This work was supported by grants BB/J016012/1 and BB/E007872/1 from the UK Biotechnology and Biological Sciences Research Council (BBSRC) to Gail Preston.

ملاحظة: إن اختيار ابتداء المواد ورقة وتوحيد شروط نمو النبات أمر بالغ الأهمية لأن هذه العوامل يمكن أن تؤثر بشكل كبير على نوعية وتقلب والعائد من AWF (الشكل 1). وتظهر المعلمات للنظر في الجدول 1 وتناقش بمزيد من التفصيل في المناقشة. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> المعلمة </td><td colspan="3"> التوحيد القياسي سبيل المثال </td></tr><tr><td></td><td> فاصيلوس الشائع </td><td> مغد قوطة </td><td> نبات الأرابيدوبسيس thaliana </td></tr><tr><td> نوع ورقة </td><td> الأوراق الحقيقية الأولى، وسعت بشكل كامل، وصحية </td><td> 2 الثانية والثالثة 3 أوراق بدءا من القاع، 4 أكبر منشورات اتخذت النشرة قمية لم تستخدم لاستخراج الممر الخلوي الغشائي </td><td> أوراق ريدة توسعت بشكل كامل </td></tr><tr><td> عمر النبات </td><td> 21 يوما </td><td> 7-9 أسابيع </tد&gt; <td> 7 أسابيع </td></tr><tr><td> الوقت من اليوم </td><td> منتصف فترة الخفيفة (00:00) </td><td> منتصف فترة الخفيفة (00:00) </td><td> منتصف فترة الخفيفة (00:00) </td></tr><tr><td> إضافة الماء </td><td> جميع النباتات تسقى جيدا 1 ساعة قبل الحصاد </td><td> جميع النباتات تسقى جيدا 1 ساعة قبل الحصاد </td><td> جميع النباتات تسقى جيدا 1 ساعة قبل الحصاد </td></tr><tr><td> ضوء </td><td> ضوء 16 ساعة، و 400 ميكرومول م -2 ثانية -1 </td><td> ضوء 16 ساعة، و 400 ميكرومول م -2 ثانية -1 </td><td> 10 ساعة ضوء (يوم قصير) من الأسبوع 2، 400 ميكرومول م -2 ثانية -1 </td></tr><tr><td> رطوبة </td><td> 70٪ </td><td> 70٪ </td><td> 70٪ </td></tr><tr><td> درجة الحرارة </td><td> 22 ° C ضوء، 18 ° C الظلام </td><td> 22 ° C ضوء، 18 ° C الظلام </td><td> 21 ° C </td></tr></tbody></table> الجدول 1. أمثلة parame موحدالنسب للأوراق المستخدمة في الاستخراج AWF. 1. توليد الممر الخلوي الغشائي غسل السائل ملاحظة: خلال هذا البروتوكول materila الخطرة السمن مسببات الأمراض الجرثومية من الأوراق المصابة لا ينبغي غسلها هباء. وينبغي استخدام إجراءات التخلص السليم نوعا ما. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اختيار جهاز استنادا إلى حجم ورقة: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التسلل أوراق صغيرة (على سبيل المثال، نبات الأرابيدوبسيس، الفول) باستخدام حقنة needleless. استخدام قارورة فراغ التسلل الأوراق التي تكون كبيرة جدا لاحتوائه في حقنة. استخدام الأسلوب قارورة فراغ التسلل أوراق متعددة في نفس الوقت. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تقسيم الأوراق التي تكون كبيرة جدا بالنسبة للطريقة تسلل المتاحة إلى أقسام أصغر باستخدام شفرة حلاقة. أقسام رقة بدقة شطف قطع في الماء المقطر قبل تسلل لإزالة الملوثات حشوية أن تحلب من الخلايا التالفة. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ورقة تسلل باستخدام حقنة 60 مل: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فصل ورقة منمصنع في سويقات باستخدام شفرة حلاقة. للأوراق مركب مثل الطماطم، وفصل منشورات في petiolule. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شطف ورقة رفعه حديثا من قبل الغطس في الماء المقطر لإزالة الملوثات سطح الورقة. تجفيف أوراق من قبل النشاف بلطف مع الأنسجة الماصة أو ورقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قياس الوزن ورقة قبل التسلل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ولفة بعناية و/ أو أضعاف ورقة في حقنة 60 مل وملء المحاقن مع الماء المقطر (يمكن استخدام سوائل تسلل أخرى، انظر المناقشة). إخراج أي الهواء داخل الحقنة في حين خفض المكبس إلى ما يقرب من علامة 40 مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغطية طرف الحقنة إما مع إصبع القفاز أو قطعة من بارافيلم، ثم خلق ضغط سلبي داخل حقنة عن طريق سحب المكبس إلى الخارج إلى علامة 60 مل. الافراج عن ببطء الغطاس. ملاحظة: الافراج بسرعة الضغط قد يؤدي إلى تحلل الخلايا وتلوث حشوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> افصل طرف الحقنة وإخراج أي هواء، ثم replug طرف والصحافةمزيد من أسفل على المكبس لخلق قدرا متواضعا من ضغط إيجابي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر الخطوات من 1.2.5 - 1.2.6 حتى يتم تسلل ورقة تماما، كما يراها لون مظلمة من المناطق تسلل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة ورقة من الحقنة. بلطف ولكن بدقة صمة عار على ورقة مع ورقة ماصة لإزالة السائل السطح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قياس وزن ورقة مخترقة. حساب الفرق في الوزن قبل وبعد التسلل الذي يقترب عن كثب حجم التسلل. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ورقة تسلل قارورة فراغ: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فصل ورقة من نبات في سويقات باستخدام شفرة حلاقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شطف ورقة رفعه حديثا من قبل الغطس في الماء المقطر لإزالة الملوثات سطح الورقة. تجفيف أوراق من قبل النشاف بلطف مع ورقة ماصة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قياس الوزن ورقة قبل التسلل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع ورقة (أو يترك إذا التسلل أوراق متعددة) في 250 مل أو أكبر الجانب الذراع القارورة التعاونntaining الماء المقطر (يمكن استخدام سوائل تسلل أخرى، انظر مناقشة). تغطية كامل الأوراق مع السائل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطبيق فراغ إلى القارورة. تستنهض الهمم بلطف للافراج عن فقاعات الهواء من الأوراق. بعناية وببطء الافراج عن فراغ. ملاحظة: الافراج بسرعة الفراغ قد يؤدي إلى تحلل الخلايا وتلوث حشوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر الخطوة 1.3.5 حتى ورقة وتسلل بالكامل، كما يراها لون مظلمة من المناطق تسلل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة ورقة من القارورة. بلطف ولكن بدقة صمة عار على ورقة مع ورقة ماصة لإزالة السائل السطح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قياس وزن ورقة مخترقة. حساب الفرق في الوزن قبل وبعد التسلل الذي يقترب عن كثب حجم التسلل. