نشكر القس الدكتور رالف Bohlmann والقس الدكتور جيمس Voelz لاقتراح كلمة &quot;القيامة&quot; لوصف عكس موت الخلايا المبرمج. دوغلاس R. الأخضر للخلايا هيلا معربا عن ستابلي السيتوكروم ج -GFP. تشارلز M. رودين واريك E. غاردنر لH446 خلايا. هيذر لامب للمساعدة في الرسوم المتحركة الرسم في الفيديو؛ يي هوى يو لمناقشة قيمة هذه المخطوطة. وأيد هذا العمل من قبل زمالة السير إدوارد Youde التذكارية (HLT)، ومنح الدراسية الدكتور والتر Szeto التذكارية (HLT)، منحة فولبرايت 007-2009 (HLT)، زمالة مؤسسة أبحاث علوم الحياة (HLT)، NIH منح NS037402 (JMH) وNS083373 (JMH)، ولجنة المنح الجامعية من هونغ كونغ اوي / B-07/99 (قدم مكعبة). هو لام تانغ هو مؤسسة زميل Shurl وكاي كورتشي لمؤسسة بحوث علوم الحياة.

The authors have nothing to disclose.

القيامة يشير إلى ظاهرة حيث الخلايا التي تم تنشيطها مسار موت الخلايا بعد ذلك عكس عملية الموت والبقاء على قيد الحياة. هنا، لقد أثبتنا أن تصوير الخلايا الحية يمكن أن تستخدم للتأكد من أن الخلايا الفردية نفسها في الواقع يمكن عكس أفكارك عملية موت الخلايا في مرحلة متأخرة، وبعد ذلك يستمر على قيد الحياة والتكاثر. بروتوكولات لدينا تصف عدة نوع معين الظروف العلاج بالخلايا الأمثل للحث على موت الخلايا المبرمج والسماح لنسبة كبيرة من الخلايا للخضوع لعكس موت الخلايا المبرمج رصدها مع العديد من المؤشرات الحيوية للتحقق منها. وفيما يتعلق بالقضايا الفنية، استخدمت أطباق الزجاج السفلي للخلايا الثقافة للتصوير 12،13، لأن من الزجاج رقيقة شفافة للغاية بين الخلايا والهدف المجهر، والذي يسمح لمسافات طويلة للعمل متحد البؤر ذات جودة عالية أو برنامج التحصين الموسع ومضان المجهري في تضخم عالية، يسهل مراقبة موت الخلايا المبرمج الكلاسيكية بما في ذلك تجزئة الميتوكوندريا، وإطلاق سراح من السيتوكروم ج، والتكثيف النووي وتجزئة. الزجاج أيضا لا تشوه قطبية الضوء، للسماح جودة عالية DIC المجهري لرصد blebbing الغشاء، انكماش الخلايا من الخلايا، وتشكيل هيئة أفكارك أثناء موت الخلايا المبرمج. مدينة دبي للإنترنت المجهري له مزايا أكثر النقيض من المرحلة المجهر لمراقبة هذه السمات المميزة المورفولوجية للموت الخلايا المبرمج، ومدينة دبي للإنترنت يعزز على النقيض من عينات الخلايا غير ملوثين وشفافة، وتحسين الكشف عن الأشكال التضاريسية الخلية. إذا DIC والنقيض من المرحلة المجهري غير متوفرة، CellTracker يمكن استخدامها لوصمة عار على العصارة الخلوية لتحديد مورفولوجية الخلايا الحية للمتحد البؤر أو برنامج التحصين الموسع ومضان المجهر ورصد مورفولوجيا الخلايا. تطبيق الجرعات المناسبة من المحفزات الموت واستراتيجيات إزالة المثيرات خطوات حاسمة للكشف عن القيامة. لقد اخترنا لاستخدام تركيزات منخفضة من الإيثانول كحافز الموت لأن descr التجاربibed هنا لأن نسبة كبيرة من الخلايا المعالجة يمكن أن يخضع موحد موت الخلايا المبرمج ويمكن الشفاء من هذا، يحتمل أن تكون أكثر اعتدالا، وحافز الموت. ومع ذلك، يمكن أيضا أن تطبق هذه النهج بنجاح مع المثيرات الموت أخرى، ونحن قد ذكرت 12،13. ومع ذلك، فإن بعض المحفزات الموت هي بطبيعتها أكثر صعوبة من غيرها، مثل staurosporine (STS)، وكيل الذي يحفز الخلايا التي يشيع استخدامها. ربما لأنه يربط ركائز مع تقارب عالية 46-48، ويغسل المتكررة ضرورية ولكن لا يزال قد لا تزيل