئة (دليل، وشبه الآلي، أو الآلي) هو الانسب لأنواع مختلفة من البيانات، وبالت?...

Video: From Voxels to Knowledge: A Practical Guide to the Segmentation of Complex Electron Microscopy 3D-Data

Low-Cost Cryo-Light Microscopy Stage Fabrication for Correlated Light/Electron Microscopy

The coupling of cryo-light microscopy (cryo-LM) and cryo-electron microscopy (cryo-EM) poses a number of advantages for understanding cellular 
dynamics and ultrastructure. First, cells can be imaged in a near native environment for both techniques. Second, due to the vitrification process, samples are
 preserved by rapid physical immobilization rather than slow chemical fixation. Third, imaging the same sample with both cryo-LM and cryo-EM provides correlation of
 data from a single cell, rather than a comparison of "representative samples". While these benefits are well known from prior studies, the widespread use of correlative 
 cryo-LM and cryo-EM remains limited due to the expense and complexity of buying or building a suitable cryogenic light microscopy stage. Here we demonstrate the 
 assembly, and use of an inexpensive cryogenic stage that can be fabricated in any lab for less than $40 with parts found at local hardware and grocery stores. This 
 cryo-LM stage is designed for use with reflected light microscopes that are fitted with long working distance air objectives. For correlative cryo-LM and cryo-EM 
 studies, we adapt the use of carbon coated standard 3-mm cryo-EM grids as specimen supports. After adsorbing the sample to the grid, previously established protocols 
 for vitrifying the sample and transferring/handling the grid are followed to permit multi-technique imaging. As a result, this setup allows any laboratory with a 
 reflected light microscope to have access to direct correlative imaging of frozen hydrated samples.

We demonstrate the fabrication of a low-cost cryogenic stage designed to fit most reflected light microscopes. This lab-built cryogenic stage enables efficient and reliable correlative imaging between cryo-light and cryo-electron microscopy.

منخفضة التكلفة المرحلة الميكروسكوب البرد الخفيفة التصنيع الخفيف مربوط / مجهرية إلكترون

The coupling of cryo-light microscopy (cryo-LM) and cryo-electron microscopy (cryo-EM) poses a number of advantages for understanding cellular 
dynamics ...

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic valve leaflets are composed of interstitial cells suspended within an extracellular matrix (ECM) and are lined with an endothelial cell monolayer. The valve withstands a harsh, dynamic environment and is constantly exposed to shear, flexion, tension, and compression. Research has shown calcific lesions in diseased valves occur in areas of high mechanical stress as a result of endothelial disruption or interstitial matrix damage1-3. Hence, it is not surprising that epidemiological studies have shown high blood pressure to be a leading risk factor in the onset of aortic valve disease4. 
The only treatment option currently available for valve disease is surgical replacement of the diseased valve with a bioprosthetic or mechanical valve5. Improved understanding of valve biology in response to physical stresses would help elucidate the mechanisms of valve pathogenesis. In turn, this could help in the development of non-invasive therapies such as pharmaceutical intervention or prevention. Several bioreactors have been previously developed to study the mechanobiology of native or engineered heart valves6-9. Pulsatile bioreactors have also been developed to study a range of tissues including cartilage10, bone11 and bladder12. The aim of this work was to develop a cyclic pressure system that could be used to elucidate the biological response of aortic valve leaflets to increased pressure loads. 
The system consisted of an acrylic chamber in which to place samples and produce cyclic pressure, viton diaphragm solenoid valves to control the timing of the pressure cycle, and a computer to control electrical devices. The pressure was monitored using a pressure transducer, and the signal was conditioned using a load cell conditioner. A LabVIEW program regulated the pressure using an analog device to pump compressed air into the system at the appropriate rate. The system mimicked the dynamic transvalvular pressure levels associated with the aortic valve; a saw tooth wave produced a gradual increase in pressure, typical of the transvalvular pressure gradient that is present across the valve during diastole, followed by a sharp pressure drop depicting valve opening in systole. The LabVIEW program allowed users to control the magnitude and frequency of cyclic pressure. The system was able to subject tissue samples to physiological and pathological pressure conditions. This device can be used to increase our understanding of how heart valves respond to changes in the local mechanical environment.

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

A cyclic pressure bioreactor capable of subjecting heart valve tissue to physiological and pathological pressure conditions has been designed. A LabVIEW program allows users to control pressure magnitude, amplitude and frequency. This device can be used to study the mechanobiology of heart valve tissue or isolated cells.

