Authors have nothing to disclose.

بروتوكول لأداء التجارب على الحيوانات، والأساس المنطقي وأهداف البحث، وتمت الموافقة عليها من قبل جامعة جنوب كاليفورنيا المؤسسي رعاية الحيوان واللجنة الاستخدام. وتمت الموافقة على بروتوكول لإنشاء الثقافات الأولية من إلغاء تحديدها-العينات المريء الإنسان من جامعة جنوب كاليفورنيا مجلس المراجعة المؤسسية. 1. الحصول على الماوس أو المريء الإنسان <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحصول ماوس المرئ: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الموت ببطء الماوس القديم 8-12 يوم مع 2٪ جرعة زائدة المستنشق الأيزوفلورين تليها خلع عنق الرحم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> دبوس الحيوان أسفل البطن مع مواجهة والرطب السطح البطني مع الايثانول 70٪. بالملقط، والاستيلاء ورفع الأمامي الجلد لفتح مجرى البول بالملقط. استخدام مقص جراحي القياسية على التوالي لقطع على طول خط الوسط بطني من فتح مجرى البول إلى الذقن. كن حذرا لقطع فقط الجلد. &lt;/ لى&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> إجراء شق من مجرى البول فتح الأسفل إلى الركبة على جانبي الحيوان، وتشكيل رأسا على عقب &quot;Y&quot;. جعل شق آخر على جانبي الحيوان على طول القفص الصدري. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قشر بعناية الجلد على كلا الجانبين، الخروج من الغشاء البريتوني الكامنة والقفص الصدري، ووضع على الجانبين. دراسة القفص الصدري المغطي التجويف الصدري والصفاق المغطي تجويف البطن. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> رفع الصفاق مع ملقط وقطع طريق ليصل إلى الحجاب الحاجز والقفص الصدري، مشيرا مقص التصاعدي لمنع تلف محتويات البطن. رفع بلطف صعودا الفص الأيسر من الكبد، وفضح المعدة الأساسية، تقاطع-المريء المعدة والجزء البطني من المريء. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام مقص جراحي تعقيمها لقطع طريق القص والقفص الصدري على طول خط الوسط حتى حزام عنق الرحم. مقص نقطة صعودا لمنع الأضرار التي لحقت محتويات الصدرية. كشف تماما عن محتوياتالتجويف الصدري عن طريق سحب القفص الصدري على الجانبين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بلطف إزالة القلب وكل من فصوص الرئة. امتصاص الدم الزائد مع Q-النصائح. المريء الصدري هو ضيق، أنبوب الكذب مرنة الخلفي إلى القصبة الهوائية والأمامي إلى الفقرات الصدرية. ملاحظة: المريء يمكن أن يكون من الصعب تحديد في حديثي الولادة الفئران. توطين تقاطع-المريء المعدة يجعل تحديد المريء واضحة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اتبع بعناية المريء من المعدة، تشريح الأوعية الدموية المحيطة بها، والدهون ومساريق على طول الطريق حتى إلى الأصل المريء في تجويف الرحم. مقص جراحي مع تلميح حادة تعمل على أفضل وجه لهذا الغرض. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بتر كامل طول المريء ومكان في هانكس &quot;محلول ملحي متوازن (HBSS) لمزيد من المعالجة هو موضح أدناه. إزالة جزء من المعدة لأغراض التوجه اذا شئت. ملاحظة: نظرا لحجم الأنسجة صغير، والفصل بين العضلية المخصوصة من العضلاتهو الغشاء المخاطي ليست قابلة للتحقيق في الفئران حديثي الولادة المريء ويخضع المريء كامل لمعالجة موضح أدناه. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحصول على المرئ الإنسان: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل العينات استئصال المريء (عادة 5 سم أو أقل) مع HBSS وإزالة أي تعلق النسيج الضام، والدهون، أو الأوعية الدموية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بتر جزء من العينة ووضعها في الفورمالين لفحص نسيجية في المستقبل اذا شئت. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فصل ما تبقى من الغشاء المخاطي من الأساسي العضلية المخصوصة التي كتبها تشريح حاد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع الغشاء المخاطي إلى أجزاء سنتيمتر الفرعية وتخضع لبروتوكول موضح أدناه. ملاحظة: استئصال المريء الإنسان يمكن تخزينها في برنامج تلفزيوني لمدة تصل إلى 6 ساعات قبل تجهيزها موضح أدناه. سوف مصدر العينات المريء تملي حجم العينة، وسوف يكون المختبر معتمدا. </li></ol></li></ol> 2. عزل الفئران والإنسان المريء اللحمية خلايا <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عزل خلايا انسجة المريء والفئران مدمج والأنسجة البشرية من خلال مزيج من الهضم الميكانيكي والأنزيمية. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> هضم ميكانيكيا بواسطة تنميق الأنسجة مع مقص ويغسل متعددة مع HBSS. هضم إنزيمي التي يحتضنها الأنسجة مع 300 U / مل كولاجيناز الحادي عشر و 0.1 ملغ / مل dispase لمدة 25 دقيقة (الأنسجة الفئران) أو لمدة تصل إلى 6 ساعات (الأنسجة البشرية). التأكد من أن الأدوات المستخدمة في تنميق تم تعقيمها وتعقيم. ملاحظة: Collagenases هي الانزيمات التي تفتت الكولاجين، وهو البروتين مصفوفة خارج الخلية مسؤولة عن عقد الأنسجة الحيوانية معا. كولاجيناز الحادي عشر ديه نشاط كولاجيناز عالية وشهدت نجاحا في هذا البروتوكول العزلة. Dispase هو الإنزيم البكتيري معتدلا مع النشاط التفكك بروتين أن يحافظ على خلية نشاط الغشاء ويستخدم في تركيبة مع كولاجيناز كما انزيم الثانوي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع شظايا المخاطية تم الحصول عليها من الماوس أو الأنسجة البشرية في 1.7 مل الصغيرة الطرد المركزي أو 5 مل أنابيب على التوالي، التي تحتوي على HBSS. نسيج اللحم المفروم مزيدإلى 2-3 مم القطع باستخدام مقص مع عرض غيض مفتوحة من شأنها أن تناسب أنابيب منها. يتيح وقتا كافيا للسماح للشظايا الغشاء المخاطي للمريء إلى الرواسب في قاع الأنبوب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> صب ببطء HBSS، والحرص على عدم تجاهل عن غير قصد الأنسجة. استبدال HBSS الطازجة التالية عن طريق هز لطيف. بدلا من ذلك، إزالة HBSS مع ماصة 1 مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الأنسجة بهذه الطريقة ما مجموعه 8 مرات مع لطيف تهتز في بين يغسل يتيح وقتا لشظايا المريء على الرسوبيات بين كل غسل. ملاحظة: الأنسجة البشرية سيتطلب أكثر تنميق أن الأنسجة الوليد الماوس. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان الأنسجة الفئران مع 300 U / مل كولاجيناز الحادي عشر و 0.1 ملغ / مل dispase لمدة 25 دقيقة على شاكر هزاز وضعت في سرعة بطيئة في درجة حرارة الغرفة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان الأنسجة البشرية مع 300 U / مل كولاجيناز الحادي عشر و 0.1 ملغ / مل dispase لمدة تصل إلى 6 ساعات، على شاكر هزاز وضعت في سرعة بطيئة في درجة حرارة الغرفة. ملاحظة: توفر esopha البشريجوس هو متغير. الغشاء المخاطي المريء البشري حضنت مع الانزيمات لمدة تصل إلى 6 النتائج ساعة في جيل ناجح من الثقافات الأولية. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد الهضم الأنزيمي، اللحم المفروم الأنسجة أكثر مع مقص والطرد المركزي في 200 x ج لمدة 10 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجاهل طاف. نقل بيليه، ويتكون من تعليق الخلية المختلطة إلى أنبوب 5 مل ويغسل 5 مرات في Dulbecco لتعديل النسر المتوسطة (DMEM) تستكمل مع 2٪ السوربيتول للقضاء على خلايا غير قابل للحياة والحطام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خلايا البذور في 6 لوحات جيدة والثقافة في DMEM مع المصل 10٪ بقري جنيني (FBS)، و 10 ملغ / مل الأنسولين، و 10 ميكروغرام / مل ترانسفيرين، 10 ميكروغرام / مل جنتاميسين، و2 نانوغرام / مل عامل نمو البشرة (EGF) . مرشح فراغ (0.22 ميكرون) جميع المكونات باستثناء EGF التي يمكن أن تضاف بعد الترشيح. توزيع الخلايا التي تم الحصول عليها من العينات استئصال الإنسان بين متعددة 6 لوحات جيدا، وهذا يتوقف على حجم الاستئصال الجزئي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مرة واحدة الآبار هي 80٪ متموجة، مرور الخلايا الملتصقة إلى T25 قارورة لناجي 0.05٪ التربسين / حمض ethylenediaminetetraacetic (EDTA). تحييد مع وسائل الإعلام وتدور في 400 ز س. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لمرور 6 جيدا لقارورة T25، وخلايا مرور في نسبة 1: 1. يمكن passaged قوارير متكدسة T25 في 1: 2 أو 1: 3 نسبة. إلى الانتقال من قارورة T25 إلى قارورة T75، استخدم نسبة 1: 1. تغيير وسائل الاعلام كل 2-3 أيام بغض النظر عن السفينة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> زراعة خلايا في 37 درجة مئوية في ترطيب 5٪ CO 2 الحاضنة والثقافة في وسائل الإعلام الأرومة الليفية العضلية المذكورة أعلاه. ملاحظة: الخلايا الظهارية لا البقاء على قيد الحياة في ظل هذه الظروف ثقافة أو المرور. الخلايا المستخدمة لتوصيف والدراسات المبينة أدناه هي بين الممرات 5 و 15. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> البرد الحفاظ على الخلايا في السائل N 2 وذلك بإضافة 10٪ ثنائي ميثيل سلفوكسيد إلى وسائل الإعلام الأرومة الليفية العضلية. </li></ol></li></ol> 3. تميز الفئران والإنسان المريء اللحمية خلايا <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> دراسة مورفولوجيا الخلايا مع مجهر مقلوب. مراقبة على شكل المغزلمورفولوجيا الخلايا الملتصقة (الشكل 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تميز الخلايا المستزرعة التي كتبها تقييم علامات هيكل الخلية التالية: α-SMA، فيمنتين، desmin، وcytokeratin. خلايا انسجة مع النمط الظاهري مثل الأرومة الليفية العضلية تعبر عن علامات الأرومة الليفية العضلية هيكل الخلية α-SMA وفيمنتين (الشكل 2). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الاستمرار في تمييز الخلايا اللحمية مثقف من خلايا العضلات، immunostain لdesmin. لأداء المناعية على خلايا مثقف، لوحة 1.5 × 10 4 خلايا في الشرائح غرفة 4-جيدا وتنمو في وسائل الإعلام الأرومة الليفية العضلية لمدة 24 ساعة. سوف خلايا انسجة مع النمط الظاهري مثل الأرومة الليفية العضلية يكون ضعيفا أو غائبا التعبير desmin. خلايا انسجة تفتقر التعبير عن علامة الظهارية عموم cytokeratin (لا تظهر البيانات). ملاحظة: يتضمن تقييم الثقافات تقييم علامات هيكل الخلية التي كتبها مناعية وسطح الخلية علامات التدفق الخلوي. يستخدم مناعية كطريقة الرئيسي لتوصيف مثل السابقالملف الشخصي PRESSION من البروتينات هيكل الخلية هي فريدة من نوعها لالليفية، الأرومة الليفية العضلية أو الخلايا العضلية. يؤسس التدفق الخلوي ثقافة النقاء من خلال تقييم خلية التعبير سطح الظهارية، البطانية، والخلايا المكونة للدم علامات. CD90 مفيد كطريقة مرافقة من تحديد خلايا انسجة الإنسان كما يعبر عنه على كل من الخلايا الليفية الإنسان وmyofibroblasts. CD90 ليست مفيدة في توصيف خلايا انسجة الفئران كما أعرب أيضا عن طريق خلايا T الفئران. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد خلايا تصل إلى 60٪ التقاء، وشطف الشرائح مع الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) وإصلاح مع الميثانول. احتضان الخلايا في الميثانول لمدة 10 دقيقة في -20 ° C، ثم تخزينها في برنامج تلفزيوني في 4 درجات مئوية حتى الاستخدام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اتبع بروتوكول المناعية القياسية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لفترة وجيزة، قبل تطبيق الأجسام المضادة الأولية، منع خلايا ثابتة مع 5٪ goatserum في برنامج تلفزيوني. تمييع الأجسام المضادة الأولية والثانوية في 5٪ مصل الماعز أيضا. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> للكشف عن α-SMA وفيمنتين، استخدمالأجسام المضادة التالية وتركيزات: الفأر MAB إلى α-SMA في 1: 250 التخفيف والأرنب PAB إلى فيمنتين في 1: 500 التخفيف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان مع الأجسام المضادة الأولية في درجة حرارة الغرفة بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية، وشطف 3 مرات مع برنامج تلفزيوني وإضافة الأجسام المضادة الثانوية رودامين مترافق الماعز المضادة الماوس في التخفيف من 1: 200 وCy2 الماعز مترافق مكافحة الأرنب في التخفيف من 1: 1،000 لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نوى مباين مع 4 &quot;، 6-Diamidino-2Phenylindole (دابي) بتركيز 1 ميكروغرام / مل لمدة 1 دقيقة ثم يغسل مع برنامج تلفزيوني. تحليل الشرائح مع مجهر مقلوب. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إنشاء نقاء الثقافات عن طريق الفحص من خلايا المريء الفئران والإنسان للدم (CD45) والبطانية (CD31) علامات سطح الخلية عن طريق التدفق الخلوي (الشكل 3). تميز الخلايا البشرية مزيدا من التعبير عن الخلية انسجة علامة السطحية CD90. ملاحظة: CD90 لا يمكن أن تستخدم لتحديد الخلايا اللحمية الفئران كما الفئران T سلليرة سورية أيضا التعبير عن CD90. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فصل خلايا فأر المريء انسجة مثقف من قوارير الثقافة عن طريق العلاج مع خلية غير الأنزيمية التفكك الحل عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة، وغسلها مع العازلة FACS مرتين، عد وملطخة FITC-CD45 وAPC-CD31 مع الضوابط نمط إسوي ذات الصلة، وفقا لتلطيخ الاجراءات القياسية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع الخلايا باستخدام FACS بنات كوول وتحليل البيانات مع برنامج FlowJo. قبل خلايا تلطيخ، وتحسين الأجسام المضادة ويعاير تركيزات باستخدام عناصر تحكم نمط إسوي والطحال الماوس العادي، وخلايا نخاع العظام. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Stappenbeck, T. S., Miyoshi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+stromal+stem+cells+in+tissue+regeneration+and+wound+repair.">The role of stromal stem cells in tissue regeneration and wound repair.</a> Science. 324 (5935), 1666-1669 (2009).</li><li>Powell, D. W., Pinchuk, I. V., Saada, J. I., Chen, X., Mifflin, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+cells+of+the+intestinal+lamina+propria.">Mesenchymal cells of the intestinal lamina propria.</a> Annu Rev Physiol. 73, 213-237 (2011).</li><li>Rieder, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-Helper+2+Cytokines,+Transforming+Growth+Factor+beta1,+and+Eosinophil+Products+Induce+Fibrogenesis+and+Alter+Muscle+Motility+in+Patients+With+Eosinophilic+Esophagitis.">T-Helper 2 Cytokines, Transforming Growth Factor beta1, and Eosinophil Products Induce Fibrogenesis and Alter Muscle Motility in Patients With Eosinophilic Esophagitis.</a> Gastroenterology. 146 (5), 1266-1277 (2014).</li><li>Powell, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paracrine+cells+important+in+health+and+disease.">Paracrine cells important in health and disease.</a> The American Journal of Physiology. 277 (1 Pt. 1), C1-9 (1999).</li><li>Powell, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+subepithelial+myofibroblasts.">Intestinal subepithelial myofibroblasts.</a> The American Journal of Physiology. 277 (2 Pt. 1), C183-201 (1999).</li><li>Shaker, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stromal+cells+participate+in+the+murine+esophageal+mucosal+injury+response.">Stromal cells participate in the murine esophageal mucosal injury response.</a> American Journal of Physiology Gastrointestinal and Liver Physiology. 304 (7), 662-672 (2013).</li><li>Shaker, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epimorphin+deletion+protects+mice+from+inflammation-induced+colon+carcinogenesis+and+alters+stem+cell+niche+myofibroblast+secretion.">Epimorphin deletion protects mice from inflammation-induced colon carcinogenesis and alters stem cell niche myofibroblast secretion.</a> The Journal of Clinical Investigation. 120 (6), 2081-2093 (2010).</li><li>Kalabis, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+mouse+and+human+esophageal+epithelial+cells+in+3D+organotypic+culture.">Isolation and characterization of mouse and human esophageal epithelial cells in 3D organotypic culture.</a> Nature Protocols. 7 (2), 235-246 (2012).</li><li>Khalil, H., Nie, W., Edwards, R. A., Yoo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+primary+myofibroblasts+from+mouse+and+human+colon+tissue.">Isolation of primary myofibroblasts from mouse and human colon tissue.</a> Journal of Visualized Experiments. (80), (2013).</li><li>Rieder, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gastroesophageal+reflux+disease-associated+esophagitis+induces+endogenous+cytokine+production+leading+to+motor+abnormalities.">Gastroesophageal reflux disease-associated esophagitis induces endogenous cytokine production leading to motor abnormalities.</a> Gastroenterology. 132 (1), 154-165 (2007).</li></ol>

ويؤيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة / NCI K08CA153036-01A1 (AS)، AGA-جنرال ميلز معهد بيل الصحة والتغذية جائزة بحوث الباحث في علم وظائف الأعضاء الوتر وجائزة الطيار مؤسسة رايت (AS) الصحة (AS) و.

تقنيات لتوليد ثقافة الأساسي متشابهة عموما عند استخدام أنسجة الفئران أو الإنسان مع تنميق والهضم مرات تكييفها لحجم الأنسجة. تجربتنا مع الأنسجة الفئران تشير إلى أن استخدام الأساليب المذكورة أعلاه يؤدي باستمرار في إنشاء الناجح للثقافات الأولية. وتشمل الخطوات الحاسمة ?...

وتشارك التفاعلات الظهارية اللحمية في تنظيم مجموعة متنوعة من الوظائف الجهاز الهضمي بما في ذلك تجديد الغشاء المخاطي، وإصلاح، والتليف، والتسرطن 1،2. وكانت هذه التفاعلات أفضل درس في الأمعاء الدقيقة والقولون وربما تلعب بالمثل دورا في اضطرابات المخاطية للمريء 3. وقد تجلى جزء من السكان من myofibroblasts الخلايا اللحمية المعوية والقولون ووصف للمشاركة في التوسط إصابة الأنسجة، والتهاب وإصلاح 4،5. في الجهاز الهضمي البعيدة، وهذه الخلايا المغزل على شكل يقع بالقرب من الغشاء القاعدي في واجهة بين الظهارة والصفيحة المخصوصة وتعرف بأنها α-SMA وفيمنتين إيجابية، لعموم cytokeratin سلبية، وإيجابية ضعيفة أو desmin سلبي 5. لم يتميز سدى المريء بصرامة على المستوى الخلوي أو الجزيئي. عملنا في المريء الفئران وديmonstrated α-SMA وفيمنتين الخلايا في سدى المريء، تحتاني في بعض الأحيان إلى ظهارة الحرشفية 6. قد تورطت التفاعلات الظهارية اللحمية في اضطرابات المخاطية للمريء مثل المعدي المريئي بوساطة إصابة 6 والتهاب المريء اليوزيني 3. القيود تليفي هي أيضا من المضاعفات المعروفة للخلايا الإصابة وانسجة المريء قد تورطت في التسبب في التليف الهضمي. سوف عزل هذه الخلايا تساعد في إنجاز الدراسات اللازمة للتحقيق في مسارات الإشارات مختل. يوفر هذا التقديم التقنيات اللازمة لإنشاء الثقافات الأولية من α-SMA، myofibroblasts إيجابية فيمنتين الايجابية ان هذه الفجوات القائمة في المعرفة بشأن مسارات إشارات تتوسط هذه التفاعلات يمكن معالجتها. تقنية الموضحة وقد استخدم بنجاح من قبل المؤلفين لإنشاء الأولية myofibroblasts القولون الفئران (7) وابعد من ذلكص تكييفها لإنشاء الفئران وخلايا انسجة 6 المريء مثل الأرومة الليفية العضلية الإنسان. هنا نحن تصف الشروط اللازمة لإنشاء وتميز هذه الثقافات أنشئت من الماوس أو المريء البشري قبل استخدامها في الدراسات الوظيفية المستقبلية. الثقافات يمكن زراعتها والاستفادة منها لمدة تصل إلى 15 الممرات. العزلة وإنشاء الثقافات الأولية عن طريق الأساليب المذكورة أدناه يولد خلايا انسجة مع النمط الظاهري الأرومة الليفية العضلية. α-SMA، فيمنتين إيجابي، وإيجابي ضعيف أو سلبي لdesmin، وcytokeratin سلبي. هذا النمط الظاهري يختلف عن النمط الظاهري من الخلايا الليفية المريء والتي هي في الغالب إيجابية فيمنتين، α-SMA سلبي 3 أو α-SMA إيجابي، فيمنتين النمط الظاهري السلبي للالعضلية المخاطية 6.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1647">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:549px;">Name</td>
			<td style="width:549px;"></td>
			<td style="width:549px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tissue culture reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HBSS&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H6648</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">dispase&#160;</td>
			<td>GIBCO, Invitrogen</td>
			<td>&#160;17105-041</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">collagenase XI&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>C9407&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DMEM&#160;</td>
			<td>GIBCO, Invitrogen&#160;</td>
			<td>11965-092</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">sorbitol&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S1876</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">FBS</td>
			<td>Sigma)</td>
			<td>F42442</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">transferrin&#160;</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10-652-202-001</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">trypsin/EDTA&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-052-Cl</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">epidermal growth factor&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E9644</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">trypsin/EDTA&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>&#160;25-052-Cl</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Reagents for immunostaining</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">goat serum</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G9023</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Mouse mAB to &#945;-SMA&#160;</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab7817</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Rabbit pAB to vimentin&#160;</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab45939</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cy2 conjugated Goat anti Rabbit&#160;</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>111-225-144</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DAPI&#160;</td>
			<td>sigma-aldrich</td>
			<td>D8417</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">CD31 conjugated to eFluor 450&#160;</td>
			<td>ebiosciences</td>
			<td>48-0319-410</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">CD90 conjugated to APC&#160;</td>
			<td>ebiosciences&#160;</td>
			<td>17-0909-41&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Annexin V and 7AAD&#160;</td>
			<td>BD Pharmigen</td>
			<td>559763</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">mouse Fc block for CD16/CD32&#160;</td>
			<td>BD Pharmigen</td>
			<td>2136662</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">5 ml tube&#160;</td>
			<td>eppendorf</td>
			<td>30108310</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Motic AE31 inverted microscope</td>
			<td>Motic AE31 inverted microscope</td>
			<td>Motic AE31 inverted microscope</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Nuaire Biosafety Cabinet and Incubators</td>
			<td>Nuaire Biosafety Cabinet and Incubators</td>
			<td>Nuaire Biosafety Cabinet and Incubators</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">4-well chamber slides&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>177437</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Eppendorf Centrifuge 5810R</td>
			<td>Eppendorf Centrifuge 5810R</td>
			<td>Eppendorf Centrifuge 5810R</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Olympus Vacuum-Driven Filter System&#160;</td>
			<td>Genesee Scientific&#160;</td>
			<td>25-227</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Nikon Eclipse TE300 Fluorescent Microscope&#160;</td>
			<td>Nikon Eclipse TE300 Fluorescent Microscope (Tokyo, Japan)&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">6 well plates&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3516</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">T25 Flasks&#160;</td>
			<td>TRP&#160;</td>
			<td>90026</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">T75 Flasks&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>43064</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dissection Scissors</td>
			<td>Dissection Scissors</td>
			<td>Dissection Scissors</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dissection Forceps</td>
			<td>Dissection Forceps</td>
			<td>Dissection Forceps</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Single Tipped Q-Tips&#160;</td>
			<td>Kendall</td>
			<td>540500</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">T75 Flasks</td>
			<td>Corning</td>
			<td>43064</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Metamorph software (Molecular Devices)</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">FACSCAlibur&#160;</td>
			<td>BD Bioscience&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">FACSVerse</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of myofibroblasts from mouse and human esophagus