STS بكفاءة من الخلايا. في هذه الحالة، وذلك باستخدام أقل تركيزات المخدرات وأقصر فترة حضانة المخدرات التي ما زالت قادرة على تفعيل عملية الموت أفكارك يمكن أن يكون مفيدا للسماح للمزيد من الخلايا لعكس موت الخلايا المبرمج. إعادة تغذية الخلايا مع مشروط خلية ثقافة المتوسط ​​يمكن أن يعزز أيضا انعكاس للموت الخلايا المبرمج أفضل من مستنبت خلايا جديدة. وعادة ما تكون مرفقة الخلايا أفكارك فضفاضة على سطح الطبق الثقافة بشكل خاص على الزجاج سوروجوه، وبالتالي من المهم أن يغسل محرضات موت الخلايا المبرمج بلطف لتجنب فصل الخلايا. طلاء أطباق الزجاج مع بولي-D-ليسين، والكولاجين و / أو فبرونيكتين يمكن زيادة الالتزام خلية للسماح أنواع معينة من الخلايا، مثل العضلية 37، لنعلق بشكل صحيح على سطح الزجاج من الأطباق زراعة الخلايا، وخاصة بعد تعرض الخلايا إلى التحفيز الموت. تعتمد عملية موت الخلايا المبرمج، وعلى الأرجح عكس موت الخلايا المبرمج، على الأنشطة الأنزيمية التي يمكن أن تتأثر درجة الحرارة. لذلك، والحفاظ على خلايا عند 37 درجة مئوية أو في حالة الثقافة وضعها الطبيعي المهم في جميع مراحل عملية التصوير الحي لضمان استنساخ النتائج التجريبية. المجهر قبل الدافئ قبل بدء التصوير الخلية الحية هو أيضا خطوة حاسمة تسمح مكونات المجهر للوصول الحرارية التوازن. وهذا يمكن تجنب الانجراف التركيز والتحول من الطائرة س ص بسبب التمدد الحراري والانكماش منالمكونات أثناء التصوير الخلية الحية. وضع أو إزالة الحوافز الموت عن طريق تغيير المتوسطة طبق ثقافة إما مع الماصة أو عن طريق نضح في النظام المجهري قبل تحسنت خلال الوقت الفاصل بين التصوير لا تزال تسبب الانجراف التركيز نتيجة للتغيرات في درجة الحرارة أو حجم المتوسط. اكتساب Z كومة يمكن أن تساعد على خلايا الصورة في المستوى البؤري الصحيحة، ولكن سوف تزيد من خطر الضيائية بسبب التعرض الإضافي من الخلايا لأشعة الليزر الفلورسنت. بدلا من ذلك، استخدام نظم التعويض الانجراف التركيز، مثل نظام التصحيح التلقائي القائم على التركيز ليزر الأشعة تحت الحمراء، يمكن أن تبقي خلايا في نفس المستوى البؤري خلال الوقت الفاصل بين التصوير الخلية الحية من خلال الحفاظ على المسافة بين الخلايا / الزجاج والهدف اضافية دون تعرض الخلايا إلى الطول الموجي القصير، مضان الضوئي السمي. الإفراج الميتوكوندريا من البروتينات apoptogenic مثل السيتوكروم ج، وتفعيل caspases المستجيب، مثل المصب / الأثرأو كاسباس 3 و كاسباس 7، وقد يعتبر عموما أن تكون &quot;نقطة اللاعودة&quot; في أفكارك 2،5،6 عملية موت الخلايا. وقد استخدمت البقع الغربية للكشف عن الانقسام (تفعيل) من كاسباس 3 وركائز لها مثل بولي (ADP) -ribose البلمرة-1 (PARP) وDFF45 / ICAD في السكان الخلية كله خلال الحث أفكارك وبعد إزالة أفكارك المحفزات، وكشف عن أن المشقوق كاسباس 3، أظهرت ICAD، وPARP تصل في الخلايا أثناء التعرض للمؤثرات الموت، ولكن اختفى بعد أن الخلايا إعادة تغذية مع ثقافة جديدة المتوسطة 13. ومع ذلك، هذه الأساليب تكشف عن الحالة العامة في السكان الخلية، ولكن لا تميز الخلايا الفردية التي سوف يموت في نهاية المطاف من تلك التي من شأنها عكس الخلايا ومن ثم البقاء على قيد الحياة. تجزئة البيوكيميائية لتحليل الإفراج عن الميتوكوندريا السيتوكروم ج ديها المحاذير مماثلة. لذلك، لتتبع مصير الخلايا الفردية بعد السيتوكروم ج