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> انتعاش AWF بواسطة الطرد المركزي: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع ورقة على قطعة من 4 بوصة (10 سم) بارافيلم واسعة. باستخدام ماصة غيض 5 مل (أو كائن مماثل الحجم)،نشمر عن ورقة داخل بارافيلم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أدخل طوى ورقة ماصة مع طرف في حقنة 20 مل. ضع أي حواف قطع ورقة التي تواجه صعودا. إدراج الحقنة في نظيفة 50 مل البولي إثيلين أو البولي أنبوب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي لحقنة داخل الأنبوب لمدة 10 دقيقة في 1،000 x ج في يتأرجح دلو الدوار عند 4 درجات مئوية. ملاحظة: الفحص البصري للأوراق التالية الطرد المركزي يجب أن تكشف أن غالبية السائل تسلل تم طرد. وتشير البقع الخضراء الداكنة التي لزم وقت إضافي الطرد المركزي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ماصة AWF تعافى إلى الطازج 1.5 مل أنابيب. ملاحظة: حجم AWF يجب أن يتطابق تقريبا حجم تسلل لذلك ورقة. وإذا كان حجم هو أقل ثم الوقت الإضافي الطرد المركزي أو مطلوب سرعة الطرد المركزي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي العينات AWF في 15،000 x ج لمدة 5 دقائق لإزالة أي خلايا أو الجسيمات. بدلا من ذلك، تمرير AWF من خلال مرشح 0.22 ميكرون إلى remoلقد الخلايا والجسيمات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ماصة وطاف في أنبوب جديد. الاحتفاظ بعينات على الجليد حتى التخزين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخزين العينات AWF في -80 ° C. </li></ol></li></ol> 2. فحوصات للحشوية التلوث <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحفاظ على عينات AWF على الجليد للحد من التفاعلات الإنزيمية (على سبيل المثال، التحلل البروتيني) وإجراء فحوصات مباشرة بعد خطوات الطرد المركزي كاملة. ملاحظة: للحصول على المقايسات الأيض، والعينات ويمكن تجميدها على الفور بعد استخراج وتخزينها في -80 درجة مئوية حتى الاستخدام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لنازعة مالات القياسي (مليون درهم) بروتوكول فحص يرى 15؛ استخدام خلاف ذلك المتاحة تجاريا مليون درهم طقم الفحص. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لنازعة القياسية الجلوكوز 6 فوسفات (G6PDH) بروتوكول فحص يرى 16؛ على خلاف ذلك استخدام المتاحة تجاريا G6PDH طقم الفحص. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لالكمي لنواتج الأيض السيتوبلازمية مثل الجلوكوز 6 فوسفات (G-6-P) استخدام GC-MS كما هو موضح في الخطوة 5 </stroنانوغرام&gt;. خلاف ذلك، استخدم أدوات المتاحة تجاريا للمقايسة المباشر للG-6-P. </li></ol> 3. حساب من الممر الخلوي الغشائي التخفيف عامل <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد مجلدين من السائل تسلل المستخدمة أعلاه في الخطوة 1.2.4 أو 1.3.4 (على سبيل المثال، الماء المقطر). إضافة مسحوق اللون القرمزي نيلي إلى حل واحد لتركيز النهائي من 50 ميكرومتر، لا تضيف شيئا إلى أخرى. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قياس الامتصاصية في 610 نانومتر (OD 610) من 200 ميكرولتر من الحل تسلل النيلي اللون القرمزي مع قارئ لوحة. تصحيح هذه القيمة من خلال طرح OD 610 من 200 ميكرولتر من حل التسلل دون نيلي اللون القرمزي. استبدال هذه القيمة تصحيح كما OD 610infiltrate في المعادلة أدناه. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أداء لا يقل عن ثلاث عمليات التسلل ورقة تكرار النحو الوارد أعلاه (الخطوة 1.2 أو 1.3) مع كل من حلول تسلل (مع وبدون النيلي اللون القرمزي). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد تسلل، صINSE الأوراق في الماء المقطر لإزالة أي المتبقية النيلي اللون القرمزي موجودة على الأسطح الخارجية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المضي قدما الطرد المركزي على النحو الوارد أعلاه (الخطوة 1.4). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد متوسط ​​OD 610 من 200 ميكرولتر من الاستخراج AWF النيلي اللون القرمزي. تصحيح هذه القيمة من خلال طرح متوسط ​​OD 610 قيمة 200 ميكرولتر من النيلي اللون القرمزي الحرة AWF. استبدال هذه القيمة تصحيح كما OD 610AWF في المعادلة أدناه. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حساب عامل التخفيف (أي أضعاف التخفيف) من القيم الامتصاصية تصحيح النحو التالي: الممر الخلوي الغشائي تخفيف عامل = OD 610infiltrate / (OD 610infiltrate - OD 610AWF) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تركيز أو نشاط القيم من ضرب AWF من قبل عامل تخفيف لتقدير تركيز / النشاط في السائل apoplastic في بلانتا. </li></ol> 4. تركيز AWF إلى كامل قوتها قبل تجميد التجفيف <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدوره على تجميد أكثر جفافا وllow ذلك لتحقيق الاستقرار في درجة حرارة والضغط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجميع المبلغ المطلوب من عينات AWF جديدة أو تخزينها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> توزيع العينات بالتساوي بين 2 مل أنابيب الطرد المركزي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد حجم إعادة: حجم إعادة = حجم قبل التجميد والتجفيف / الممر الخلوي الغشائي عامل التخفيف </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مع الأغطية مغلقة، وتجميد الأنابيب في النيتروجين السائل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل أنابيب المجمدة إلى واحد أو أكثر المبردة السفن التجميد والتجفيف. في حين نقل الأنابيب، واستبدال الغطاء مع واحد الذي تم اخترقت بآلة حادة للسماح تبادل الغازات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إرفاق السفن إلى تجميد أكثر جفافا ويجفد العينات تماما. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة عينات من الجهاز وإعادة تشكيل AWF عن طريق إضافة كمية محسوبة من الماء المقطر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استبدال غطاء unpierced وتخزين العينات في -80 ° C. </li></ol> 5. تحليل المستقلب بواسطة اللوني للغاز الطيف الكتلي 17 &lt;رأ&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> ماصة 200 ميكرولتر من AWF في أنبوب 1.5 مل </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 700 ميكرولتر من الميثانول تحتوي على 10 ميكروغرام / مل ريبيتول كمعيار داخلي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحرارة على 70 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي لمدة 10 دقيقة في 11،000 ز س. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل 700 ميكرولتر من طاف لأنبوب 1.5 مل الطازجة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 375 ميكرولتر من كلوروفورم البارد ودوامة لمدة 10 ثانية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 500 ميكرولتر من درهم 2 O ودوامة لمدة 10 ثانية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي لمدة 15 دقيقة في 2،200 ز س. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل 150 ميكرولتر من الطبقة المائية العليا في أنبوب جديد 1.5 مل، ثم تجفيف العينات تماما في المكثف فراغ دون الحرارة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حل عينات في 30 ميكرولتر من البيريدين تحتوي على 20 ملغ / مل هيدروكلوريد methoxyamine. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان عند 70 درجة مئوية في حين تهتز بقوة لمدة 2 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 50 ميكرولتر من MSTFA (N-ميثيل-N- (trimethylsilyl) trifluoroacetamide). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان عند 37 درجة مئوية في حين تهتز لمدة 30 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عينات نقل إلى GC-MS شركاتقوارير الزجاج atible. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتحليل GC-MS من العينات. الرجوع إلى يزيك وآخرون 2009 17، للاطلاع على تفاصيل GC-MS إعداد المعدات والأداء. </li></ol>