يتم إنشاء الفئران والمريء البشري myofibroblasts عن طريق الهضم الأنزيمي. يتم حصاد الوليد (8-12 يوم من العمر) المريء الفئران، مفروم، وغسلها، وتعرض لعملية الهضم الأنزيمي مع كولاجيناز وdispase لمدة 25 دقيقة. يتم تجريد العينات استئصال المريء الإنسان للالمخصوصة العضلية والبرانية ومفروم الغشاء المخاطي المتبقية، وتعرض لعملية الهضم الأنزيمي مع كولاجيناز وdispase لمدة تصل إلى 6 ساعات. الخلايا المستزرعة تعبر α-SMA وفيمنتين وdesmin صريح ضعيفة أو لا على الاطلاق. الظروف الثقافة ليست مواتية لنمو طلائي، المكونة للدم، أو الخلايا البطانية. تأكيد ثقافة نقاء مزيدا من تدفق تقييم cytometric من سطح الخلية علامة التعبير من المحتمل المكونة للدم تلويث والخلايا البطانية. تقنية الموضحة واضح ومباشر والنتائج في جيل ثابت من غير hematopoieitc، خلايا انسجة غير البطانية. القيود المفروضة على هذه التقنية هي الملازمة لاستخدامالثقافات الأولية في دراسات البيولوجيا الجزيئية، أي تقلبات لا مفر منه اجه بين الثقافات أنشئت في جميع أنحاء الفئران أو البشر مختلفة. لكن الثقافات الأولية هي انعكاس أكثر تمثيلا للدولة في الجسم الحي بالمقارنة مع خطوط الخلايا. هذه الأساليب أيضا توفير المحققين القدرة على عزل والخلايا الثقافة انسجة من الحالات السريرية والتجريبية المختلفة، ويتيح إجراء مقارنات بين المجموعات. ويمكن أيضا خلايا انسجة المريء تتميز استخدامها في الدراسات وظيفية التحقيق التفاعلات الظهارية اللحمية في اضطرابات المريء.

خلايا انسجة المريء معزولة باستخدام الهضم الميكانيكي والأنزيمية ومطلي في البداية ومثقف في 6 لوحات جيدة. فحص الخلايا مع مجهر مقلوب في غضون ساعات من الطلاء يوضح تعليق خلية مختلطة ملتصقة فضفاضة لوحة أسفل (الشكل 1A). على مدى ساعة 24 المقبلة، ويلاحظ خلايا على شكل مغز...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Myofibroblasts from Mouse and Human Esophagus at JoVE.com

Isolation of Myofibroblasts from Mouse and Human Esophagus

We present a protocol to generate primary cultures of murine and human esophageal stromal cells with a myofibroblast phenotype. Cultured cells have spindle shaped morphology, express &#945;-SMA and vimentin, and lack epithelial, hematopoietic and endothelial cell surface markers. Characterized stromal cells can be used in functional studies of epithelial-stromal interactions.