الافراج عن وكاسباس ميلانيحصر تفعيل، وهما من السمات المميزة معظم المعترف بها من موت الخلايا المبرمج 2،5،6، الموسومة GFP السيتوكروم ج (C خلوي -GFP) وجهاز الاستشعار البيولوجي كاسباس، مثل تلك المستخدمة هنا NES-DEVD-YFP-NLS، جنبا إلى جنب مع الخلية الحية المجهر الالتفاف على هذه المشاكل من خلال مراقبة مباشرة الانتعاش الصرفي والنبات من جهاز الاستشعار البيولوجي خلوي C -GFP في نفس الخلايا. هذه النتائج تشير إلى عكس موت الخلايا المبرمج بعد السيتوكروم الميتوكوندريا ج إطلاق وتفعيل كاسباس. التحدي الحالي لدراسة القيامة هو عدم وجود تقنيات وضع العلامات للكشف عن الخلايا التي خضعت القيامة في أي لحظة طيلة حياتها، في الجسم الحي أو في المختبر. التعبير المستقر للكاسباس جهاز الاستشعار البيولوجي NES-DEVD-YFP-NLS أيضا يسمح الكشف عن النشاط كاسباس في حالة تنشيط caspases مرة أخرى في المستقبل، ولكن لا يسجل بشكل دائم النشاط كاسباس كما سيتم المتدهورة في جهاز الاستشعار البيولوجي تفعيلها دون sustaالنشاط كاسباس INED 13. غيرها من أجهزة الاستشعار كاسباس ذكر سابقا، مثل أجهزة الاستشعار SCAT القائم على الحنق (على سبيل المثال ECFP- [DEVD] -Venus) 26،49 وكذلك صحفيين الفلورسنت Apoliner (CD8-RFP- [DQVD] -GFP) 50 وCPV (على سبيل المثال CD8 - [DEVD] -Venus) 51،52، ويمكن استخدامها للكشف عن النشاط كاسباس في الحيوانات كلها والخلايا المستزرعة، ولكن لديها قيود مشابهة. وبالمثل، خلوي C -GFP لا يمكن استخدامها لتعقب الخلايا التي عكست موت الخلايا المبرمج في المدى الطويل، كما يتم تحريرها من الميتوكوندريا في العصارة الخلوية خلال موت الخلايا المبرمج وتدهورت في وقت لاحق. وقد استخدم وضع العلامات Annexin V لتعقب الخلايا التي عكست موت الخلايا المبرمج، ولكن تنخفض كثافة إشارة أيضا مع الوقت، لذلك ليس من المفيد لتتبع المدى الطويل القيامة 13،45. يمكن استخدامها على المدى الطويل المستمر في مجال التصوير فيفو لتتبع مصير من نفس الخلايا بعد التعرض للمثيرات الموت. ومع ذلك، على المدى الطويل في مجال التصوير فيفو لا يزال تحديا رس أداء في معظم الحيوانات الحية. لذلك هناك حاجة إلى نهج إضافية لتوسيع البحوث القيامة للدراسات الحيوانية كلها، وفحص الأدوية التي يمكن أن تعزز أو تمنع القيامة باستخدام الخلايا زراعة الأنسجة في المستقبل، وهناك حاجة أحدث البروتوكولات والتقنيات التي تتبع مصير خلية طويلة الأجل لتطوير واختبار الآثار الفسيولوجية، المرضية والعلاجية للالقيامة. اقترحنا أن القيامة قد تكون آلية بقاء الخلية العامة لانقاذ الخلايا المصابة التي يصعب استبدال، مثل الخلايا العصبية الناضجة وخلايا القلب 13. ومع ذلك، يمكن أن القيامة الخلايا السرطانية أفكارك بعد العلاج العلاج الكيميائي يؤدي إلى استعادة خلايا خطيرة مما يؤدي إلى تكرار حدوث الأورام مقاومة 12،13. القيامة يمكن أن يكون أيضا آلية مهمة لتكون الأورام، كما عرض بعض خلايا التحول أنكجنيك بعد أن عكس موت الخلايا المبرمج 13. وبالتالي، تعزيز القيامة يمكن أن يكون ثيرا جديداستراتيجية peutic لتثبيط التنكس العصبي والقلب والفشل، في حين قمع القيامة باعتبارها وسيلة جديدة لمنع أو علاج السرطان. تطوير أجهزة الاستشعار لتعقب عكس موت الخلايا المبرمج في نظم نموذج المرض وتعزيز فهم آليات بقاء الخلية من القيامة، والعلاجات المحتملة للأمراض المستعصية عن طريق تحوير القيامة.