<ol>
	<li>Felle, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoplastic+pH+during+low-oxygen+stress+in+barley.">Apoplastic pH during low-oxygen stress in barley.</a> Annals of Botany. 98 (5), 1085-1093 (2006).</li><li>Schaarschmidt, S., Kopka, J., Ludwig-M&#252;ller, J., Hause, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+arbuscular+mycorrhization+by+apoplastic+invertases:+enhanced+invertase+activity+in+the+leaf+apoplast+affects+the+symbiotic+interaction.">Regulation of arbuscular mycorrhization by apoplastic invertases: enhanced invertase activity in the leaf apoplast affects the symbiotic interaction.</a> The Plant Journal. 51 (3), 390-405 (2007).</li><li>Outlaw, W. H., De Vlieghere-He, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transpiration+rate.+An+important+factor+controlling+the+sucrose+content+of+the+guard+cell+apoplast+of+broad+bean.">Transpiration rate. An important factor controlling the sucrose content of the guard cell apoplast of broad bean.</a> Plant Physiology. 126 (4), 1716-1724 (2001).</li><li>Rico, A., Jones, R., Preston, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptation+to+the+plant+apoplast+by+plant+pathogenic+bacteria.">Adaptation to the plant apoplast by plant pathogenic bacteria.</a> Plant Pathogenic Bacteria. , 63-89 (2009).</li><li>Rico, A., Preston, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas+syringae+pv.+tomato+DC3000+uses+constitutive+and+apoplast-induced+nutrient+assimilation+pathways+to+catabolize+nutrients+that+are+abundant+in+the+tomato+apoplast.">Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 uses constitutive and apoplast-induced nutrient assimilation pathways to catabolize nutrients that are abundant in the tomato apoplast.</a> Molecular Plant-Microbe Interactions. 21 (2), 269-282 (2008).</li><li>Solomon, P., Tan, K., Oliver, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nutrient+supply+of+pathogenic+fungi;+a+fertile+field+for+study.">The nutrient supply of pathogenic fungi; a fertile field for study.</a> Molecular Plant Pathology. 4, 203-210 (2003).</li><li>Brunner, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+immunity+in+plants+and+animals:+emerging+parallels+between+the+recognition+of+general+elicitors+and+pathogen-associated+molecular+patterns.">Innate immunity in plants and animals: emerging parallels between the recognition of general elicitors and pathogen-associated molecular patterns.</a> Current Opinion in Plant Biology. 5 (4), 318-324 (2002).</li><li>Fontaniella, B., Vicente, C., Armas, R., Legaz, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+leaf+scald+(Xanthomonas+albilineans)+on+polyamine+and+phenolic+acid+metabolism+of+two+sugarcane+cultivars.">Effect of leaf scald (Xanthomonas albilineans) on polyamine and phenolic acid metabolism of two sugarcane cultivars.</a> European Journal of Plant Pathology. 119 (4), 401-409 (2007).</li><li>Mill&#225;n, A. F., Morales, F., Abad&#237;a, A., Abad&#237;a, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+iron+deficiency+on+the+composition+of+the+leaf+apoplastic+fluid+and+xylem+sap+in+sugar+beet.+Implications+for+iron+and+carbon+transport.">Effects of iron deficiency on the composition of the leaf apoplastic fluid and xylem sap in sugar beet. Implications for iron and carbon transport.</a> Plant Physiology. 124 (2), 873-884 (2000).</li><li>Dragi&#353;i&#263; Maksimovi&#263;, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Filter+strip+as+a+method+of+choice+for+apoplastic+fluid+extraction+from+maize+roots.">Filter strip as a method of choice for apoplastic fluid extraction from maize roots.</a> Plant Science. 223 (1), 49-58 (2014).</li><li>Baker, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+internal+standard+technique+for+improved+quantitative+analysis+of+apoplastic+metabolites+in+tomato+leaves.">An internal standard technique for improved quantitative analysis of apoplastic metabolites in tomato leaves.</a> Physiological and Molecular Plant Pathology. 78, 31-37 (2012).</li><li>Nouchi, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overcoming+the+difficulties+in+collecting+apoplastic+fluid+from+rice+leaves+by+the+infiltration-centrifugation+method.">Overcoming the difficulties in collecting apoplastic fluid from rice leaves by the infiltration-centrifugation method.</a> Plant &amp; Cell Physiology. 53 (9), 1659-1668 (2012).</li><li>Boudart, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+wall+proteins+in+apoplastic+fluids+of+Arabidopsis+thaliana+rosettes:+identification+by+mass+spectrometry+and+bioinformatics.">Cell wall proteins in apoplastic fluids of Arabidopsis thaliana rosettes: identification by mass spectrometry and bioinformatics.</a> Proteomics. 5 (1), 212-221 (2005).</li><li>Lohaus, G., Pennewiss, K., Sattelmacher, B., Hussmann, M., Hermann Muehling, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+the+infiltration-centrifugation+technique+appropriate+for+the+isolation+of+apoplastic+fluid?+A+critical+evaluation+with+different+plant+species.">Is the infiltration-centrifugation technique appropriate for the isolation of apoplastic fluid? A critical evaluation with different plant species.</a> Physiologia Plantarum. 111 (4), 457-465 (2001).</li><li>Bergmeyer, H. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Malate+Dehydrogenase.">Malate Dehydrogenase.</a> Methods of Enzymatic Analysis. 2, 614 (1974).</li><li>Lohr, G. W., Waller, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucose-6-phosphate+Dehydrogenase.">Glucose-6-phosphate Dehydrogenase.</a> Methods of Enzymatic Analysis. 2, 636-643 (1974).</li><li>Lisec, J., Schauer, N., Kopka, J., Willmitzer, L., Fernie, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gas+chromatography+mass+spectrometry-based+metabolite+profiling+in+plants.">Gas chromatography mass spectrometry-based metabolite profiling in plants.</a> Nature Protocols. 1 (1), 387-396 (2006).</li><li>Li, Z. C., McClure, J. W., Hagerman, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Soluble+and+bound+apoplastic+activity+for+peroxidase,+beta-d-glucosidase,+malate+dehydrogenase,+and+nonspecific+arylesterase,+in+barley+(Hordeum+vulgare+L.)+and+oat+(Avena+sativa+L.)+primary+leaves.">Soluble and bound apoplastic activity for peroxidase, beta-d-glucosidase, malate dehydrogenase, and nonspecific arylesterase, in barley (Hordeum vulgare L.) and oat (Avena sativa L.) primary leaves.</a> Plant Physiology. 90 (1), 185-190 (1989).</li><li>Dani, V., Simon, W. J., Duranti, M., Croy, R. R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+the+tobacco+leaf+apoplast+proteome+in+response+to+salt+stress.">Changes in the tobacco leaf apoplast proteome in response to salt stress.</a> Proteomics. 5 (3), 737-745 (2005).</li><li>Shabab, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fungal+effector+protein+AVR2+targets+diversifying+defense-related+Cys+proteases+of+tomato.">Fungal effector protein AVR2 targets diversifying defense-related Cys proteases of tomato.</a> Plant Cell. 20 (4), 1169-1183 (2008).</li><li>Cosgrove, D. J., Cleland, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solutes+in+the+free+space+of+growing+stem+tissues.">Solutes in the free space of growing stem tissues.</a> Plant Physiology. 72 (2), 326-331 (1983).</li><li>Husted, S., Schjoerring, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoplastic+pH+and+ammonium+concentration+in+leaves+of+Brassica+napus.">Apoplastic pH and ammonium concentration in leaves of Brassica napus.</a> L. Plant Physiology. 109 (4), 1453-1460 (1995).</li><li>Kettle, A. J., Clark, B. M., Winterbourn, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superoxide+converts+indigo+carmine+to+isatin+sulfonic+acid.">Superoxide converts indigo carmine to isatin sulfonic acid.</a> The Journal of Biological Chemistry. 279 (18), 18521-18525 (2004).</li><li>Bournonville, C. F. G., D&#237;az-Ricci, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+determination+of+superoxide+in+plant+leaves+using+a+modified+NBT+staining+method.">Quantitative determination of superoxide in plant leaves using a modified NBT staining method.</a> Phytochemical Analysis. 22 (3), 268-271 (2011).</li><li>Speer, M., Kaiser, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ion+relations+of+symplastic+and+apoplastic+space+in+leaves+from+Spinacia+oleracea+L.+and+Pisum+sativum+L.+under+salinity.">Ion relations of symplastic and apoplastic space in leaves from Spinacia oleracea L. and Pisum sativum L. under salinity.</a> Plant Physiology. 97 (3), 990-997 (1991).</li></ol>