تصميم مفاعل حيوي لضغط الدوري السابقين فيفو دراسة صمامات القلب الأورطي

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic ...

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

Optical imaging offers a wide range of diagnostic modalities and has attracted a lot of interest as a tool for biomedical imaging. Despite the enormous number of imaging techniques currently available and the progress in instrumentation, there is still a need for highly sensitive probes that are suitable for in vivo imaging. One typical problem of available preclinical fluorescent probes is their rapid clearance in vivo, which reduces their imaging sensitivity. To circumvent rapid clearance, increase number of dye molecules at the target site, and thereby reduce background autofluorescence, encapsulation of the near-infrared fluorescent dye, DY-676-COOH in liposomes and verification of its potential for in vivo imaging of inflammation was done. DY-676 is known for its ability to self-quench at high concentrations. We first determined the concentration suitable for self-quenching, and then encapsulated this quenching concentration into the aqueous interior of PEGylated liposomes. To substantiate the quenching and activation potential of the liposomes we use a harsh freezing method which leads to damage of liposomal membranes without affecting the encapsulated dye. The liposomes characterized by a high level of fluorescence quenching were termed Lip-Q. We show by experiments with different cell lines that uptake of Lip-Q is predominantly by phagocytosis which in turn enabled the characterization of its potential as a tool for in vivo imaging of inflammation in mice models. Furthermore, we use a zymosan-induced edema model in mice to substantiate the potential of Lip-Q in optical imaging of inflammation in vivo. Considering possible uptake due to inflammation-induced enhanced permeability and retention (EPR) effect, an always-on liposome formulation with low, non-quenched concentration of DY-676-COOH (termed Lip-dQ) and the free DY-676-COOH were compared with Lip-Q in animal trials.

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

The use of fluorophores for in vivo imaging can be greatly limited by opsonization, rapid clearance, low detection sensitivity and cytotoxic effects on the host. Encapsulation of fluorophores in liposomes by film hydration and extrusion leads to fluorescence quenching and protection which enables in vivo imaging with high detection sensitivity.

مضان تبريد لالقريبة من الأشعة تحت الحمراء Fluorophore-مغلفة Liposomal كأداة لل<em&gt; في فيفو</em&gt; التصوير الضوئي

Optical imaging offers a wide range of diagnostic modalities and has attracted a lot of interest as a tool for biomedical imaging. Despite the enormous ...

A Guide to Structured Illumination TIRF Microscopy at High Speed with Multiple Colors

Optical super-resolution imaging with structured illumination microscopy (SIM) is a key technology for the visualization of processes at the molecular level in the chemical and biomedical sciences. Although commercial SIM systems are available, systems that are custom designed in the laboratory can outperform commercial systems, the latter typically designed for ease of use and general purpose applications, both in terms of imaging fidelity and speed. This article presents an in-depth guide to building a SIM system that uses total internal reflection (TIR) illumination and is capable of imaging at up to 10 Hz in three colors at a resolution reaching 100 nm. Due to the combination of SIM and TIRF, the system provides better image contrast than rival technologies. To achieve these specifications, several optical elements are used to enable automated control over the polarization state and spatial structure of the illumination light for all available excitation wavelengths. Full details on hardware implementation and control are given to achieve synchronization between excitation light pattern generation, wavelength, polarization state, and camera control with an emphasis on achieving maximum acquisition frame rate. A step-by-step protocol for system alignment and calibration is presented and the achievable resolution improvement is validated on ideal test samples. The capability for video-rate super-resolution imaging is demonstrated with living cells.

This article provides an in depth guide for the assembly and operation of a structured illumination microscope operating with total internal reflection fluorescence illumination (TIRF-SIM) to image dynamic biological processes with optical super-resolution in multiple colors.

دليل لهيكلة الإضاءة TIRF المجهري بسرعة عالية مع الألوان متعددة

Optical super-resolution imaging with structured illumination microscopy (SIM) is a key technology for the visualization of processes at the molecular ...