موت الخلايا المبرمج (اليونانية ل &quot;يسقط إلى الموت&quot;) يفترض عموما أن يكون عملية ذات اتجاه واحد تنتهي في خلية انتحارية 1-7. اضطراب وراثي للجينات النتائج المؤيدة للوفاة في بقاء الخلايا الإضافية التي من شأنها أن يموت على خلاف ذلك في الحيوانات كلها، بما في ذلك الخلايا التي بدأت بالفعل 8،9 مسار موت الخلايا المبرمج. وبالمثل، التلاعب الجيني تسمح خلايا الثدييات الصحية التي تعرض بشكل مصطنع &quot;أكل لي&quot; إشارات أو التي تفقد الإلتصاق إلى مصفوفة من خارج الخلية إلى الهروب الموت البلعمة خلية كاملة أو entosis، على التوالي 10،11. ومع ذلك، نحن وغيرنا قد أظهرت أنه من دون التلاعب الجيني خلايا الثدييات صحية طبيعية وخطوط الخلايا يمكن أيضا استرداد من المراحل المبكرة من موت الخلايا المبرمج 12-15. استخدام أدوات لتتبع الخلايا الفردية، ولقد أثبتت مزيد من التعافي من المراحل المتأخرة من موت الخلايا المبرمج 12،13، بعد مرور خلايا نقاط التفتيش الهامة التي نموذجيةلاي بمناسبة &quot;نقطة اللاعودة&quot; 2-6. وتشمل هذه الحواجز من أواخر مرحلة موت الخلايا المبرمج الإفراج الميتوكوندريا من السيتوكروم ج، وتفعيل caspases، والتجزؤ النووي، وتشكيل هيئات أفكارك. اعتمدنا كلمة مركبة اليونانية &quot;القيامة&quot;، وهو ما يعني &quot;ارتفاع في الحياة&quot;، لوصف هذا عكس موت الخلايا المبرمج على شفا موت الخلية 2-6. إلا إذا لوحظ عملية استرداد الموت بأكملها من خلال تصوير الخلايا الحية، فإنه يمثل تحديا للتمييز الخلايا التي خضعت القيامة من الخلايا التي لم يشهد الأحداث أفكارك. وقد كشفت عقود من العمل أن السمات المورفولوجية للانتحار الخلية عن طريق الخلايا هي التي تحرك الأحداث البيوكيميائية والجزيئية الحفظ تطويريا 16-19. هذه الأحداث تعزز التدمير الذاتي للخلايا لتنظيم العمليات التنموية وhomoeostatic في الكائنات وحيدة الخلية ومتعددة الخلايا من خلال القضاء على تلف أو دخلايا angerous 16-19. في حين أن الخلايا أفكارك يمكن تمييزها بسهولة من المظاهر الشكلية، والكيمياء الحيوية والجزيئية موحدة للموت الخلايا المبرمج 1،5،6،16،20، حاليا لا يوجد أي علامة معروفة محددة لالقيامة 12،13. الأهم من ذلك، تظهر الخلايا التي خضعت القيامة لتكون الخلايا السليمة العادية، والخلايا التي تبدأ فقط عكس موت الخلايا المبرمج تظهر الخلايا أفكارك كما الموت 12،13. وبالتالي، هناك حاجة إلى أدوات جديدة لإبرام مع اليقين أن خلية على قيد الحياة نظرا قد شهدت في السابق عمليات أفكارك النشطة. ويفترض موت الخلايا المبرمج عموما باعتباره سلسلة لا رجعة فيها لأنها عملية التدمير السريعة والواسعة النطاق. في حين ان الامر قد يستغرق دقائق إلى أيام لبعض الخلايا لبدء موت الخلايا المبرمج، بمجرد الإفراج الميتوكوندريا عوامل apoptogenic مثل السيتوكروم ج في العصارة الخلوية 21،22، يمكن تنشيط caspases خلال 5 دقائق 23،24، تليها حشوية والتكثيف النووي في غضون 10 دقيقة 25-27، وموت الخلايا بعد ذلك بوقت قصير 25-27. caspases تنشيط الانسجام موت الخلايا المبرمج من قبل الشق وتعطيل المكونات الهيكلية والوظيفية الرئيسية لغرض هدم الخلوي 2،28، مثل مثبطات نوكلياز داخلية DFF45 / ICAD 29،30. أيضا تفعيل Caspases العوامل المؤيدة لأفكارك، مثل BID عضو BCL-2 الأسرة، التي translocates إلى الميتوكوندريا لتعزيز الإفراج الميتوكوندريا من السيتوكروم ج 31،32. النتائج النشاط كاسباس أيضا في التعرض سطح الخلية من فسفاتيديل بأنه &quot;أكل لي&quot; إشارة لتعزيز ابتلاع الموت الخلايا الضامة أو الخلايا المجاورة من خلال 33 البلعمة. وعلاوة على ذلك، والأحداث أفكارك تجعل الميتوكوندريا المختلة وظيفيا، وتعطيل الطاقة الحيوية الخلوية والتمثيل الغذائي 34،35،36. وهكذا، يبدو من غير المحتمل بشكل حدسي الشفاء من هذا التدمير. وعلى عكس الأصلي نتوقعations، يمكن للخلايا عكس عملية موت الخلايا أفكارك حتى في مرحلة متأخرة. من خلال المراقبة المستمرة مصير الموت الخلايا في الثقافة، لاحظنا عكس من أواخر مرحلة موت الخلايا المبرمج في مجموعة من الخلايا الأولية وخطوط الخلايا 12،13. إزالة الحوافز الموت سمحت التعافي من الميزات العلنية من موت الخلايا المبرمج، مثل تجزئة الميتوكوندريا، والتكثيف لونين، الحمض النووي من التلف، والبلازما blebbing الغشاء، والتعرض سطح الخلية من فسفاتيديل، وإطلاق سراح من الميتوكوندريا السيتوكروم ج، وتفعيل كاسباس، والتجزؤ النووي، انكماش الخلية، وتشكيل هيئات أفكارك. هذه الملاحظات تثير علامات الاستفهام بشأن الوظائف، والعواقب، وآليات القيامة. لمعالجة هذه المسائل، وهو شرط أساسي هو تحديد موثوق الخلايا التي خضعت القيامة. هنا، نحن تصف أساليب الفحص المجهري المباشر وجهاز الاستشعار البيولوجي كاسباس للكشف عن الخلايا التي قد عكس في السابق أواخر مرحلة موت الخلايا المبرمج والعشريننجا أون.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="667">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:235px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:139px;">Company</td>
			<td style="width:127px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:235px;">LSM780 confocal microscopy</td>
			<td style="width:139px;">Carl Zeiss</td>
			<td style="width:127px;">/</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:235px;">Glass bottom culture dish</td>
			<td style="width:139px;">MatTek Corporation</td>
			<td style="width:127px;">P35G-0-14-C</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:235px;">Transparent CultFoi</td>
			<td style="width:139px;">Carl Zeiss</td>
			<td style="width:127px;">000000-1116-084</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:235px;">CO2 independent medium</td>
			<td style="width:139px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:127px;">18045-088</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:235px;">CellTracker</td>
			<td style="width:139px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:127px;">C34552</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:235px;">Mitotracker Red CMXRos</td>
			<td style="width:139px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:127px;">M-7512</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:235px;">Hoechst 33342</td>
			<td style="width:139px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:127px;">H1399</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:235px;">Fluorescently labeled annexin V</td>
			<td style="width:139px;">Biovision</td>
			<td style="width:127px;">K201</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