No conflicts of interest declared.

الاستفادة المثلى من مصدر الأنسجة النباتية الاختلاف البيولوجي والتقني يمكن أن تكون كبيرة عند تنفيذ الممر الخلوي الغشائي الاستخراج، وبالتالي سير عمل موحد للغاية مفيد لزيادة الاستمرارية عبر التجارب (الشكل 1). الأهم من ذلك، مصدر الأنسجة النباتية يجب أن تكون موحدة، بما في ذلك نوع ورقة، ورقة السن، والنمو / الظروف البيئية والوقت من اليوم (الجدول 1). وتوجد اختلافات كبيرة في السهولة التي يتم تسلل أوراق مختلفة واستعاد AWF في وقت لاحق عن طريق الطرد المركزي. ترتبط هذه الاختلافات مع عدد الثغور، وحجم الفتحة والمقاومة ورقة 12،14. حتى بين أصناف مختلفة من P. الشائع هناك اختلافات كبيرة في سهولة والعائد من الإجراء استخراج AWF. على سبيل المثال أوراق متنوعة Tendergreen المستخدمة هنا هي أكثر قابلية لاستخراج AWF استخدام هذا الأسلوب من الصنف عجب الكندي. ضمنP. الشائع أول الأوراق الحقيقية هي أكبر وأسهل التسلل، مما يجعلها الخيار الواضح لإخراج apoplastic. وقد تبين الهواء والماء حجم apoplastic أن تختلف مع تقدم العمر ورقة في العديد من الأنواع مما يؤدي إلى اختلافات في AWF الاستخلاصية 12،14. في P. الشائع والأوراق القديمة أصبحت إلى حد كبير أكثر صعوبة للتسلل وتسفر أقل AWF على الطرد المركزي. لذا كانت تحصد أوراق عندما وصلوا التوسع الكامل. أوراق التي يصعب التسلل لاحقا تتطلب سرعات أعلى الطرد المركزي لاسترداد AWF. لذا ينبغي للمرء أن الشاشة بعناية عدة أنواع أوراق مختلفة وأصناف قبل البت مصدر الأنسجة لإخراج AWF نطاق واسع. يجب أيضا الظروف نمو النبات تكون موحدة قدر الإمكان في سياق التجربة. استخدام خزانات النمو هو الأفضل لأنها تسمح الرطوبة ثابتة ودرجة الحرارة ومن lighأفواج ر كثافة ليتم المحافظة عليها. حصاد الأوراق يجب أن يحدث دائما في نفس الوقت من اليوم لأن تركيزات الأيض، والإنزيمات، الخ تختلف في جميع أنحاء دورة نهاري 14. وأخيرا، لضمان أن أوراق النبات جميعا ضغط الامتلاء مماثل، يجب أن تسقى النباتات قريبا من قبل (~ 1 ساعة) الحصاد. تعظيم الاستفادة من تسلل ورقة والطرد المركزي سوف تلوث هيولي غير مرغوب فيه من AWF بسبب تحلل الخلية الجزئي يؤدي إذا كان الضغط الميكانيكي من قبل خلايا اجه مرتفع جدا خلال تسلل أو الطرد المركزي الخطوات. ولذلك، ينبغي أن يكون الإجراء لنوع ورقة تعطى الأمثل مفاضلة بين تعظيم العائد وتقليل التلوث حشوية من AWF. في جميع الحالات، ينبغي للمرء أن استخدام أقل سرعة الطرد المركزي التي AWF يمكن استردادها لتجنب تعطل ميكانيكي ممكن من خلايا ورقة. تعظيم الاستفادة من centrifuوينبغي تحديد سرعة gation تجريبيا لكل نوع ورقة من خلال رصد حجم تعافى والممر الخلوي الغشائي التلوث على نطاق السرعات الطرد المركزي. وقد لوحظ أن الأنشطة انزيم علامة، مثل مليون درهم، G6PDH ومصاوغة الجلوكوز فوسفات، تظل منخفضة حتى يتم تجاوز عتبة قوة الطرد المركزي، أعلاه والتي تزيد من هذه الأنشطة بشكل سريع، ويفترض بسبب تسرب حشوية 9،12،14. استخدام بارافيلم للحصول على الدعم خلال خطوة الطرد المركزي، كما لاحظ بيكر وآخرون 2012 11، ويمكن تحسين كفاءة الاستخراج AWF وربما تقليل الأضرار الميكانيكية إلى ورقة شفرة الناجمة عن لطي المفرط والضغط. وعلاوة على ذلك، فإن استخدام بارافيلم يحسن التصور من ورقة بعد الطرد المركزي عند ينبغي للمرء أن دراسة ورقة عن الضرر واكتمال استخراج AWF. Nouchi 12 وصف تعظيم الاستفادة من الانتعاش AWF من أقسام ورقة الأرز قطع، والتي هي دifficult التسلل وتتطلب سرعات أعلى الطرد المركزي لجمع AWF بسبب فتحات الثغور الصغيرة الخاصة بهم. تحسن ترطيب سطح ورقة الأرز، إما عن طريق PRESOAKING الأوراق في الماء المقطر أو إضافة السطحي إلى السائل تسلل، سهلت عملية تسلل. وأعلى سرعة الطرد المركزي (6،000 x ج) كان يستخدم أيضا في حين رصد تلوث apoplastic 12. عند استخدام أقسام قطع ورقة هناك دائما خطر أن التلوث حشوية سيكون أكثر انتشارا حتى مع الغسيل واسعة من المواقع الجرح. ولذلك ينبغي أن تستخدم قطع الأوراق عند الضرورة فقط. بالنسبة للعديد من الدراسات ويستخدم الماء المقطر كما السائل تسلل 11. ومع ذلك، يمكن إضافة مركبات إلى السائل تسلل، مثل الأملاح أو مخازن، من أجل تحسين استخلاص مركبات apoplastic معينة، وخاصة البروتينات 13. Lohaus 14 تقييم تأثير القوة الأيونية والتناضحي سن تكوين AWF تعافى وجدت لها أن تكون ضئيلة. التغيرات في الرقم الهيدروجيني للتسلل المتوسطة، ومع ذلك، قد تؤثر على تكوين AWF 14. التعامل السليم وتخزين السائل المستخرج apoplastic هو المهم. وقد تبين AWF لاحتواء وفرة من البروتياز والإنزيمات الأخرى 13،20، وكذلك المركبات العضوية المتطايرة. لذلك، للحد من تغييرات على تركيبة AWF بعد الشفاء من المستحسن الاحتفاظ بعينات على الجليد أو تخزينها على خلاف ذلك في -80 ° C. وعلاوة على ذلك، ينبغي إجراء فحوصات الأنزيمية من AWF في أقرب وقت ممكن بعد استخراج للحد من تعطيل انزيم بسبب التحلل البروتيني، تخفيف لفترات طويلة أو تجميد لاذابة. عملية تسلل يخفف السائل apoplastic وغالبا ما يكون من الضروري تحديد مدى هذا التخفيف. يجوز للخطوة الطرد المركزي أيضا يخفف من AWF مع المياه من المقصورات داخل الخلايا. وتحتاج عامل التخفيفإد تقدير في الجسم الحي التركيزات الكيميائية الممر الخلوي الغشائي عند إجراء القياسات على AWF. وهناك حاجة إلى عامل التخفيف أيضا على التركيز AWF إلى كامل قوتها عندما يتم استخدامها باعتبارها الممر الخلوي الغشائي محاكاة النمو المتوسطة للميكروبات - وبالتالي مطابقة في تركيزات المستقلب الجسم الحي بأكبر قدر ممكن. وتوجد العديد من الاختلافات في الطريقة الموضحة في الخطوة 4 لتحديد عامل التخفيف AWF عن طريق قياس التخفيف من مركب علامة تضاف إلى السائل التسلل. لجميع وسائل يفترض حساب التخفيف AWF أن السائل تسلل لا يمتص بشكل ملحوظ أو تخفيفه من قبل خلايا ورقة أثناء عملية الاسترداد AWF. هذا الافتراض تم التحقق سابقا للخطوة تسلل 14 ولكن غير مؤكدة للخطوة الطرد المركزي. أيضا يجب أن لا يتم امتصاص المركب علامة، نقل أو تعديل في حين أنه في الممر الخلوي الغشائي. هو يستخدم على نطاق واسع نيلي اللون القرمزي واختبارها بدقة من الأصباغ المستخدمةلإجراء العمليات الحسابية تخفيف AWF. يعرض نيلي اللون القرمزي على الامتصاصية منخفض لراتنج تبادل الأيونات الموجبة وجدران الخلايا المعزولة وأظهرت لتكون مناسبة لإجراء العمليات الحسابية AWF في الكرنب napus، Pisum بيسوم، مغد قوطة وماكس جليكاين 11،21،22. ومع ذلك، في بعض أنواع نبات، على سبيل المثال، والأرز، والخيار، والنيلي اللون القرمزي يبدو لا يمكن استردادها بالكامل بعد تسلل، التي من شأنها أن تؤدي إلى التقليل من التخفيف عامل AWF 12،21. عدم وجود انتعاش النيلي اللون القرمزي قد يكون راجعا إلى قابليته للانشقاق إلى سلفونات إيزاتين التي كتبها الفائق 23، والذي يعرف إلى أن يتم إنتاجها في الممر الخلوي الغشائي، خصوصا في ظل التوتر 24. سوف انشقاق النيلي اللون القرمزي إلى سلفونات إيزاتين يؤدي إلى فقدان الامتصاصية في 610 نانومتر وزيادة في 245 نانومتر. ما إذا كان يحدث هذا التفاعل إلى حد ملموس في الممر الخلوي الغشائي، أو ما إذا كان هذا رد فعل يمكن مستعمل بإضافة الزبالين الفائق لinfiltratلم يتم التحقيق السائل أيون حتى الآن. وقد استخدم اللون الأزرق ديكستران بدلا من النيلي اللون القرمزي لالكمي لعامل التخفيف AWF في الأرز يترك 12، على الرغم من استقرارها والانتعاش في AWF لم يتم الإبلاغ عنها. بدلا من ذلك، المركبات radiolabelled مثل [14 C] السوربيتول أو معايير قابلة للقياس الكمي الداخلية الأخرى يمكن استخدامها بدلا من الأصباغ وانخفاض في النشاط الإشعاعي أو تركيز قياس والمستخدمة لحساب عامل التخفيف بطريقة مماثلة 11،14،25. القيود المفروضة على تقنية وتوجد هناك بعض المحاذير للتسلل الطرد المركزي طريقة AWF العزلة. أولا، التخفيف من الممر الخلوي الغشائي خلال تسلل قد تثير ردا من النبات. إذا كانت الخلايا المحيطة بها ورقة كشف تركيز تقلص لمكونات معينة من السوائل apoplastic، فإنها قد الاستجابة من قبل التغوط المزيد من نواتج الأيض، أو تحريف تفسير تركيزات المستقلب. فيتقييم لهذه المشكلة لوحظ أن أيا من الوقت بين عمليات التسلل والطرد المركزي ولا الخلافات المعتدلة في القوة الأيونية من السائل تسلل أثرت على تكوين AWF استخراج 14،22. ولذلك، أي القطع الأثرية الناتجة عن الممر الخلوي الغشائي ويعتقد أن التخفيف ليكون ضئيلا للغاية. والعيب المحتمل الثاني هو أن شطف من AWF بواسطة الطرد المركزي لا يعبر عن الجزيئات الموجودة في الممر الخلوي الغشائي لعدة أسباب. بعض المركبات، في الكاتيونات والبروتينات معينة قد تكون مرتبطة بشكل وثيق مع جدار الخلية سالبة الشحنة وليس أزل مع AWF 13. الجزيئات الأخرى مثل البروتينات قد تكون كبيرة جدا لأزل بكفاءة من الممر الخلوي الغشائي في سرعات الطرد المركزي المستخدمة 14. أنواع الاكسجين التفاعلية هي فئة هامة من مجمع المنتجة في الممر الخلوي الغشائي، ولكن نظرا لطبيعة قصيرة الأجل من هذه المركبات، ومتطلبات غير محددة لإنتاجها، والعلاقات العامة الخاصة بهمesence لا يتم التقاطها بشكل جيد من قبل استخراج AWF. ومن غير المعروف ما مدى دقة يمثل AWF تكوين في الجسم الحي من السائل الممر الخلوي الغشائي وهذا قد تختلف بين الأنواع. وتوجد عدة فحوصات لتحديد التلوث حشوية، رغم أن أيا مقبولة عالميا. فحوصات الإنزيمات في الغالب حشوية (على سبيل المثال، G6PDH، مصاوغة هيكسوز الفوسفات، مليون درهم) لديها مصلحة كونها سهلة لأداء ولكن قد لا يتماشى بشكل جيد مع تسرب حشوية 14،18. تقييم نواتج الأيض حشوية (على سبيل المثال، والفوسفات هيكسوز، الكلوروفيل) هو ربما يكون أكثر دلالة ولكن أقل راسخة 11. ومع ذلك، أي نوع من الفحص يمكن أن تكون مفيدة لتقدير النسبي للتلوث apoplastic بين العينات. من الناحية المثالية، ينبغي أن تستخدم قياسات مستقلة متعددة للتحقق من صحة سلامة العينة AWF. مع الاعتراف حدوده، تسلل-centrifugatiعلى تقنية الموضحة هنا لا تزال تقنية بسيطة وقوية في دراسة البروتينات apoplastic، مستقلبات الابتدائية والثانوية والأيونات غير العضوية.