Correlative Light- and Electron Microscopy Using Quantum Dot Nanoparticles

A method is described whereby quantum dot (QD) nanoparticles can be used for correlative immunocytochemical studies of human pathology tissue using widefield fluorescence light microscopy and transmission electron microscopy (TEM). To demonstrate the protocol we have immunolabeled ultrathin epoxy sections of human somatostatinoma tumor using a primary antibody to somatostatin, followed by a biotinylated secondary antibody and visualization with streptavidin conjugated 585 nm cadmium-selenium (CdSe) quantum dots (QDs). The sections are mounted on a TEM specimen grid then placed on a glass slide for observation by widefield fluorescence light microscopy. Light microscopy reveals 585 nm QD labeling as bright orange fluorescence forming a granular pattern within the tumor cell cytoplasm. At low to mid-range magnification by light microscopy the labeling pattern can be easily recognized and the level of non-specific or background labeling assessed. This is a critical step for subsequent interpretation of the immunolabeling pattern by TEM and evaluation of the morphological context. The same section is then blotted dry and viewed by TEM. QD probes are seen to be attached to amorphous material contained in individual secretory granules. Images are acquired from the same region of interest (ROI) seen by light microscopy for correlative analysis. Corresponding images from each modality may then be blended to overlay fluorescence data on TEM ultrastructure of the corresponding region.

A method is described whereby quantum dot (QD) nanoparticles can be used for correlative immunocytochemical studies of epoxy embedded human pathology tissue. We employ commercial antibody fragment conjugated QDs that are visualized by widefield fluorescence light microscopy and transmission electron microscopy.

المتلازم الخفيفة والمجهر الإلكتروني عن طريق الكم دوت النانوية

A method is described whereby quantum dot (QD) nanoparticles can be used for correlative immunocytochemical studies of human pathology tissue using ...

Correlative Light Electron Microscopy (CLEM) for Tracking and Imaging Viral Protein Associated Structures in Cryo-immobilized Cells

Due to its high resolution, electron microscopy (EM) is an indispensable tool for virologists. However, one of the main difficulties when analyzing virus-infected or transfected cells via EM are the low efficiencies of infection or transfection, hindering the examination of these cells. In order to overcome this difficulty, light microscopy (LM) can be performed first to allocate the subpopulation of infected or transfected cells. Thus, taking advantage of the use of fluorescent proteins (FPs) fused to viral proteins, LM is used here to record the positions of the "positive-transfected" cells, expressing a FP and growing on a support with an alphanumeric pattern. Subsequently, cells are further processed for EM via high pressure freezing (HPF), freeze substitution (FS) and resin embedding. The ultra-rapid freezing step ensures excellent membrane preservation of the selected cells that can then be analyzed at the ultrastructural level by transmission electron microscopy (TEM). Here, a step-by-step correlative light electron microscopy (CLEM) workflow is provided, describing sample preparation, imaging and correlation in detail. The experimental design can be also applied to address many cell biology questions.

Correlative Light Electron Microscopy CLEM for Tracking and Imaging Viral Protein Associated Structures in Cryo-immobilized Cells

A correlative light electron microscopy (CLEM) method is applied to image virus-induced intracellular structures via electron microscopy (EM) in cells that are previously selected by light microscopy (LM). LM and EM are combined as a hybrid imaging approach to achieve an integrated view of virus-host interactions.

المجهر الإلكتروني الارتباطية الخفيفة (كليم) لتتبع وتصوير البروتينات الفيروسية المرتبطة الهياكل في الخلايا المعطل تداولها البرد

Due to its high resolution, electron microscopy (EM) is an indispensable tool for virologists. However, one of the main difficulties when analyzing ...

Gene Expression Analysis of Endothelial Cells Exposed to Shear Stress Using Multiple Parallel-plate Flow Chambers

We describe a workflow for the analysis of gene expression from endothelial cells subject to a steady laminar flow using multiple monitored parallel-plate flow chambers. Endothelial cells form the inner cellular lining of blood vessels and are chronically exposed to the frictional force of blood flow called shear stress. Under physiological conditions, endothelial cells function in the presence of various shear stress conditions. Thus, the application of shear stress conditions in in vitro models can provide greater insight into endothelial responses in vivo. The parallel-plate flow chamber previously published by Lane et al.9 is adapted to study endothelial gene regulation in the presence and absence of steady (non-pulsatile) laminar flow. Key adaptations in the set-up for laminar flow as presented here include a large, dedicated environment to house concurrent flow circuits, the monitoring of flow rates in real-time, and the inclusion of an exogenous reference RNA for the normalization of quantitative real-time PCR data. To assess multiple treatments/conditions with the application of shear stress, multiple flow circuits and pumps are used simultaneously within the same heated and humidified incubator. The flow rate of each flow circuit is measured continuously in real-time to standardize shear stress conditions throughout the experiments. Because these experiments have multiple conditions, we also use an exogenous reference RNA that is spiked-in at the time of RNA extraction for the normalization of RNA extraction and first-strand cDNA synthesis efficiencies. These steps minimize the variability between samples. This strategy is employed in our pipeline for the gene expression analysis with shear stress experiments using the parallel-plate flow chamber, but parts of this strategy, such as the exogenous reference RNA spike-in, can easily and cost-effectively be used for other applications.