strategies for tracking anastasis, a cell survival phenomenon that reverses apoptosis

القيامة (اليونانية ل &quot;ارتفاع في الحياة&quot;) يشير إلى انتعاش الخلايا الميتة. قبل هذه الخلايا على التعافي، وأنها مرت عبر نقاط التفتيش مهمة من موت الخلايا المبرمج، بما في ذلك تجزئة الميتوكوندريا، وإطلاق سراح من الميتوكوندريا السيتوكروم ج في العصارة الخلوية، وتفعيل caspases، والتكثيف لونين، الحمض النووي من التلف، والتجزؤ النووي، blebbing غشاء البلازما، وانكماش الخلايا، والتعرض سطح الخلية من فسفاتيديل، وتشكيل هيئات أفكارك. يمكن أن يحدث القيامة عندما تتم إزالة المثيرات أفكارك قبل الموت، مما يسمح الخلايا الميتة لعكس موت الخلايا المبرمج وآليات الموت يحتمل الأخرى. لذلك، يظهر القيامة لإشراك عمليات الشفاء الفسيولوجية التي يمكن أيضا أن الحفاظ على الخلايا التالفة بشكل غير لائق. وظائف وآليات القيامة لا تزال غير واضحة، عرقل في جزء من أدوات محدودة للكشف عن الأحداث الماضية بعد التعافي من خلايا سليمة ظاهريا. استراتيجيات للكشف عن anastaوجهاز الأمن والمخابرات تمكين دراسات الآليات الفسيولوجية، والمخاطر الخلايا أوندد في علم الأمراض المرض، والعلاجات المحتملة لتعديل القيامة. هنا، نحن تصف استراتيجيات فعالة باستخدام المجهر الخلايا الحية وجهاز الاستشعار البيولوجي كاسباس الثدييات لتحديد وتتبع القيامة في خلايا الثدييات.

Watch this Scientific Journal Video about Strategies for Tracking Anastasis, A Cell Survival Phenomenon that Reverses Apoptosis at JoVE.com

Strategies for Tracking Anastasis, A Cell Survival Phenomenon that Reverses Apoptosis

The term anastasis refers to the phenomenon in which dying cells reverse a cell suicide process at a late stage, repair themselves, and ultimately survive. Here we demonstrate protocols for detecting and tracking cells that undergo anastasis.

استراتيجيات لتتبع القيامة، خلية بقاء ظاهرة التي عكس موت الخلايا المبرمج

Anastasis (Greek for &#8220;rising to life&#8221;) refers to the recovery of dying cells. Before these cells recover, they have passed through important ...

strategies-for-tracking-anastasis-cell-survival-phenomenon-that

Google

Research

JoVE Journal

Biology

17.9K Views.  Johns Hopkins University Bloomberg School of Public Health. The term anastasis refers to the phenomenon in which dying cells reverse a cell suicide process at a late stage, repair themselves, and ultimately survive. Here we demonstrate protocols for detecting and tracking cells that undergo anastasis. 

Video: Strategies for Tracking Anastasis, A Cell Survival Phenomenon that Reverses Apoptosis

Monitoring Dynamic Changes In Mitochondrial Calcium Levels During Apoptosis Using A Genetically Encoded Calcium Sensor

Dynamic changes in intracellular calcium concentration in response to various stimuli regulates many cellular processes such as proliferation, differentiation, and apoptosis1. During apoptosis, calcium accumulation in mitochondria promotes the release of pro-apoptotic factors from the mitochondria into the cytosol2. It is therefore of interest to directly measure mitochondrial calcium in living cells in situ during apoptosis. High-resolution fluorescent imaging of cells loaded with dual-excitation ratiometric and non-ratiometric synthetic calcium indicator dyes has been proven to be a reliable and versatile tool to study various aspects of intracellular calcium signaling. Measuring cytosolic calcium fluxes using these techniques is relatively straightforward. However, measuring intramitochondrial calcium levels in intact cells using synthetic calcium indicators such as rhod-2 and rhod-FF is more challenging. Synthetic indicators targeted to mitochondria have blunted responses to repetitive increases in mitochondrial calcium, and disrupt mitochondrial morphology3. Additionally, synthetic indicators tend to leak out of mitochondria over several hours which makes them unsuitable for long-term experiments. Thus, genetically encoded calcium indicators based upon green fluorescent protein (GFP)4 or aequorin5 targeted to mitochondria have greatly facilitated measurement of mitochondrial calcium dynamics. Here, we describe a simple method for real-time measurement of mitochondrial calcium fluxes in response to different stimuli. The method is based on fluorescence microscopy of 'ratiometric-pericam' which is selectively targeted to mitochondria. Ratiometric pericam is a calcium indicator based on a fusion of circularly permuted yellow fluorescent protein and calmodulin4. Binding of calcium to ratiometric pericam causes a shift of its excitation peak from 415 nm to 494 nm, while the emission spectrum, which peaks around 515 nm, remains unchanged. Ratiometric pericam binds a single calcium ion with a dissociation constant in vitro of ~1.7 &mu;M4. These properties of ratiometric pericam allow the quantification of rapid and long-term changes in mitochondrial calcium concentration. Furthermore, we describe adaptation of this methodology to a standard wide-field calcium imaging microscope with commonly available filter sets. Using two distinct agonists, the purinergic agonist ATP and apoptosis-inducing drug staurosporine, we demonstrate that this method is appropriate for monitoring changes in mitochondrial calcium concentration with a temporal resolution of seconds to hours. Furthermore, we also demonstrate that ratiometric pericam is also useful for measuring mitochondrial fission/fragmentation during apoptosis. Thus, ratiometric pericam is particularly well suited for continuous long-term measurement of mitochondrial calcium dynamics during apoptosis.

This protocol describes a method for real-time measurement of mitochondrial calcium fluxes by fluorescent imaging. The method takes advantage of a circularly permutated YFP-based dual-excitation ratiometric calcium sensor (ratiometric pericam-mt) selectively expressed in mitochondria.

رصد التغيرات الدينامية في مستويات الكالسيوم الميتوكوندريا خلال موت الخلايا المبرمج باستخدام جهاز استشعار الكالسيوم مشفرة وراثيا

Dynamic changes in intracellular calcium concentration in response to various stimuli regulates many cellular processes such as proliferation, ...