<html> في الممر الخلوي الغشائي المصنع هو الفضاء بين الخلايا التي تحيط الخلايا النباتية. هذا هو بيئة ديناميكية فيه العديد من عمليات الأيض والنقل تحدث. العنصر الهيكلي الرئيسي للالممر الخلوي الغشائي هو جدار الخلية، والتي يتم تجميعها وتعديلها من قبل الإنزيمات والبروتينات الهيكلية ونواتج الأيض التي تقع داخل الممر الخلوي الغشائي. في الخلايا النباتية صحية يتم الحفاظ على الممر الخلوي الغشائي عموما في حالة حمضية مما يسمح الأحماض الأمينية والسكريات والمواد المغذية الأخرى التي سيتم استيرادها من الممر الخلوي الغشائي إلى السيتوبلازم التي كتبها H + symport 1. أثناء النقل السكروز، والتحركات السكروز من مصادر الضوئي من خلال الممر الخلوي الغشائي والأوعية الدموية في اللحاء. ثم يتم نقل السكروز قبل إمكانية التناضحي التي تحتفظ بها invertases apoplastic الشق السكروز في أجهزة الحوض 2. ويمكن أيضا نقل السكريات والمواد المغذية الأخرى صعودا وتتراكم في تجاويف فوهي من خلال مجرى النتح 3. &quot;&gt; والممر الخلوي الغشائي أيضا يمثل مكانة البيئية حيث تضع العديد من مسببات الأمراض الطفيلية نمط حياتهم. مسببات الأمراض النباتية البكتيرية لديها القدرة على مضاعفة لكثافة عالية في الممر الخلوي الغشائي، وهو ما الوصول إليها من خلال الفتحات الطبيعية مثل الثغور أو من خلال الجروح 4. إن تركيز الأمينية الأحماض والمركبات الآزوتية الأخرى في الطماطم الممر الخلوي الغشائي وقد ثبت أن تكون كافية لدعم الاحتياجات الغذائية من مسببات الأمراض البكتيرية والفطرية 5،6. الردود الدفاع الأولية نحو مسببات الأمراض الميكروبية كما يحدث في الممر الخلوي الغشائي، وهو إنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية التي بيروكسيديزات خارج الخلية . وoxidases وتعزيز جدار الخلية من خلال عبر ربط وcallose ترسب 7 جدار الخلية النباتية غنية في المركبات الثانوية مع الأنشطة المضادة للميكروبات، والطبيعة الكيميائية الحيوية لهذه المركبات الثانوية تختلف بين الأنواع 8. ونتيجة للذكر أعلاهالضعف الجنسي وغيرها من العمليات، ورقة السائل apoplastic يحتوي على مجموعة متنوعة من البروتينات والسكريات والأحماض العضوية والأحماض الأمينية والمركبات الثانوية، والمعادن والكاتيونات الأخرى (على سبيل المثال، والمغنيسيوم 2+، K +، الصوديوم، الكالسيوم 2+، الحديد 2/3 +). يتم التحكم تركيزات المذاب في الممر الخلوي الغشائي من يطلق النار إلى حد كبير على توازن عمليات النقل التي تحدث بين الممر الخلوي الغشائي والخشب، اللحاء والسيتوبلازم 9. ومع ذلك، التفاعلات الأيضية والنمو الميكروبي أيضا تستهلك أو تنتج المواد المذابة apoplastic. ومن المعروف أن تكوين الممر الخلوي الغشائي أن تختلف بين الأنواع النباتية والأنماط الجينية واستجابة لتغير الظروف البيئية بما في ذلك الضوء والتغذية والحيوية وغير الحيوية الضغوط 9. من خلال دراسة تكوين الممر الخلوي الغشائي وكيف يتغير، بما في ذلك خصائص مثل الأكسدة وإمكانات التناضحي، ودرجة الحموضة، المواد الغذائية / توافر الأيض والأنشطة الإنزيمية، يمكن للمرء الحصول على رؤى جديدة في كيفية إعادة النباتاتبشر تستجيب لبيئتها. فهم أو وصف التغيرات الجزيئية التي تحدث في حل الممر الخلوي الغشائي معقد لأنه حجرة منظم مكانيا والديناميكية التي الأيض و / أو أيونات قد تكون متقلبة، عابرة أو يرتبط مع جدار الخلية وغشاء البلازما. وعلاوة على ذلك، يطلب من التقنيات التحليلية المختلفة لتغطية واسعة من أنواع كيميائية مختلفة. لدراسة تكوين الممر الخلوي الغشائي للذوبان، والسوائل يحتاج عادة إلى استخلاصها من الأنسجة. وتوجد عدة طرق لاستخراج الممر الخلوي الغشائي السوائل من الأنسجة المختلفة، بما في ذلك أسلوب شريط مرشح المقترحة حديثا 10، ولكن طريقة استخراج الأكثر رسوخا للأوراق هو تسلل الطرد المركزي. وقد تم تقييم هذه التقنية سابقا 11-13 وLohaus وآخرون 2001 14 توفير فحص شامل للعديد من المعايير الفنية طريقة ل. كما يدل الاسم، تسلل-centrifuتقنية gation هي طريقة من خطوتين التي ينطوي أساسا استبدال المجال الجوي apoplastic مع السائل تسلل مائي، والتي تختلط مع السائل apoplastic الأصلي، يليه انتعاش تسلل / apoplastic خليط السائل بواسطة الطرد المركزي لطيف من الأوراق. كما تضعف السائل تعافى ولا يحتوي على كافة المركبات الموجودة في الممر الخلوي الغشائي (أنظر أدناه)، وهذا السائل هو المعروف باسم الممر الخلوي الغشائي سائل الغسيل (AWF)، أو بين الخلايا أحيانا السائل غسل، بدلا من السائل apoplastic. تقنية تسلل الطرد المركزي هي قابلة للتطوير بسهولة تسمح عينات AWF واحدة أو مجمعة من حجم كاف لتوليد وتعرض لمجموعة واسعة من التقنيات الحيوية والتحليلية المصب (على سبيل المثال، الكهربي البروتين، وقياس نشاط انزيم، NMR، العديد من أنواع اللوني والكتلة الطيف). ورقة AWF مفيد أيضا باعتباره الممر الخلوي الغشائي محاكاة النمو المتوسطة لدراسة التفاعل بين النباتات استعمار الميكروبات الطرافةح بيئتهم 5. في البروتوكولات التالية وصفنا كيفية تنفيذ تقنية تسلل الطرد المركزي باستخدام فاصيلوس الشائع السيرة الذاتية. Tendergreen الأوراق، وتقديم بعض الأمثلة من التحليلات المصب مع التركيز على الايض. الأهم من ذلك، أساليب لتقييم وتقدم نوعية AWF جنبا إلى جنب مع تقديم المشورة لتحسين الإجراء لأنواع أوراق مختلفة.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="906">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:291px;">Company</td>
			<td style="width:139px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">Eppendorf Microcentrifuge Tubes</td>
			<td style="width:291px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:139px;">22364111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">razor blade</td>
			<td style="width:291px;">Fisher</td>
			<td>12-640&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">60 ml syringe</td>
			<td style="width:291px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:139px;">300865</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">20 ml syringe</td>
			<td style="width:291px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:139px;">300613</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">4 inch parafilm</td>
			<td style="width:291px;">Bemis</td>
			<td style="width:139px;">PM-996</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">side arm flask</td>
			<td>SciLabware</td>
			<td>12972831</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">vacuum source</td>
			<td style="width:291px;"></td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">5 ml pipette tips</td>
			<td style="width:291px;">Fisher</td>
			<td>50-813-28&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:309px;">centrifuge</td>
			<td style="width:291px;">Beckman Coulter</td>
			<td>392932</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">Swinging bucket rotor</td>
			<td style="width:291px;">Beckman Coulter</td>
			<td>369702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">indigo carmine</td>
			<td style="width:291px;">Sigma</td>
			<td style="width:139px;">I8130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">microplate reader</td>
			<td style="width:291px;">Tecan</td>
			<td style="width:139px;">Infinite 200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">96 well plates</td>
			<td style="width:291px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:139px;">353072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">freeze dryer</td>
			<td style="width:291px;">SciQuip</td>
			<td style="width:139px;">Christ Alpha 2-4 LD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">microcentrifuge</td>
			<td style="width:291px;">biorad</td>
			<td>166-0612EDU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">oxaloacetic acid</td>
			<td style="width:291px;">Sigma</td>
			<td>O4126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">D-glucose-6-phosphate</td>
			<td style="width:291px;">Sigma</td>
			<td>G7250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">NADH</td>
			<td style="width:291px;">Roche</td>
			<td>10128023001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">MDH assay kit</td>
			<td style="width:291px;">Biovision</td>
			<td>K654-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">G6PDH assay kit</td>
			<td style="width:291px;">Sigma</td>
			<td>MAK015-1KT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">G-6-P assay kit</td>
			<td style="width:291px;">Biovision</td>
			<td>K657-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">ribitol</td>
			<td style="width:291px;">Sigma</td>
			<td style="width:139px;">A5502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">methanol</td>
			<td style="width:291px;">Sigma</td>
			<td style="width:139px;">650471</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">chloroform</td>
			<td style="width:291px;">Sigma</td>
			<td style="width:139px;">472476</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">vacuum concentrator</td>
			<td style="width:291px;">Thermor Scientific</td>
			<td>SC250EXP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">methoxyamine hydrochloride</td>
			<td style="width:291px;">Sigma</td>
			<td style="width:139px;">226904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">N-Methyl-N-(trimethylsilyl) trifluoroacetamide</td>
			<td style="width:291px;">Sigma</td>
			<td style="width:139px;">394866</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the infiltration-centrifugation technique for extraction of apoplastic fluid from plant leaves using phaseolus vulgaris as an example

في الممر الخلوي الغشائي هو حجرة خارج الخلية متميزة في الأنسجة النباتية التي تقع خارج غشاء البلازما ويتضمن جدار الخلية. مقصورة apoplastic من أوراق النبات هو موقع العديد من العمليات البيولوجية الهامة، بما في ذلك تشكيل جدار الخلية، والمغذيات الخلوية وامتصاص الماء والتصدير، والتفاعلات محطة نابوت داخلي والاستجابات الدفاع لمسببات الأمراض. وراسخة طريقة تسلل الطرد المركزي كأسلوب قوية لتحليل تركيبة الممر الخلوي الغشائي للذوبان من الأنواع النباتية المختلفة. السائل التي حصلت عليها هذه الطريقة هو المعروف باسم الممر الخلوي الغشائي سائل الغسيل (AWF). يصف بروتوكول بعد تسلل الفراغ والطرد المركزي الطريقة الأمثل لAWF الاستخراج من فاصيلوس الشائع (الفول الفرنسي) السيرة الذاتية. Tendergreen الأوراق. وتناقش القيود المفروضة على هذه الطريقة وتعظيم الاستفادة من بروتوكول للأنواع النباتية الأخرى. المستردة AWF يمكن استخدامها في مجموعة واسعة من التجربه المصبTS التي تسعى لتوصيف تركيبة الممر الخلوي الغشائي وكيف أنه يختلف ردا على الأنواع النباتية وراثى والتنمية النباتية والظروف البيئية، أو لتحديد كيفية نمو الكائنات الحية الدقيقة في الممر الخلوي الغشائي السوائل والاستجابة للتغيرات في تكوينها.