عزل Myofibroblasts من الفأر والمرئ الإنسان

Murine and human esophageal myofibroblasts are generated via enzymatic digestion. Neonate (8-12 day old) murine esophagus is harvested, minced, washed, ...

isolation-of-myofibroblasts-from-mouse-and-human-esophagus

Research

JoVE Journal

Biology

10.9K Views.  Keck School of Medicine, University of Southern California. We present a protocol to generate primary cultures of murine and human esophageal stromal cells with a myofibroblast phenotype. Cultured cells have spindle shaped morphology, express α-SMA and vimentin, and lack epithelial, hematopoietic and endothelial cell surface markers. Characterized stromal cells can be used in functional studies of epithelial-stromal interactions. 

Video: Isolation of Myofibroblasts from Mouse and Human Esophagus

Isolation of Genomic DNA from Mouse Tails

عزل الحمض النووي الجينوم من الذيول ماوس

Isolation and Culture of Adult Epithelial Stem Cells from Human Skin

The homeostasis of all self-renewing tissues is dependent on adult stem cells. As undifferentiated stem cells undergo asymmetric divisions, they generate daughter cells that retain the stem cell phenotype and transit-amplifying cells (TA cells) that migrate from the stem cell niche, undergo rapid proliferation and terminally differentiate to repopulate the tissue.
Epithelial stem cells have been identified in the epidermis, hair follicle, and intestine as cells with a high in vitro proliferative potential and as slow-cycling label-retaining cells in vivo 1-3. Adult, tissue-specific stem cells are responsible for the regeneration of the tissues in which they reside during normal physiologic turnover as well as during times of stress 4-5. Moreover, stem cells are generally considered to be multi-potent, possessing the capacity to give rise to multiple cell types within the tissue 6. For example, rodent hair follicle stem cells can generate epidermis, sebaceous glands, and hair follicles 7-9. We have shown that stem cells from the human hair follicle bulge region exhibit multi-potentiality 10.
Stem cells have become a valuable tool in biomedical research, due to their utility as an in vitro system for studying developmental biology, differentiation, tumorigenesis and for their possible therapeutic utility. It is likely that adult epithelial stem cells will be useful in the treatment of diseases such as ectodermal dysplasias, monilethrix, Netherton syndrome, Menkes disease, hereditary epidermolysis bullosa and alopecias 11-13. Additionally, other skin problems such as burn wounds, chronic wounds and ulcers will benefit from stem cell related therapies 14,15. Given the potential for reprogramming of adult cells into a pluripotent state (iPS cells)16,17, the readily accessible and expandable adult stem cells in human skin may provide a valuable source of cells for induction and downstream therapy for a wide range of disease including diabetes and Parkinson's disease.

A rapid, robust way of isolating viable adult epithelial stem cells from human skin is described. The method utilizes enzymatic digestion of skin collagen matrix , followed by plucking of hair follicles and isolation of single cell suspensions or tissue fragments for cell culture.

العزلة وثقافة الكبار الخلايا الجذعية الظهارية من الجلد البشري

The homeostasis of all self-renewing tissues is dependent on adult stem cells. As undifferentiated stem cells undergo asymmetric divisions, they generate ...

Manual Isolation of Adipose-derived Stem Cells from Human Lipoaspirates

In 2001, researchers at the University of California, Los Angeles, described the isolation of a new population of adult stem cells from liposuctioned adipose tissue that they initially termed Processed Lipoaspirate Cells or PLA cells. Since then, these stem cells have been renamed as Adipose-derived Stem Cells or ASCs and have gone on to become one of the most popular adult stem cells populations in the fields of stem cell research and regenerative medicine. Thousands of articles now describe the use of ASCs in a variety of regenerative animal models, including bone regeneration, peripheral nerve repair and cardiovascular engineering. Recent articles have begun to describe the myriad of uses for ASCs in the clinic. The protocol shown in this article outlines the basic procedure for manually and enzymatically isolating ASCs from large amounts of lipoaspirates obtained from cosmetic procedures. This protocol can easily be scaled up or down to accommodate the volume of lipoaspirate and can be adapted to isolate ASCs from fat tissue obtained through abdominoplasties and other similar procedures.

In 2001, researchers at UCLA described the isolation of a population of adult stem cells, termed Adipose-derived Stem Cells or ASCs, from adipose tissue. This article outlines the isolation of ASCs from lipoaspirates using a manual, enzymatic digestion protocol using collagenase.

عزل الخلايا الجذعية من دليل الدهنية المشتقة من Lipoaspirates الإنسان

In 2001, researchers at the University of  California, Los Angeles, described the isolation of a new population of adult  stem cells from liposuctioned ...

Isolation of Primary Myofibroblasts from Mouse and Human Colon Tissue

The myofibroblast is a stromal cell of the gastrointestinal (GI) tract that has been gaining considerable attention for its critical role in many GI functions. While several myofibroblast cell lines are commercially available to study these cells in vitro, research results from a cell line exposed to experimental cell culture conditions have inherent limitations due to the overly reductionist nature of the work. Use of primary myofibroblasts offers a great advantage in terms of confirming experimental findings identified in a cell line. Isolation of primary myofibroblasts from an animal model allows for the study of myofibroblasts under conditions that more closely mimic the disease state being studied. Isolation of primary myofibroblasts from human colon tissue provides arguably the most relevant experimental data, since the cells come directly from patients with the underlying disease. We describe a well-established technique that can be utilized to isolate primary myofibroblasts from both mouse and human colon tissue. These isolated cells have been characterized to be alpha-smooth muscle actin and vimentin-positive, and desmin-negative, consistent with subepithelial intestinal myofibroblasts. Primary myofibroblast cells can be grown in cell culture and used for experimental purposes over a limited number of passages.