Modified Annexin V/Propidium Iodide Apoptosis Assay For Accurate Assessment of Cell Death

Studies of cellular apoptosis have been significantly impacted since the introduction of flow cytometry-based methods. Propidium iodide (PI) is widely used in conjunction with Annexin V to determine if cells are viable, apoptotic, or necrotic through differences in plasma membrane integrity and permeability1,2. The Annexin V/ PI protocol is a commonly used approach for studying apoptotic cells3. PI is used more often than other nuclear stains because it is economical, stable and a good indicator of cell viability, based on its capacity to exclude dye in living cells 4,5. The ability of PI to enter a cell is dependent upon the permeability of the membrane; PI does not stain live or early apoptotic cells due to the presence of an intact plasma membrane 1,2,6. In late apoptotic and necrotic cells, the integrity of the plasma and nuclear membranes decreases7,8, allowing PI to pass through the membranes, intercalate into nucleic acids, and display red fluorescence 1,2,9. Unfortunately, we find that conventional Annexin V/ PI protocols lead to a significant number of false positive events (up to 40%), which are associated with PI staining of RNA within the cytoplasmic compartment10. Primary cells and cell lines in a broad range of animal models are affected, with large cells (nuclear: cytoplasmic ratios &lt;0.5) showing the highest occurrence10. Herein, we demonstrate a modified Annexin V/ PI method that provides a significant improvement for assessment of cell death compared to conventional methods. This protocol takes advantage of changes in cellular permeability during cell fixing to promote entry of RNase A into cells following staining. Both the timing and concentration of RNase A have been optimized for removal of cytoplasmic RNA. The result is a significant improvement over conventional Annexin V/ PI protocols (&lt; 5% events with cytoplasmic PI staining).

An accurate method for the assessment of cell death is described. The protocol improves upon conventional Annexin V/ propidium iodide (PI) protocols, which display up to 40% false- positive events in cell lines and primary cells from a broad range of animal models.

تعديل Annexin الأبوطوزيس التأيد V / Propidium الفحص للحصول على تقييم دقيق للموت الخلية

Studies of cellular apoptosis have been significantly impacted since the introduction of flow cytometry-based methods. Propidium iodide (PI) is widely ...

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

Apoptosis, or programmed cell death, is a conserved and highly regulated pathway by which cells die1. Apoptosis can be triggered when cells encounter a wide range of cytotoxic stresses. These insults initiate signaling cascades that ultimately cause the release of cytochrome c from the mitochondrial intermembrane space to the cytoplasm2. The release of cytochrome c from mitochondria is a key event that triggers the rapid activation of caspases, the key cellular proteases which ultimately execute cell death3-4.
The pathway of apoptosis is regulated at points upstream and downstream of cytochrome c release from mitochondria5. In order to study the post-mitochondrial regulation of caspase activation, many investigators have turned to direct cytoplasmic microinjection of holocytochrome c (heme-attached) protein into cells6-9. Cytochrome c is normally localized to the mitochondria where attachment of a heme group is necessary to enable it to activate apoptosis10-11. Therefore, to directly activate caspases, it is necessary to inject the holocytochrome c protein instead of its cDNA, because while the expression of cytochrome c from cDNA constructs will result in mitochondrial targeting and heme attachment, it will be sequestered from cytosolic caspases. Thus, the direct cytosolic microinjection of purified heme-attached cytochrome c protein is a useful tool to mimic mitochondrial cytochrome c release and apoptosis without the use of toxic insults which cause cellular and mitochondrial damage.
In this article, we describe a method for the microinjection of cytochrome c protein into cells, using mouse embryonic fibroblasts (MEFs) and primary sympathetic neurons as examples. While this protocol focuses on the injection of cytochrome c for investigations of apoptosis, the techniques shown here can also be easily adapted for microinjection of other proteins of interest.

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

In this protocol, we describe the direct cytoplasmic microinjection of cytochrome c protein into fibroblasts and primary sympathetic neurons. This technique allows for the introduction of cytochrome c protein into the cytoplasm of cells and mimics the release of cytochrome c from mitochondria, which occurs during apoptosis.

تفعيل موت الخلايا المبرمج من قبل Microinjection هيولي من السيتوكروم ج</em

Apoptosis, or programmed cell death, is a conserved and highly regulated pathway by which cells die1.  Apoptosis can be triggered when cells encounter a ...

Tracking Morphogenetic Tissue Deformations in the Early Chick Embryo

Embryonic epithelia undergo complex deformations (e.g. bending, twisting, folding, and stretching) to form the primitive organs of the early embryo. Tracking fiducial markers on the surfaces of these cellular sheets is a well-established method for estimating morphogenetic quantities such as growth, contraction, and shear. However, not all surface labeling techniques are readily adaptable to conventional imaging modalities and possess different advantages and limitations. Here, we describe two labeling methods and illustrate the utility of each technique. In the first method, hundreds of fluorescent labels are applied simultaneously to the embryo using magnetic iron particles. These labels are then used to quantity 2-D tissue deformations during morphogenesis. In the second method, polystyrene microspheres are used as contrast agents in non-invasive optical coherence tomography (OCT) imaging to track 3-D tissue deformations. These techniques have been successfully implemented in our lab to studythe physical mechanisms of early head fold, heart, and brain development, and should be adaptable to a wide range morphogenetic processes.

This article describes surface labeling and ex ovo tissue culture in the early chick embryo. Techniques amenable to time-lapse bright field, fluorescence, and optical coherence tomography imaging are presented. Tracking surface labels with high spatiotemporal resolution enables kinematic quantities such as morphogenetic strains (deformations) to be calculated in both two and three dimensions.

تتبع التشويهات الأنسجة التخلق في جنين الفرخ المبكر

Embryonic epithelia undergo complex deformations (e.g. bending, twisting, folding, and stretching) to form the primitive organs of the early embryo. ...