النتائج نموذجية لإخراج AWF أجريت على صحي P. 3 اسبوع الشائع السيرة الذاتية. وتظهر Tendergreen الأوراق، وذلك باستخدام الماء المقطر كما السائل تسلل في الجدول 2. يونغ P. أوراق الشائع قابلة للتسلل، وفي سرعة الطرد المركزي المستخدمة هنا (1،000 x ج) إزالة غالبية السائل تسلل بواسطة الطرد المركزي يمكن أن ينظر إليه مباشرة كما يترك تعود إلى اللون الأخضر الأصلي. P. كان ورقة الشائع الوزن الطازج في المتوسط ​​1.1 x ج قبل التسلل وأسفرت عن 0.5 مل من AWF لكل غرام الوزن الطازج. تم تحديد تركيز البروتين من AWF لتكون 0.18 ± 0.08 ملغ / مل باستخدام معيار برادفورد فحص البروتين. عامل تخفيف لهذه الأوراق، وتحسب عن طريق قياس النيلي اللون القرمزي التخفيف، وكان 2.3 ± 0.3 أضعاف. يمكن أن القيم المذكورة أعلاه تختلف بشكل كبير بين الأنواع والتجارب الرائدة مطلوبة لتحديد العائد من AWF لكل غرام ورقة نحن طازجةآيت، فضلا عن تركيز البروتين AWF وعامل التخفيف التي يمكن توقعها لنوع نبات معين. يمكن أن تحدث ضررا على سلامة الخلايا سواء أثناء الخطوة تسلل، إذا كانت التغييرات في الضغط وسريعة جدا، وخلال خطوة الطرد المركزي إذا كانت قوة الطرد المركزي عالية جدا. ولذلك فمن الضروري لفحص عينات AWF لعلامات التلوث حشوية. من الناحية المثالية، يتم إجراء فحوصات مستقلة متعددة. هنا، يتم الإبلاغ عن النتائج من ثلاثة فحوصات المحتملة في الجدول 2. وفي الاستخراج أداء جيدا من P. الشائع AWF، كان G6PDH قابل للكشف بواسطة انزيم الفحص القياسية. وهذا يتفق مع تقارير أخرى حيث يصبح النشاط G6PDH كشفها فقط فوق عتبة قوة الطرد المركزي 12. في المقابل، كان مستوى خط الأساس من النشاط نازعة مالات (2.5 U / مل) كشف في كل P. عينات الشائع AWF باستخدام فحص التمثيل الغذائي العادي. زيادة الطرد المركزي لأدى م فوق عتبة 1،000 x ج في زيادة الأنشطة مليون درهم (النتائج لا تظهر). وكما هو معروف في الممر الخلوي الغشائي من الأنواع الأخرى لاحتواء النشاط مليون درهم الذاتية 18، ويعتبر مبلغ الكشف عن النشاط هنا apoplastic حقيقي وزيادات كبيرة فوق هذا المستوى خط الأساس تدل على التلوث. الأيضية التي يعتقد أن تكون في الغالب حشوية، مثل هيكسوز-6-فوسفات، ويمكن أيضا أن تستخدم لتقييم تلوث AWF. هنا، الكشف عن تحليل GC-MS صفر أو أثر مستويات G-6-P في الاستخراج AWF. على النقيض من ذلك، في أقسام الجذر قطع الذرة، G-6-P تم الكشف بعد استخراج AWF في جميع السرعات الطرد المركزي وزيادة في تركيز بسرعات أعلى، مشيرا إلى تلوث حشوية 10. تحليل الأيض التي كتبها GC-MS من P. الشائع ورقة AWF عادة ينتج 40 - 60 الأيض تحديدها وعدد متساو تقريبا من المركبات هويته (الشكل 2). أوالأحماض غانيتش، السكريات البسيطة، والأحماض الأمينية وتمثل الجزء الأكبر من نواتج الأيض يمكن تحديدها، ولكن، كما تم الكشف عن المستقلبات النباتية الثانوية وكميا من AWF 11. وصفت سبيل المثال عدة قمم من هذه الفئات جزيء مختلفة في الشكل 2 مزيد من التقنيات التحليلية المصب هي التي تنطبق على هذه العينات AWF لقياس الجزيئات المختلفة، على سبيل المثال: ICP-MS، NMR، HPLC، التحليل الطيفي للامتصاص الذري، والبروتين مطياف الكتلة. ويمثل عنصر البروتين من الممر الخلوي الغشائي أيضا في AWF كما هو مبين في Coomassie بريليانت الأزرق هلام الملون SDS-PAGE في الشكل (3). ومن بين الأدوار الأخرى، والإنزيمات apoplastic هي المسؤولة عن تركيب جدار الخلية وخلق خارج الخلية رد الفعل أنواع الاكسجين. وقد حددت الدراسات البروتين من AWF من مختلف الأنواع العشرات من البروتينات الفردية وأظهرت أن عنصر البروتين من الممر الخلوي الغشائي يستجيب لبيئىالإجهاد nmental 13،19. ومن الناحية المثالية ينبغي أن يكون استخراج AWF خالية من التلوث البروتينات السيتوبلازمية مثل Rubisco. ولكن في الواقع هذا من الصعب تحقيقه. وجود البروتين الفرقة Rubisco في ~ 53 كيلو دالتون التالية SDS-PAGE يوفر الفحص النوعي آخر لسلامة العينات AWF. على سبيل المثال، العينة التي تم تحميلها في حارة 2 في الشكل (3) تحتوي على كمية أكبر من التلوث Rubisco أن من حارة 1. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" class="jove_content" fo:keep-together.within-page="always" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td></td><td> فاصيلوس الشائع AWF </td></tr><tr><td> حجم AWF (مل ز -1 ورقة FW) </td><td> 0.49 ± 0.09 </td></tr><tr><td> اضرب البروتين. (ملغ مل -1) </td><td> 0.18 ± 0.08 </td></tr><tr><td> عامل التخفيف </td><td> 2.3 ± 0.3 </td></tr><tr><td> النشاط G6PDH (U مل -1) </td><td&gt; لا شيء الكشف </td></tr><tr><td> GLC-6-P (ملغ مل -1) </td><td> أيا الكشف عن </td></tr><tr><td> النشاط مليون درهم (U مل -1) </td><td> 2.5 ± 0.9 </td></tr></tbody></table> الجدول 2. النتائج النموذجية لإخراج AWF من P. الشائع السيرة الذاتية. Tendergreen الأوراق. <img alt="الشكل (1)" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/52113/52113fig1highres.jpg" /> الشكل 1. معيار سير العمل استخراج الممر الخلوي الغشائي. وتشير الأرقام إلى الخطوات في البروتوكول. <img alt="الشكل 2" src="/files/ftp_upload/52113/52113fig2highres.jpg" /> الشكل 2. مثال GC-MS اللوني من P. الشائع السيرة الذاتية. . Tendergreen AWF قمم سبيل المثال المستقلب مرقمة هي: 1-المالونات، 2-الفوسفات، 3-سكسينات، 4-مجهولة، 5-مالات، 6-الأسباراجين، 7-ريبيتول (الحادي الداخليandard)، 8-سيترات، 9-الجلوكوز، 10-اينوزيتول، وحامض 11 caffeic، 12-السكروز. <img alt="الشكل (3)" fo:content-width="3in" src="/files/ftp_upload/52113/52113fig3highres.jpg" width="250" /> الشكل 3. مثال SDS-PAGE Coomassie الملون هلام من P. الشائع AWF مقتطفات ورقة. ويوفر هذا الجل مقارنة بين مكونات البروتين اثنين من الاستخراج AWF التي تختلف في كمية التلوث حشوية بواسطة انزيم plastidial فيرة Rubisco. وبعد استخراج AWF تعرض كل من عينات لبروتين الأسيتون هطول الأمطار في وجود فائض 4 أضعاف (ت / ت) من الأسيتون البارد وresolubilized في الماء في عشر حجم الأصلي. الممرات 1 و 2 تحتوي على 40 ميكروغرام من البروتين. الفرقة المقابلة لسلسلة Rubisco كبيرة (~ 53 كيلو دالتون) يدل على ذلك السهم. M ص: بروتين علامات الوزن الجزيئي.

Watch this Scientific Journal Video about The Infiltration-centrifugation Technique for Extraction of Apoplastic Fluid from Plant Leaves Using Phaseolus vulgaris as an Example at JoVE.com

The Infiltration-centrifugation Technique for Extraction of Apoplastic Fluid from Plant Leaves Using Phaseolus vulgaris as an Example

This protocol details the optimized extraction of apoplast washing fluid from plant leaves, using French bean plants (Phaseolus vulgaris) as a model example.