The myofibroblast is an influential stromal cell of the gastrointestinal tract that regulates important physiologic processes in both normal and disease states. We describe a technique that allows for the isolation of primary myofibroblasts from both mouse and human colon tissue, which can be utilized for in vitro experimentation.

عزل Myofibroblasts الابتدائية من ماوس والأنسجة البشرية القولون

The myofibroblast is  a stromal cell of the gastrointestinal (GI) tract that has been gaining  considerable attention for its critical role in many GI ...

Isolation of Microvascular Endothelial Tubes from Mouse Resistance Arteries

The control of blood flow by the resistance vasculature regulates the supply of oxygen and nutrients concomitant with the removal of metabolic by-products, as exemplified by exercising skeletal muscle. Endothelial cells (ECs) line the intima of all resistance vessels and serve a key role in controlling diameter (e.g.&#160;endothelium-dependent vasodilation) and, thereby, the magnitude and distribution of tissue blood flow. The regulation of vascular resistance by ECs is effected by intracellular Ca2+ signaling, which leads to production of diffusible autacoids (e.g.&#160;nitric oxide and arachidonic acid metabolites)1-3 and hyperpolarization4,5 that elicit smooth muscle cell relaxation. Thus understanding the dynamics of endothelial Ca2+ signaling is a key step towards understanding mechanisms governing blood flow control. Isolating endothelial tubes eliminates confounding variables associated with blood in the vessel lumen and with surrounding smooth muscle cells and perivascular nerves, which otherwise influence EC structure and function. Here we present the isolation of endothelial tubes from the superior epigastric artery (SEA) using a protocol optimized for this vessel.
To isolate endothelial tubes from an anesthetized mouse, the SEA is ligated in situ to maintain blood within the vessel lumen (to facilitate visualizing it during dissection), and the entire sheet of abdominal muscle is excised. The SEA is dissected free from surrounding skeletal muscle fibers and connective tissue, blood is flushed from the lumen, and mild enzymatic digestion is performed to enable removal of adventitia, nerves and smooth muscle cells using gentle trituration. These freshly-isolated preparations of intact endothelium retain their native morphology, with individual ECs remaining functionally coupled to one another, able to transfer chemical and electrical signals intercellularly through gap junctions6,7. In addition to providing new insight into calcium signaling and membrane biophysics, these preparations enable molecular studies of gene expression and protein localization within native microvascular endothelium.

We present a preparation for visualizing and manipulating calcium signaling in native, intact microvascular endothelium. Endothelial tubes freshly isolated from mouse resistance arteries supplying skeletal muscle retain in vivo morphology and dynamic signaling within and between neighboring cells. Endothelial tubes can be prepared from microvessels of other tissues and organs.

عزل الاوعية الدموية الدقيقة البطانية أنابيب الشرايين ماوس المقاومة

The control of blood flow by the resistance vasculature regulates the supply of oxygen and nutrients concomitant with the removal of metabolic ...

Isolation and Culture of Dental Epithelial Stem Cells from the Adult Mouse Incisor

Understanding the cellular and molecular mechanisms that underlie tooth regeneration and renewal has become a topic of great interest1-4, and the mouse incisor provides a model for these processes. This remarkable organ grows continuously throughout the animal&#39;s life and generates all the necessary cell types from active pools of adult stem cells housed in the labial (toward the lip) and lingual (toward the tongue) cervical loop (CL) regions. Only the dental stem cells from the labial CL give rise to ameloblasts that generate enamel, the outer covering of teeth, on the labial surface. This asymmetric enamel formation allows abrasion at the incisor tip, and progenitors and stem cells in the proximal incisor ensure that the dental tissues are constantly replenished. The ability to isolate and grow these progenitor or stem cells in vitro allows their expansion and opens doors to numerous experiments not achievable in vivo, such as high throughput testing of potential stem cell regulatory factors. Here, we describe and demonstrate a reliable and consistent method to culture cells from the labial CL of the mouse incisor.

The continuously growing mouse incisor provides a model for studying renewal of dental tissues from dental epithelial stem cells (DESCs). A robust system for consistently and reliably obtaining these cells from the incisor and expanding them in vitro is reported here.

العزلة وثقافة الأسنان طلائي الخلايا الجذعية من الكبار ماوس القاطعة

Understanding the cellular and molecular mechanisms that underlie tooth regeneration and renewal has become a topic of great interest1-4, and the mouse ...

Isolation of Small Noncoding RNAs from Human Serum

The analysis of RNA and its expression is a common feature in many laboratories. Of significance is the emergence of small RNAs like microRNAs, which are found in mammalian cells. These small RNAs are potent gene regulators controlling vital pathways such as growth, development and death and much interest has been directed at their expression in bodily fluids. This is due to their dysregulation in human diseases such as cancer and their potential application as serum biomarkers. However, the analysis of miRNA expression in serum may be problematic. In most cases the amount of serum is limiting and serum contains low amounts of total RNA, of which small RNAs only constitute 0.4-0.5%1. Thus the isolation of sufficient amounts of quality RNA from serum is a major challenge to researchers today. In this technical paper, we demonstrate a method which uses only 400 &#181;l of human serum to obtain sufficient RNA for either DNA arrays or qPCR analysis. The advantages of this method are its simplicity and ability to yield high quality RNA. It requires no specialized columns for purification of small RNAs and utilizes general reagents and hardware found in common laboratories. Our method utilizes a Phase Lock Gel to eliminate phenol contamination while at the same time yielding high quality RNA. We also introduce an additional step to further remove all contaminants during the isolation step. This protocol is very effective in isolating yields of total RNA of up to 100 ng/&#181;l from serum but can also be adapted for other biological tissues.