Formulations for Freeze-drying of Bacteria and Their Influence on Cell Survival

Cellular water can be removed to reversibly inactivate microorganisms to facilitate storage. One such method of removal is freeze-drying, which is considered a gentle dehydration method. To facilitate cell survival during drying, the cells are often formulated beforehand. The formulation forms a matrix that embeds the cells and protects them from various harmful stresses imposed on the cells during freezing and drying. We present here a general method to evaluate the survival rate of cells after freeze-drying and we illustrate it by comparing the results obtained with four different formulations: the disaccharide sucrose, the sucrose derived polymer Ficoll PM400, and the respective polysaccharides hydroxyethyl cellulose (HEC) and hydroxypropyl methyl cellulose (HPMC), on two strains of bacteria, P. putida KT2440 and A. chlorophenolicus A6. In this work we illustrate how to prepare formulations for freeze-drying and how to investigate the mechanisms of cell survival after rehydration by characterizing the formulation using of differential scanning calorimetry (DSC), surface tension measurements, X-ray analysis, and electron microscopy and relating those data to survival rates. The polymers were chosen to get a monomeric structure of the respective polysaccharide resembling sucrose to a varying degrees. Using this method setup we showed that polymers can support cell survival as effectively as disaccharides if certain physical properties of the formulation are controlled1.

Freeze-drying is often an easy and convenient way to obtain dry products of viable bacterial cells. An issue of the process is cell survival. We detail here a procedure to investigate how cell survival during freeze-drying is influenced by the properties of the formulation used.

تركيبات لتجميد التجفيف من البكتيريا وتأثيرها على بقاء الخلية

Cellular water can be removed to reversibly inactivate microorganisms to facilitate storage. One such method of removal is freeze-drying, which is ...

Optimized Staining and Proliferation Modeling Methods for Cell Division Monitoring using Cell Tracking Dyes

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of different cell types in vitro and in vivo.1-5 Although there are literally thousands of publications using such dyes, some of the most commonly encountered cell tracking applications include monitoring of:
<ol>
	<li>stem and progenitor cell quiescence, proliferation and/or differentiation6-8</li>
	<li>antigen-driven membrane transfer9 and/or precursor cell proliferation3,4,10-18 and</li>
	<li>immune regulatory and effector cell function1,18-21.</li>
</ol>
Commercially available cell tracking dyes vary widely in their chemistries and fluorescence properties but the great majority fall into one of two classes based on their mechanism of cell labeling. "Membrane dyes", typified by PKH26, are highly lipophilic dyes that partition stably but non-covalently into cell membranes1,2,11. "Protein dyes", typified by CFSE, are amino-reactive dyes that form stable covalent bonds with cell proteins4,16,18. Each class has its own advantages and limitations. The key to their successful use, particularly in multicolor studies where multiple dyes are used to track different cell types, is therefore to understand the critical issues enabling optimal use of each class2-4,16,18,24.
The protocols included here highlight three common causes of poor or variable results when using cell-tracking dyes. These are:
<ol>
	<li>Failure to achieve bright, uniform, reproducible labeling. This is a necessary starting point for any cell tracking study but requires attention to different variables when using membrane dyes than when using protein dyes or equilibrium binding reagents such as antibodies.</li>
	<li>Suboptimal fluorochrome combinations and/or failure to include critical compensation controls. Tracking dye fluorescence is typically 102 - 103 times brighter than antibody fluorescence. It is therefore essential to verify that the presence of tracking dye does not compromise the ability to detect other probes being used.</li>
	<li>Failure to obtain a good fit with peak modeling software. Such software allows quantitative comparison of proliferative responses across different populations or stimuli based on precursor frequency or other metrics. Obtaining a good fit, however, requires exclusion of dead/dying cells that can distort dye dilution profiles and matching of the assumptions underlying the model with characteristics of the observed dye dilution profile.</li>
</ol>
Examples given here illustrate how these variables can affect results when using membrane and/or protein dyes to monitor cell proliferation.

Successful use of cell tracking dyes to monitor immune cell function and proliferation involves several critical steps. We describe methods for: 1) obtaining bright, uniform, reproducible label-ing with membrane dyes; 2) selecting fluorochromes and data acquisition conditions; and 3) choosing a model to quantify cell proliferation based on dye dilution.

الأمثل أساليب النمذجة وتلوين لرصد انتشار استخدام الأصباغ انقسام الخلية خلية تتبع

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of ...

Cell Tracking Using Photoconvertible Proteins During Zebrafish Development

Embryogenesis is a dynamic process that is best studied by using techniques that allow the documentation of developmental changes in vivo. The use of genetically-encoded fluorescent proteins has proven a valuable strategy for elucidating dynamic morphogenetic processes as they occur in the intact organism. During the past decade, the development of photoactivatable and photoconvertible fluorescent proteins has opened the possibility to investigate the fate of discrete subpopulations of tagged proteins1. Unlike photoactivatable proteins, photoconvertible fluorescent proteins (PCFPs) are readily tracked and imaged in their native emission state prior to photoconversion, making it easier to identify and select regions by optical inspection. PCFPs, such as Kaede2, KikGR3, Dendra4 and EosFP5, can be shifted from green to red upon exposure to UV or blue light due to a His-Tyr-Gly tripeptide sequence which forms a green chromophore that can be photoconverted to a red one by a light-catalyzed &beta;-elimination and subsequent extension of a &pi;-conjugated system3. PCFPs and their monomeric variants are useful tools for tracking cells6-10 and studying protein dynamics11-14, respectively. During recent years, PCFPs have been expressed in different animal model, such as zebrafish6, chicken7,8 and mouse9,10 for cell fate tracking. Here we report a protocol for cell-specific photoconversion of PCFPs in the living zebrafish embryo and further tracking of photoconverted proteins at later developmental stages. This methodology allows studying, in a tissue-specific manner, cell biological events underlying morphogenesis in the zebrafish animal model.