تقنية تسلل الطرد المركزي لاستخراج Apoplastic السوائل من أوراق النبات عن طريق<em&gt; فاصيلوس الشائع</em&gt; كمثال

The apoplast is a distinct extracellular compartment in plant tissues that lies outside the plasma membrane and includes the cell wall. The apoplastic ...

the-infiltration-centrifugation-technique-for-extraction-apoplastic

Research

JoVE Journal

Biology

The Infiltration-centrifugation Technique for Extraction of Apoplastic Fluid from Plant Leaves Using Phaseolus vulgaris as an Example

36.6K Views.  University of Oxford. This protocol details the optimized extraction of apoplast washing fluid from plant leaves, using French bean plants (Phaseolus vulgaris) as a model example.

Video: The Infiltration-centrifugation Technique for Extraction of Apoplastic Fluid from Plant Leaves Using Phaseolus vulgaris as an Example

Testing the Physiological Barriers to Viral Transmission in Aphids Using Microinjection

Potato loafroll virus (PLRV), from the family Luteoviridae infects solanaceous plants. It is transmitted by aphids, primarily, the green peach aphid. When an uninfected aphid feeds on an infected plant it contracts the virus through the plant phloem. Once ingested, the virus must pass from the insect gut to the hemolymph (the insect  blood ) and then must pass through the salivary gland, in order to be transmitted back to a new plant. An aphid may take up different viruses when munching on a plant, however only a small fraction will pass through the gut and salivary gland, the two main barriers for transmission to infect more plants. In the lab, we use physalis plants to study PLRV transmission. In this host, symptoms are characterized by stunting and interveinal chlorosis (yellowing of the leaves between the veins with the veins remaining green). The video that we present demonstrates a method for performing aphid microinjection on insects that do not vector PLVR viruses and tests whether the gut is preventing viral transmission.
The video that we present demonstrates a method for performing Aphid microinjection on insects that do not vector PLVR viruses and tests whether the gut or salivary gland is preventing viral transmission.

Aphids are effective transmitters of plant viruses. Aphid microinjection of virus, the procedure we will show you today, is a technique allowing researchers to inject virus directly into the hemocoel of the aphid, bypassing the gut, one of the 2 major barriers for virus transmission in a circulative manner. The same technique is also used to inject dsRNA for RNAi.

اختبار الحواجز الفسيولوجية لانتقال الفيروس عن طريق Microinjection في المن

Potato loafroll virus (PLRV), from the family Luteoviridae infects solanaceous plants. It is transmitted by aphids, primarily, the green peach aphid. When ...

Testing Nicotine Tolerance in Aphids Using an Artificial Diet Experiment

Plants may upregulate the production of many different seconday metabolites in response to insect feeding. One of these metabolites, nicotine, is well know to have insecticidal properties. One response of tobacco plants to herbivory, or being gnawed upon by insects, is to increase the production of this neurotoxic alkaloid. Here, we will demonstrate how to set up an experiment to address this question of whether a tobacco-adapted strain of the green peach aphid, Myzus persicae, can tolerate higher levels of nicotine than the a strain of this insect that does not infest tobacco in the field.

In this video and assay is demonstrated that tests the tolerance of nicotine to two types of aphids one that infests tobacco plants in the field and one that does not.

اختبار تسامح النيكوتين في المن باستخدام تجربة حمية الاصطناعي

Plants may upregulate the production of many different seconday metabolites in response to insect feeding. One of these metabolites, nicotine, is well ...

A Technique for Serial Collection of Cerebrospinal Fluid from the Cisterna Magna in Mouse 

Alzheimer's disease (AD) is a progressive neurodegenerative disease that is pathologically characterized by extracellular deposition of &#946;-amyloid peptide (A&#946;) and intraneuronal accumulation of hyperphosphorylated tau protein. Because cerebrospinal fluid (CSF) is in direct contact with the extracellular space of the brain, it provides a reflection of the biochemical changes in the brain in response to pathological processes. CSF from AD patients shows a decrease in the 42 amino-acid form of A&#946; (A&#946;42), and increases in total tau and hyperphosphorylated tau, though the mechanisms responsible for these changes are still not fully understood. Transgenic (Tg) mouse models of AD provide an excellent opportunity to investigate how and why A&#946; or tau levels in CSF change as the disease progresses. Here, we demonstrate a refined cisterna magna puncture technique for CSF sampling from the mouse. This extremely gentle sampling technique allows serial CSF samples to be obtained from the same mouse at 2-3 month intervals which greatly minimizes the confounding effect of between-mouse variability in A&#946; or tau levels, making it possible to detect subtle alterations over time. In combination with A&#946; and tau ELISA, this technique will be useful for studies designed to investigate the relationship between the levels of CSF A&#946;42 and tau, and their metabolism in the brain in AD mouse models. Studies in Tg mice could provide important validation as to the potential of CSF A&#946; or tau levels to be used as biological markers for monitoring disease progression, and to monitor the effect of therapeutic interventions. As the mice can be sacrificed and the brains can be examined for biochemical or histological changes, the mechanisms underlying the CSF changes can be better assessed. These data are likely to be informative for interpretation of human AD CSF changes.

A Technique for Serial Collection of Cerebrospinal Fluid from the Cisterna Magna in Mouse

Transgenic (Tg) mouse models of AD provide an excellent opportunity to investigate how and why A&#946; or tau levels in CSF change as the disease progresses in human patients. Here, we demonstrate a refined cisterna magna puncture technique for serial CSF sampling from the mouse.

تقنية لجمع المسلسل من السائل النخاعي من ماجنا في صهريج للماوس

Alzheimer's disease (AD) is a progressive neurodegenerative disease that is pathologically characterized by extracellular deposition of &#946;-amyloid ...

Characterizing Herbivore Resistance Mechanisms: Spittlebugs on Brachiaria spp. as an Example

Plants can resist herbivore damage through three broad mechanisms: antixenosis, antibiosis and tolerance1. Antixenosis is the degree to which the plant is avoided when the herbivore is able to select other plants2. Antibiosis is the degree to which the plant affects the fitness of the herbivore feeding on it1.Tolerance is the degree to which the plant can withstand or repair damage caused by the herbivore, without compromising the herbivore's growth and reproduction1. The durability of herbivore resistance in an agricultural setting depends to a great extent on the resistance mechanism favored during crop breeding efforts3.
We demonstrate a no-choice experiment designed to estimate the relative contributions of antibiosis and tolerance to spittlebug resistance in Brachiaria spp. Several species of African grasses of the genus Brachiaria are valuable forage and pasture plants in the Neotropics, but they can be severely challenged by several native species of spittlebugs (Hemiptera: Cercopidae)4.To assess their resistance to spittlebugs, plants are vegetatively-propagated by stem cuttings and allowed to grow for approximately one month, allowing the growth of superficial roots on which spittlebugs can feed. At that point, each test plant is individually challenged with six spittlebug eggs near hatching. Infestations are allowed to progress for one month before evaluating plant damage and insect survival. Scoring plant damage provides an estimate of tolerance while scoring insect survival provides an estimate of antibiosis. This protocol has facilitated our plant breeding objective to enhance spittlebug resistance in commercial brachiariagrases5.

Characterizing Herbivore Resistance Mechanisms: Spittlebugs on Brachiaria spp. as an Example

This video explains mechanisms of host plant resistance to herbivory and demonstrates a no-choice test that estimates the relative contributions of antibiosis and tolerance to spittlebug resistance in Brachiaria spp.

توصيف آليات المقاومة آكل النبات : Spittlebugs على Brachiaria النيابة. كمثال

Plants can resist herbivore damage through three broad mechanisms: antixenosis, antibiosis and tolerance1. Antixenosis is the degree to which the plant is ...

Detection of Histone Modifications in Plant Leaves

Chromatin structure is important for the regulation of gene expression in eukaryotes. In this process, chromatin remodeling, DNA methylation, and covalent modifications on the amino-terminal tails of histones H3 and H4 play essential roles1-2. H3 and H4 histone modifications include methylation of lysine and arginine, acetylation of lysine, and phosphorylation of serine residues1-2. These modifications are associated either with gene activation, repression, or a primed state of gene that supports more rapid and robust activation of expression after perception of appropriate signals (microbe-associated molecular patterns, light, hormones, etc.)3-7. 
Here, we present a method for the reliable and sensitive detection of specific chromatin modifications on selected plant genes. The technique is based on the crosslinking of (modified) histones and DNA with formaldehyde8,9, extraction and sonication of chromatin, chromatin immunoprecipitation (ChIP) with modification-specific antibodies9,10, de-crosslinking of histone-DNA complexes, and gene-specific real-time quantitative PCR. The approach has proven useful for detecting specific histone modifications associated with C4 photosynthesis in maize5,11 and systemic immunity in Arabidopsis3.

A reliable and useful approach to detect histone modifications on specific plant genes is described. The approach combines chromatin immunoprecipitation (ChIP) and real-time quantitative PCR. It allows detection of histone modifications on specific genes with a role in diverse physiological processes.

الكشف عن تعديلات بسيطة في أوراق النبات

Chromatin structure is important for the regulation of gene expression in eukaryotes. In this process, chromatin remodeling, DNA methylation, and covalent ...