This protocol describes a method for extracting small RNAs from human serum. We have used this method to isolate microRNAs from cancer serum for use in DNA arrays and also singleplex quantitative PCR. The protocol utilizes phenol and guanidinium thiocyanate reagents with modifications to yield high quality RNA.

عزل الرنا غير المكودة الصغيرة من مصل الإنسان

The analysis of RNA and its expression is a common feature in many laboratories. Of significance is the emergence of small RNAs like microRNAs, which are ...

Isolation of Mitochondria from Minimal Quantities of Mouse Skeletal Muscle for High Throughput Microplate Respiratory Measurements

Dysfunctional skeletal muscle mitochondria play a role in altered metabolism observed with aging, obesity and Type II diabetes. Mitochondrial respirometric assays from isolated mitochondrial preparations allow for the assessment of mitochondrial function, as well as determination of the mechanism(s) of action of drugs and proteins that modulate metabolism. Current isolation procedures often require large quantities of tissue to yield high quality mitochondria necessary for respirometric assays. The methods presented herein describe how high quality purified mitochondria (~ 450 &#181;g) can be isolated from minimal quantities (~75-100 mg) of mouse skeletal muscle for use in high throughput respiratory measurements. We determined that our isolation method yields 92.5&#177; 2.0% intact mitochondria by measuring citrate synthase activity spectrophotometrically. In addition, Western blot analysis in isolated mitochondria resulted in the faint expression of the cytosolic protein, GAPDH, and the robust expression of the mitochondrial protein, COXIV. The absence of a prominent GAPDH band in the isolated mitochondria is indicative of little contamination from non-mitochondrial sources during the isolation procedure. Most importantly, the measurement of O2 consumption rate with micro-plate based technology and determining the respiratory control ratio (RCR) for coupled respirometric assays shows highly coupled (RCR; &#62;6 for all assays) and functional mitochondria. In conclusion, the addition of a separate mincing step and significantly reducing motor driven homogenization speed of a previously reported method has allowed the isolation of high quality and purified mitochondria from smaller quantities of mouse skeletal muscle that results in highly coupled mitochondria that respire with high function during microplate based respirometirc assays.

Here, we present a modification of a previously reported method that allows for the isolation of high quality and purified mitochondria from smaller quantities of mouse skeletal muscle. This procedure results in highly coupled mitochondria that respire with high function during microplate based respirometirc assays.

عزل الميتوكوندريا من كميات الحد الأدنى من الفأر العضلات الهيكلية للإنتاجية عالية صفيحة ميكروسكوبية الجهاز التنفسي القياسات

Dysfunctional skeletal muscle mitochondria play a role in altered metabolism observed with aging, obesity and Type II diabetes. Mitochondrial ...

Isolation and Culture of Primary Mouse Keratinocytes from Neonatal and Adult Mouse Skin

The keratinocyte (KC) is the predominant cell type in the epidermis, the outermost layer of the skin. Epidermal KCs play a critical role in providing skin defense by forming an intact skin barrier against environmental insults, such as UVB irradiation or pathogens, and also by initiating an inflammatory response upon those insults. Here we describe methods to isolate KCs from neonatal mouse skin and from adult mouse tail skin. We also describe culturing conditions using defined growth supplements (dGS) in comparison to chelexed fetal bovine serum (cFBS). Functionally, we show that both neonatal and adult KCs are highly responsive to high calcium-induced terminal differentiation, tight junction formation and stratification. Additionally, cultured adult KCs are susceptible to UVB-triggered cell death and can release large amounts of TNF upon UVB irradiation. Together, the methods described here will be useful to researchers for the setup of in vitro models to study epidermal biology in the neonatal mouse and/or the adult mouse.

Epidermal keratinocytes form a functional skin barrier and are positioned at the front line of host defense against external environmental insults. Here we describe methods for isolation and primary culture of epidermal keratinocytes from neonatal and adult mouse skin, and induction of terminal differentiation and UVB-triggered inflammatory response from keratinocytes.

عزل وثقافة الكرياتينية الماوس الرئيسية من حديثي الولادة والفأر الكبار الجلد

The keratinocyte (KC) is the predominant cell type in the epidermis, the outermost layer of the skin. Epidermal KCs play a critical role in providing skin ...

Isolation and Characterization of Adult Cardiac Fibroblasts and Myofibroblasts

Cardiac fibrosis in response to injury is a physiological response to wound healing. Efforts have been made to study and target fibroblast subtypes that mitigate fibrosis. However, fibroblast research has been hindered due to the lack of universally acceptable fibroblast markers to identify quiescent as well as activated fibroblasts. Fibroblasts are a heterogenous cell population, making them difficult to isolate and characterize. The presented protocol describes three different methods to enrich fibroblasts and myofibroblasts from uninjured and injured mouse hearts. Using a standard and reliable protocol to isolate fibroblasts will enable the study of their roles in homeostasis as well as fibrosis modulation.

Obtaining a pure population of fibroblasts is crucial to studying their role in wound repair and fibrosis. Described here is a detailed method to isolate fibroblasts and myofibroblasts from uninjured and injured mouse hearts followed by characterization of their purity and functionality by immunofluorescence, RTPCR, fluorescence-assisted cell sorting, and collagen gel contraction.

عزل وتوصيف الخلايا الليفية القلبية للبالغين والخلايا الليفية الليفية

Cardiac fibrosis in response to injury is a physiological response to wound healing. Efforts have been made to study and target fibroblast subtypes that ...