Here, we present a method for the photoactivated switch of photoconvertible fluorescent proteins (PCFPs) in the living zebrafish embryo and further tracking of photoconverted protein at specific time points during development. This methodology allows monitoring of cell biological events underlying different developmental processes in a live vertebrate organism.

تتبع الخلية عن طريق البروتينات Photoconvertible خلال التنمية اسماك الزرد

Embryogenesis is a dynamic process that is best studied by using techniques that allow the documentation of developmental changes in vivo. The use of ...

The Tomato/GFP-FLP/FRT Method for Live Imaging of Mosaic Adult Drosophila Photoreceptor Cells

The Drosophila eye is widely used as a model for studies of development and neuronal degeneration. With the powerful mitotic recombination technique, elegant genetic screens based on clonal analysis have led to the identification of signaling pathways involved in eye development and photoreceptor (PR) differentiation at larval stages. We describe here the Tomato/GFP-FLP/FRT method, which can be used for rapid clonal analysis in the eye of living adult Drosophila. Fluorescent photoreceptor cells are imaged with the cornea neutralization technique, on retinas with mosaic clones generated by flipase-mediated recombination. This method has several major advantages over classical histological sectioning of the retina: it can be used for high-throughput screening and has proved an effective method for identifying the factors regulating PR survival and function. It can be used for kinetic analyses of PR degeneration in the same living animal over several weeks, to demonstrate the requirement for specific genes for PR survival or function in the adult fly. This method is also useful for addressing cell autonomy issues in developmental mutants, such as those in which the establishment of planar cell polarity is affected.

The Tomato/GFP-FLP/FRT Method for Live Imaging of Mosaic Adult Drosophila Photoreceptor Cells

The Tomato/GFP-FLP/FRT method involves visualizing mosaic photoreceptor cells in living Drosophila. It can be used to follow individual photoreceptor cell fates in the retina for days or weeks. This method is ideal for studies of retinal degeneration and neurodegenerative diseases or photoreceptor cell development.

والطماطم / GFP-FLP / FRT الطريقة للتصوير لايف من الفسيفساء الكبار<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; خلايا مستقبلة للضوء

The Drosophila eye is widely used as a model  for studies of development and neuronal degeneration. With the powerful mitotic  recombination technique, ...

A Guide to Modern Quantitative Fluorescent Western Blotting with Troubleshooting Strategies

The late 1970s saw the first publicly reported use of the western blot, a technique for assessing the presence and relative abundance of specific proteins within complex biological samples. Since then, western blotting methodology has become a common component of the molecular biologists experimental repertoire. A cursory search of PubMed using the term &#8220;western blot&#8221; suggests that in excess of two hundred and twenty thousand published manuscripts have made use of this technique by the year 2014. Importantly, the last ten years have seen technical imaging advances coupled with the development of sensitive fluorescent labels which have improved sensitivity and yielded even greater ranges of linear detection. The result is a now truly Quantifiable Fluorescence based Western Blot (QFWB) that allows biologists to carry out comparative expression analysis with greater sensitivity and accuracy than ever before. Many &#8220;optimized&#8221; western blotting methodologies exist and are utilized in different laboratories. These often prove difficult to implement due to the requirement of subtle but undocumented procedural amendments. This protocol provides a comprehensive description of an established and robust QFWB method, complete with troubleshooting strategies.

The advancement of western blotting using fluorescence has allowed detection of subtle changes in protein expression enabling quantitative analyses. Here we describe a robust methodology for detection of a range of proteins across a variety of species and tissue types. A strategy to overcome common technical problems is also provided.

دليل لمودرن الكمية نيون الغربية التنشيف مع استراتيجيات استكشاف الأخطاء وإصلاحها

The late 1970s saw the first publicly reported use of the western blot, a technique for assessing the presence and relative abundance of specific proteins ...

Assessment of Selective mRNA Translation in Mammalian Cells by Polysome Profiling

Regulation of protein synthesis represents a key control point in cellular response to stress. In particular, discreet RNA regulatory elements were shown to allow to selective translation of specific mRNAs, which typically encode for proteins required for a particular stress response. Identification of these mRNAs, as well as the characterization of regulatory mechanisms responsible for selective translation has been at the forefront of molecular biology for some time. Polysome profiling is a cornerstone method in these studies. The goal of polysome profiling is to capture mRNA translation by immobilizing actively translating ribosomes on different transcripts and separate the resulting polyribosomes by ultracentrifugation on a sucrose gradient, thus allowing for a distinction between highly translated transcripts and poorly translated ones. These can then be further characterized by traditional biochemical and molecular biology methods. Importantly, combining polysome profiling with high throughput genomic approaches allows for a large scale analysis of translational regulation.

The ability of cells to adapt to stress is crucial for their survival. Regulation of mRNA translation is one such adaptation strategy, providing for rapid regulation of the proteome. Here, we provide a standardized polysome profiling protocol to identify specific mRNAs that are selectively translated under stress conditions.

تقييم الانتقائية مرنا الترجمة في خلايا الثدييات من قبل Polysome التنميط

Regulation of protein synthesis represents a key control point in cellular response to stress. In particular, discreet RNA regulatory elements were shown ...