A Simple Method for Imaging Arabidopsis Leaves Using Perfluorodecalin as an Infiltrative Imaging Medium

The problem of acquiring high-resolution images deep into biological samples is widely acknowledged1. In air-filled tissue such as the spongy mesophyll of plant leaves or vertebrate lungs further difficulties arise from multiple transitions in refractive index between cellular components, between cells and airspaces and between the biological tissue and the rest of the optical system. Moreover, refractive index mismatches lead to attenuation of fluorophore excitation and signal emission in fluorescence microscopy. We describe here the application of the perfluorocarbon, perfluorodecalin (PFD), as an infiltrative imaging medium which optically improves laser scanning confocal microscopy (LSCM) sample imaging at depth, without resorting to damaging increases in laser power and has minimal physiological impact2. We describe the protocol for use of PFD with Arabidopsis thaliana leaf tissue, which is optically complex as a result of its structure (Figure 1). PFD has a number of attributes that make it suitable for this use3. The refractive index of PFD (1.313) is comparable with that of water (1.333) and is closer to that of cytosol (approx. 1.4) than air (1.000). In addition, PFD is readily available, non-fluorescent and is non-toxic. The low surface tension of PFD (19 dynes cm-1) is lower than that of water (72 dynes cm-1) and also below the limit (25 - 30 dyne cm-1) for stomatal penetration4, which allows it to flood the spongy mesophyll airspaces without the application of a potentially destructive vacuum or surfactant. Finally and crucially, PFD has a great capacity for dissolving CO2 and O2, which allows gas exchange to be maintained in the flooded tissue, thus minimizing the physiological impact on the sample. These properties have been used in various applications which include partial liquid breathing and lung inflation5,6, surgery7, artificial blood8, oxygenation of growth media9, and studies of ice crystal formation in plants10. Currently, it is common to mount tissue in water or aqueous buffer for live confocal imaging. We consider that the use of PFD as a mounting medium represents an improvement on existing practice and allows the simple preparation of live whole leaf samples for imaging.

A Simple Method for Imaging Arabidopsis Leaves Using Perfluorodecalin as an Infiltrative Imaging Medium

We describe the use of perfluorodecalin as an infiltrative mounting medium. This is a simple method for improving depth of imaging in Arabidopsis thaliana leaf tissue with minimal physiological impact.

طريقة بسيطة للتصوير Arabidopsis يغادر طريق Perfluorodecalin كوسيط التصوير إختراقي

The problem of acquiring high-resolution images deep into biological samples is widely acknowledged1. In air-filled tissue such as the spongy mesophyll of ...

Electroantennographic Bioassay as a Screening Tool for Host Plant Volatiles

Plant volatiles play an important role in plant-insect interactions. Herbivorous insects use plant volatiles, known as kairomones, to locate their host plant.1,2 When a host plant is an important agronomic commodity feeding damage by insect pests can inflict serious economic losses to growers. Accordingly, kairomones can be used as attractants to lure or confuse these insects and, thus, offer an environmentally friendly alternative to pesticides for insect control.3 Unfortunately, plants can emit a vast number volatiles with varying compositions and ratios of emissions dependent upon the phenology of the commodity or the time of day. This makes identification of biologically active components or blends of volatile components an arduous process. To help identify the bioactive components of host plant volatile emissions we employ the laboratory-based screening bioassay electroantennography (EAG). EAG is an effective tool to evaluate and record electrophysiologically the olfactory responses of an insect via their antennal receptors. The EAG screening process can help reduce the number of volatiles tested to identify promising bioactive components. However, EAG bioassays only provide information about activation of receptors. It does not provide information about the type of insect behavior the compound elicits; which could be as an attractant, repellent or other type of behavioral response. Volatiles eliciting a significant response by EAG, relative to an appropriate positive control, are typically taken on to further testing of behavioral responses of the insect pest. The experimental design presented will detail the methodology employed to screen almond-based host plant volatiles4,5 by measurement of the electrophysiological antennal responses of an adult insect pest navel orangeworm (Amyelois transitella) to single components and simple blends of components via EAG bioassay. The method utilizes two excised antennae placed across a "fork" electrode holder. The protocol demonstrated here presents a rapid, high-throughput standardized method for screening volatiles. Each volatile is at a set, constant amount as to standardize the stimulus level and thus allow antennal responses to be indicative of the relative chemoreceptivity. The negative control helps eliminate the electrophysiological response to both residual solvent and mechanical force of the puff. The positive control (in this instance acetophenone) is a single compound that has elicited a consistent response from male and female navel orangeworm (NOW) moth. An additional semiochemical standard that provides consistent response and is used for bioassay studies with the male NOW moth is (Z,Z)-11,13-hexdecadienal, an aldehyde component from the female-produced sex pheromone.6-8

A method to rapidly screen host plant volatiles by measurement of the electrophysiological response of adult navel orangeworm (Amyelois transitella) antennae to single components and blends via electroantennographic analysis is demonstrated.

Electroantennographic الأحيائي كأداة فحص لمواد متطايرة النبات المضيف

Plant volatiles play an important role in plant-insect interactions. Herbivorous insects use plant volatiles, known as kairomones, to locate their host ...

Isolation of Viable Multicellular Glands from Tissue of the Carnivorous Plant, Nepenthes

Many plants possess specialized structures that are involved in the production and secretion of specific low molecular weight compounds and proteins. These structures are almost always localized on plant surfaces. Among them are nectaries or glandular trichomes. The secreted compounds are often employed in interactions with the biotic environment, for example as attractants for pollinators or deterrents against herbivores.
Glands that are unique in several aspects can be found in carnivorous plants. In so-called pitcher plants of the genus Nepenthes, bifunctional glands inside the pitfall-trap on the one hand secrete the digestive fluid, including all enzymes necessary for prey digestion, and on the other hand take-up the released nutrients. Thus, these glands represent an ideal, specialized tissue predestinated to study the underlying molecular, biochemical, and physiological mechanisms of protein secretion and nutrient uptake in plants. Moreover, generally the biosynthesis of secondary compounds produced by many plants equipped with glandular structures could be investigated directly in glands.
In order to work on such specialized structures, they need to be isolated efficiently, fast, metabolically active, and without contamination with other tissues. Therefore, a mechanical micropreparation technique was developed and applied for studies on Nepenthes digestion fluid. Here, a protocol is presented that was used to successfully prepare single bifunctional glands from Nepenthes traps, based on a mechanized microsampling platform. The glands could be isolated and directly used further for gene expression analysis by PCR techniques after preparation of RNA.

Isolation of Viable Multicellular Glands from Tissue of the Carnivorous Plant, Nepenthes

Plants glands are specialized structures responsible for the biosynthesis and secretion of many compounds involved in interactions with the biotic environment. To enable studies on their molecular and biochemical features, a mechanical micropreparation technique was established in order to isolate single metabolically active glands, here from the carnivorous plant Nepenthes.

Many plants possess specialized structures that are involved in the production and secretion of specific low molecular weight compounds and proteins. ...

Measuring the Osmotic Water Permeability Coefficient (Pf) of Spherical Cells: Isolated Plant Protoplasts as an Example

Studying AQP regulation mechanisms is crucial for the understanding of water relations at both the cellular and the whole plant levels. Presented here is a simple and very efficient method for the determination of the osmotic water permeability coefficient (Pf) in plant protoplasts, applicable in principle also to other spherical cells such as frog oocytes. The first step of the assay is the isolation of protoplasts from the plant tissue of interest by enzymatic digestion into a chamber with an appropriate isotonic solution. The second step consists of an osmotic challenge assay: protoplasts immobilized on the bottom of the chamber are submitted to a constant perfusion starting with an isotonic solution and followed by a hypotonic solution. The cell swelling is video recorded. In the third step, the images are processed offline to yield volume changes, and the time course of the volume changes is correlated with the time course of the change in osmolarity of the chamber perfusion medium, using a curve fitting procedure written in Matlab (the &#8216;PfFit&#8217;), to yield Pf.

Measuring the Osmotic Water Permeability Coefficient Pf of Spherical Cells: Isolated Plant Protoplasts as an Example

Measuring the osmotic water permeability coefficient (Pf) of cells can help understand the regulatory mechanisms of aquaporins (AQPs). Pf determination in spherical plant cell protoplasts presented here involves protoplasts isolation and numerical analysis of their initial rate of volume change as a result of an osmotic challenge during constant bath perfusion.

قياس معامل نفاذية المياه الأسموزي (P<sub&gt; و</sub&gt;) من خلايا كروية: Protoplasts محطة معزولة كمثال

Studying AQP regulation mechanisms is crucial for the understanding of water relations at both the cellular and the whole plant levels. Presented here is ...

Procedure to Evaluate the Efficiency of Flocculants for the Removal of Dispersed Particles from Plant Extracts

Plants are important to humans not only because they provide commodities such as food, feed and raw materials, but increasingly because they can be used as manufacturing platforms for added-value products such as biopharmaceuticals. In both cases, liquid plant extracts may need to be clarified to remove particulates. Optimal clarification reduces the costs of filtration and centrifugation by increasing capacity and longevity. This can be achieved by introducing charged polymers known as flocculants, which cross-link dispersed particles to facilitate solid-liquid separation. There are no mechanistic flocculation models for complex mixtures such as plant extracts so empirical models are used instead. Here a design-of-experiments procedure is described that allows the rapid screening of different flocculants, optimizing the clarification of plant extracts and significantly reducing turbidity. The resulting predictive models allow the identification of robust process conditions and sets of polymers with complementary properties, e.g. effective flocculation in extracts with specific conductivities. The results presented for tobacco leaf extracts can easily be adapted to other plant species or tissues and will thus facilitate the development of more cost-effective downstream processes for commodities and plant-derived pharmaceuticals.

The design-of-experiments procedure presented here allows the evaluation of different flocculants in terms of their ability to aggregate dispersed particles in plant extracts, thus reducing turbidity and the costs of downstream processing.

إجراءات لتقييم كفاءة المرسب لإزالة فرقت الجسيمات من المستخلصات النباتية

Plants are important to humans not only because they provide commodities such as food, feed and raw materials, but increasingly because they can be used ...