Here, a workflow for the culture and gene expression analysis of endothelial cells under fluid shear stress is presented. Included is a physical arrangement for simultaneously housing and monitoring multiple flow chambers in a controlled environment and the use of an exogenous reference RNA for quantitative PCR.

تحليل التعبير الجيني غشائي الخلايا المعرضة للإجهاد باستخدام عدة تدفق مواز-لوحة الدوائر للقص

We describe a workflow for the analysis of gene expression from endothelial cells subject to a steady laminar flow using multiple monitored parallel-plate ...

A Guide to Build a Highly Inclined Swept Tile Microscope for Extended Field-of-view Single-molecule Imaging

Single-molecule imaging has greatly advanced our understanding of molecular mechanisms in biological studies. However, it has been challenging to obtain large field-of-view, high-contrast images in thick cells and tissues. Here, we introduce highly inclined swept tile (HIST) microscopy that overcomes this problem. A pair of cylindrical lenses was implemented to generate an elongated excitation beam that was scanned over a large imaging area via a fast galvo mirror. A 4f configuration was used to position optical components. A scientific complementary metal-oxide semiconductor camera detected the fluorescence signal and blocked the out-of-focus background with a dynamic confocal slit synchronized with the beam sweeping. We present a step-by-step instruction on building the HIST microscope with all basic components.

A detailed instruction is described on how to build a highly inclined swept tile (HIST) microscope and its usage for single-molecule imaging.

دليل لبناء يميل درجة عالية اجتاحت بلاط المجهر لتصوير جزيء مفرد الحقل لعرض موسع

Single-molecule imaging has greatly advanced our understanding of molecular mechanisms in biological studies. However, it has been challenging to obtain ...

Application of Atomic Force Microscopy to Detect Early Osteoarthritis

Biomechanical properties of cells and tissues not only regulate their shape and function but are also crucial for maintaining their vitality. Changes in elasticity can propagate or trigger the onset of major diseases like cancer or osteoarthritis (OA). Atomic force microscopy (AFM) has emerged as a strong tool to qualitatively and quantitatively characterize the biomechanical properties of specific biological target structures on a microscopic scale, measuring forces in a range from as small as the piconewton to the micronewton. Biomechanical properties are of special importance in musculoskeletal tissues, which are subjected to high levels of strain. OA as a degenerative disease of the cartilage results in the disruption of the pericellular matrix (PCM) and the spatial rearrangement of the chondrocytes embedded in their extracellular matrix (ECM). Disruption in PCM and ECM has been associated with changes in the biomechanical properties of cartilage. In the present study we used AFM to quantify these changes in relation to the specific spatial pattern changes of the chondrocytes. With each pattern change, significant changes in elasticity were observed for both the PCM and ECM. Measuring the local elasticity thus allows for drawing direct conclusions about the degree of local tissue degeneration in OA.

We present a method to investigate early osteoarthritic changes at the cellular level in articular cartilage by using atomic force microscopy (AFM).

تطبيق المجهر القوة الذرية للكشف عن هشاشة العظام في وقت مبكر

Biomechanical properties of cells and tissues not only regulate their shape and function but are also crucial for maintaining their vitality. Changes in ...

Single-Cell Optical Action Potential Measurement in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically carried out in low throughput. Rapid and ongoing expansion of induced pluripotent stem cell (iPSC) technology presents a new standard in cardiovascular research and alternate methods are now necessary to increase throughput of electrophysiological data at a single cell level. VF2.1Cl is a recently derived voltage sensitive dye which provides a rapid single channel, high magnitude response to fluctuations in membrane potential. It possesses kinetics superior to those of other existing voltage indicators and makes available functional data equivalent to that of traditional microelectrode techniques. Here, we demonstrate simplified, non-invasive action potential characterization in externally paced human iPSC derived cardiomyocytes using a modular and highly affordable photometry system.

Here we describe optical acquisition and characterization of action potentials from induced pluripotent stem cell derived cardiomyocytes using a high-speed modular photometry system.

قياس إمكانات العمل البصري أحادي الخلية في خلايا القلب المشتقة من الخلايا الجذعية المتعددة القدرات

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically ...