The authors gratefully acknowledge financial support from NIH R01 GM085293 (PI: E. M. Topp) and from the College of Pharmacy at Purdue University.

<ol>
	<li>Lawrence, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Billion+dollar+babies--biotech+drugs+as+blockbusters.">Billion dollar babies--biotech drugs as blockbusters.</a> Nat. Biotechnol. 25 (4), 380-382 (2007).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Global Markets and Manufacturing Technologies for Protein Drugs. , BIO021D (2013).</li><li>Lai, M. C., Topp, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solid-state+chemical+stability+of+proteins+and+peptides.">Solid-state chemical stability of proteins and peptides.</a> J. Pharm. Sci. 88 (5), 489-500 (1999).</li><li>Carpenter, J. F., Pikal, M. J., Chang, B. S., Randolph, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rational+design+of+stable+lyophilized+protein+formulations:+some+practical+advice.">Rational design of stable lyophilized protein formulations: some practical advice.</a> Pharm. Res. 14 (8), 969-975 (1997).</li><li>Carpenter, J. F., Chang, B. S., Garzon-Rodriguez, W., Randolph, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rational+design+of+stable+lyophilized+protein+formulations:+theory+and+practice.">Rational design of stable lyophilized protein formulations: theory and practice.</a> Pharm. Biotechnol. 13, 109-133 (2002).</li><li>W&#252;thrich, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+structure+determination+in+solution+by+NMR+spectroscopy.">Protein structure determination in solution by NMR spectroscopy.</a> J. Biol. Chem. 265 (36), 22059-22062 (1990).</li><li>Ilari, A., Savino, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+structure+determination+by+x-ray+crystallography.">Protein structure determination by x-ray crystallography.</a> Methods. Mol. Biol. 452, 63-87 (2008).</li><li>Brunger, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X-ray+crystallography+and+NMR+reveal+complementary+views+of+structure+and+dynamics.">X-ray crystallography and NMR reveal complementary views of structure and dynamics.</a> Nat. Struct. Biol. 4, 862-865 (1997).</li><li>Yu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amorphous+pharmaceutical+solids:+preparation,+characterization+and+stabilization.">Amorphous pharmaceutical solids: preparation, characterization and stabilization.</a> Adv Drug. Deliv. Rev. 48 (1), 27-42 (2001).</li><li>Manning, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+infrared+spectroscopy+to+monitor+protein+structure+and+stability.">Use of infrared spectroscopy to monitor protein structure and stability.</a> Expert. Rev. Proteomics. 2 (5), 731-743 (2005).</li><li>Grohganz, H., Gildemyn, D., Skibsted, E., Flink, J. M., Rantanen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+solid-state+analysis+of+freeze-dried+protein+formulations+using+NIR+and+Raman+spectroscopies.">Rapid solid-state analysis of freeze-dried protein formulations using NIR and Raman spectroscopies.</a> J. Pharm. Sci. 100 (7), 2871-2875 (2011).</li><li>Bai, S., Nayar, R., Carpenter, J. F., Manning, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+determination+of+protein+conformation+in+the+solid+state+using+near+infrared+(NIR)+spectroscopy.">Noninvasive determination of protein conformation in the solid state using near infrared (NIR) spectroscopy.</a> J. Pharm. Sci. 94 (9), 2030-2038 (2005).</li><li>Pikal, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solid+state+chemistry+of+proteins:+II.+The+correlation+of+storage+stability+of+freeze-dried+human+growth+hormone+(hGH)+with+structure+and+dynamics+in+the+glassy+solid.">Solid state chemistry of proteins: II. The correlation of storage stability of freeze-dried human growth hormone (hGH) with structure and dynamics in the glassy solid.</a> J. Pharm. Sci. 97 (12), 5106-5121 (2008).</li><li>Wang, B., Tchessalov, S., Cicerone, M. T., Warne, N. W., Pikal, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+sucrose+level+on+storage+stability+of+proteins+in+freeze-dried+solids:+II.+Correlation+of+aggregation+rate+with+protein+structure+and+molecular+mobility.">Impact of sucrose level on storage stability of proteins in freeze-dried solids: II. Correlation of aggregation rate with protein structure and molecular mobility.</a> J. Pharm. Sci. 98 (9), 3145-3166 (2009).</li><li>Schule, S., Friess, W., Bechtold-Peters, K., Garidel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformational+analysis+of+protein+secondary+structure+during+spray-drying+of+antibody/mannitol+formulations.">Conformational analysis of protein secondary structure during spray-drying of antibody/mannitol formulations.</a> Eur. J. Pharm. Biopharm. 65 (1), 1-9 (2007).</li><li>Baerga-Ortiz, A., Hughes, C. A., Mandell, J. G., Komives, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epitope+mapping+of+a+monoclonal+antibody+against+human+thrombin+by+H/D-exchange+mass+spectrometry+reveals+selection+of+a+diverse+sequence+in+a+highly+conserved+protein.">Epitope mapping of a monoclonal antibody against human thrombin by H/D-exchange mass spectrometry reveals selection of a diverse sequence in a highly conserved protein.</a> Protein. Sci. 11 (6), 1300-1308 (2002).</li><li>Coales, S. J., Tuske, S. J., Tomasso, J. C., Hamuro, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epitope+mapping+by+amide+hydrogen/deuterium+exchange+coupled+with+immobilization+of+antibody,+on-line+proteolysis,+liquid+chromatography+and+mass+spectrometry.">Epitope mapping by amide hydrogen/deuterium exchange coupled with immobilization of antibody, on-line proteolysis, liquid chromatography and mass spectrometry.</a> Rapid. Commun. Mass. Spectrom. 23 (5), 639-647 (2009).</li><li>Pacholarz, K. J., Garlish, R. A., Taylor, R. J., Barran, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometry+based+tools+to+investigate+protein-ligand+interactions+for+drug+discovery.">Mass spectrometry based tools to investigate protein-ligand interactions for drug discovery.</a> Chem. Soc. Rev. 41 (11), 4335-4355 (2012).</li><li>Houde, D., Peng, Y., Berkowitz, S. A., Engen, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-translational+modifications+differentially+affect+IgG1+conformation+and+receptor+binding.">Post-translational modifications differentially affect IgG1 conformation and receptor binding.</a> Mol. Cell. Proteomics. 9 (8), 1716-1728 (2010).</li><li>Houde, D., Berkowitz, S. A., Engen, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+utility+of+hydrogen/deuterium+exchange+mass+spectrometry+in+biopharmaceutical+comparability+studies.">The utility of hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry in biopharmaceutical comparability studies.</a> J. Pharm. Sci. 100 (6), 2071-2086 (2011).</li><li>Dorman, G., Prestwich, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+photolabile+ligands+in+drug+discovery+and+development.">Using photolabile ligands in drug discovery and development.</a> Trends. Biotechnol. 18 (2), 64-77 (2000).</li><li>Robinette, D., Neamati, N., Tomer, K. B., Borchers, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoaffinity+labeling+combined+with+mass+spectrometric+approaches+as+a+tool+for+structural+proteomics.">Photoaffinity labeling combined with mass spectrometric approaches as a tool for structural proteomics.</a> Expert. Rev. Proteomics. 3 (4), 399-408 (2006).</li><li>Greenspan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Humidity+fixed+points+of+binary+saturated+aqueous+solutions.">Humidity fixed points of binary saturated aqueous solutions.</a> Journal of Research of the National Bureau of Standards. 81A (1), 8 (1977).</li><li>Sophocleous, A. M., Zhang, J., Topp, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localized+hydration+in+lyophilized+myoglobin+by+hydrogen-deuterium+exchange+mass+spectrometry.+1.+Exchange+mapping.">Localized hydration in lyophilized myoglobin by hydrogen-deuterium exchange mass spectrometry. 1. Exchange mapping.</a> Mol. Pharm. 9 (4), 718-726 (2012).</li><li>Keppel, T. R., Jacques, M. E., Young, R. W., Ratzlaff, K. L., Weis, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient+and+inexpensive+refrigerated+LC+system+for+H/D+exchange+mass+spectrometry.">An efficient and inexpensive refrigerated LC system for H/D exchange mass spectrometry.</a> J. Am. Soc. Mass. Spectrom. 22 (8), 1472-1476 (2011).</li><li>Gasteiger, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ExPASy:+The+proteomics+server+for+in-depth+protein+knowledge+and+analysis.">ExPASy: The proteomics server for in-depth protein knowledge and analysis.</a> Nucleic. Acids. Res. 31 (13), 3784-3788 (2003).</li><li>Sophocleous, A. M., Topp, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localized+hydration+in+lyophilized+myoglobin+by+hydrogen-deuterium+exchange+mass+spectrometry.+2.+Exchange+kinetics.">Localized hydration in lyophilized myoglobin by hydrogen-deuterium exchange mass spectrometry. 2. Exchange kinetics.</a> Mol. Pharm. 9 (4), 727-733 (2012).</li><li>Moorthy, B. S., Schultz, S. G., Kim, S. G., Topp, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predicting+Protein+Aggregation+during+Storage+in+Lyophilized+Solids+Using+Solid+State+Amide+Hydrogen/Deuterium+Exchange+with+Mass+Spectrometric+Analysis+(ssHDX-MS).">Predicting Protein Aggregation during Storage in Lyophilized Solids Using Solid State Amide Hydrogen/Deuterium Exchange with Mass Spectrometric Analysis (ssHDX-MS).</a> Mol. Pharm. 11 (6), 1869-1879 (2014).</li><li>Wang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lyophilization+and+development+of+solid+protein+pharmaceuticals.">Lyophilization and development of solid protein pharmaceuticals.</a> Int. J. Pharm. 203 (1-2), 1-60 (2000).</li><li>Sarciaux, J. M., Mansour, S., Hageman, M. J., Nail, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+buffer+composition+and+processing+conditions+on+aggregation+of+bovine+IgG+during+freeze-drying.">Effects of buffer composition and processing conditions on aggregation of bovine IgG during freeze-drying.</a> J. Pharm. Sci. 88 (12), 1354-1361 (1999).</li><li>Li, Y., Williams, T. D., Schowen, R. L., Topp, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+protein+structure+in+amorphous+solids+using+hydrogen/deuterium+exchange+with+mass+spectrometry.">Characterizing protein structure in amorphous solids using hydrogen/deuterium exchange with mass spectrometry.</a> Anal. Biochem. 366 (1), 18-28 (2007).</li><li>Sinha, S., Li, Y., Williams, T. D., Topp, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+conformation+in+amorphous+solids+by+FTIR+and+by+hydrogen/deuterium+exchange+with+mass+spectrometry.">Protein conformation in amorphous solids by FTIR and by hydrogen/deuterium exchange with mass spectrometry.</a> Biophys. J. 95 (12), 5951-5961 (2008).</li><li>Iyer, L. K., Moorthy, B. S., Topp, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photolytic+labeling+to+probe+molecular+interactions+in+lyophilized+powders.">Photolytic labeling to probe molecular interactions in lyophilized powders.</a> Mol. Pharm. 10 (12), 4629-4639 (2013).</li><li>Hentze, N., Mayer, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyzing+protein+dynamics+using+hydrogen+exchange+mass+spectrometry.">Analyzing protein dynamics using hydrogen exchange mass spectrometry.</a> J. Vis. Exp. (81), e50839 (2013).</li><li>Kaltashov, I. A., Bobst, C. E., Abzalimov, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=H/D+exchange+and+mass+spectrometry+in+the+studies+of+protein+conformation+and+dynamics:+is+there+a+need+for+a+top-down+approach.">H/D exchange and mass spectrometry in the studies of protein conformation and dynamics: is there a need for a top-down approach.</a> Anal. Chem. 81 (19), 7892-7899 (2009).</li><li>Jumper, C. C., Schriemer, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometry+of+laser-initiated+carbene+reactions+for+protein+topographic+analysis.">Mass spectrometry of laser-initiated carbene reactions for protein topographic analysis.</a> Anal. Chem. 83 (8), 2913-2920 (2011).</li><li>Li, Y., Williams, T. D., Topp, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+excipients+on+protein+conformation+in+lyophilized+solids+by+hydrogen/deuterium+exchange+mass+spectrometry.">Effects of excipients on protein conformation in lyophilized solids by hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry.</a> Pharm. Res. 25 (2), 259-267 (2008).</li><li>Li, Y., Williams, T. D., Schowen, R. L., Topp, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trehalose+and+calcium+exert+site-specific+effects+on+calmodulin+conformation+in+amorphous+solids.">Trehalose and calcium exert site-specific effects on calmodulin conformation in amorphous solids.</a> Biotechnol. Bioeng. 97 (6), 1650-1653 (2007).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

وأشارت العديد من الدراسات إلى أن البيئة المحلية في عينات مجفف بالتجميد يؤثر تدهور البروتين 5،29،30. ومع ذلك، إقامة علاقة مباشرة بين بنية البروتين والاستقرار في الحالة الصلبة لم يكن ممكنا بسبب عدم وجود طرق تحليلية عالية الدقة. تطبيق أساليب عالية الدقة القائمة مثل HDX وPL لمساحيق مجفف بالتجميد يتطلب تعديل بروتوكولات حل وتفسير البيانات دقيق. وقد تم اعتماد HDX-MS وPL-MS تباعا لمراقبة التشكل البروتين في الحالة الصلبة. النتائج قدمت هنا وفي أماكن أخرى 27،28،31-33 أثبتت قدرة هذه الأساليب لمراقبة البروتين التشكل مع ارتفاع القرار في البيئة الصلبة. على الرغم من الخطوات الحاسمة في تحليل البيانات لا تختلف من وضع العلامات في حل 34-36، يطلب من الاعتبارات الهامة أثناء الإعداد التجريبية وتفسير البيانات عن كيماوية الحالة الصلبةوضع العلامات كال. يجب أن يستند اختيار كاشف وضع العلامات على حجم وآلية وضع العلامات. صغر حجم الديوتيريوم يسمح العمود الفقري الببتيد التي تبحث بسهولة، في حين أن حجم أكبر نسبيا من pLeu يحد وضع العلامات للجانب سلاسل. كلا ssHDX وSSPL لا تظهر أي تفضيل لأي من الأحماض الأمينية، بحيث وضع العلامات يعتمد فقط على العمود الفقري وجنبا إلى سلسلة التعرض لالمصفوفة. للتحقيق بشكل فعال التشكل البروتين في الحالة الصلبة، والعوامل الخارجية التي تؤثر على عملية وضع العلامات يجب أن تسيطر عليها بعناية. المبلغ الإجمالي والتوزيع المكاني للوكيل وضع العلامات في المواد الصلبة مجفف بالتجميد يختلف عن المحاليل المائية. في ssHDX، ومقدار D 2 O في المصفوفة الصلبة قد تؤثر على معدل البروتين تتكشف (أو الجزئي تتكشف)، refolding، وتبادل الديوتيريوم. ليست هذه هي الحال مع حل HDX، والتي يتم تخفيف العينة البروتين عادة مع حجم وافرة من D 2 O.فحص دقيق للآثار الماء على معدل ssHDX يمكن أن تبلغ اختيار الظروف RH مثالية. للسيطرة على معدل الامتصاص الرطوبة وتجنب انهيار المسحوق في التركيبات التي تحتوي على سواغ استرطابي (مثل السكروز وطرهالوز)، ssHDX يمكن القيام بها في ظل ظروف المبردة (2-8 درجة مئوية). دراستنا السابقة بشأن آثار الماء أظهرت معدل ومدى التبادل زادت مع زيادة في نسبة الرطوبة، كما هو متوقع. في الكثير من عملنا، وهي RH المتوسط ​​من 43٪ في 5 ° C وقد ثبت أن تكون مثالية للتمييز الصيغ في فترة زمنية معقولة 24. وعادة ما يتم اجراء التفاعل حتى يتم التوصل إلى الهضبة. وهذا يضمن أن الامتصاص الرطوبة ونشرها في صلب لا تسيطر على معدل HDX. استخدام أحجام العينات الصلبة صغيرة مع حجم ما قبل تجفيد من ≤2 مل يساعد أيضا على ضمان الامتصاص بخار D 2 O اكتمال أساسا في الفترة الصرف في وقت مبكر. يوفر الرغم ssHDX-MSمعلومات كمية عن التشكل من البروتين في الحالة الصلبة، وهناك شروط معينة، حيث تفسير البيانات لا يمكن أن يستند كليا على دراسة ssHDX وحدها. ومن الممكن أن امتصاص الديوتيريوم انخفضت لوحظ في عينة (بالمقارنة مع السيطرة) قد يكون راجعا إلى زيادة نسبة الاحتفاظ بنية البروتين أو كمية كبيرة من المجاميع البروتين الموجودة في العينة. في مثل هذه الحالة، وتفسير البيانات ssHDX يتطلب النتائج من وسائل تكميلية أخرى. وقد لوحظ توسيع الذروة في أطياف الشامل بالديوتيريوم لعدة تركيبات ميغابايت 27،28. وهذا يمكن أن يكون راجعا إلى عوامل مختلفة مثل وجود السكان البروتين تكشفت جزئيا، والتباين المكاني في العينة، أو التدرجات المكانية في تركيز D 2 O. ومع ذلك، لم تتميز هذه العوامل في ssHDX-MS وتحتاج إلى مزيد من التحقيق. كما SSPL-MS هو جديد نسبيا بالمقارنة مع الطرق الأخرى، والتعلم المستمر من أساسهامن تطبيقاتها والقيود هو مطلوب. في SSPL، ومجفف بالتجميد للصورة عبر رابط مع البروتين. عدم وجود رطوبة يحد من تنقل عناصر داخل المصفوفة الصلبة، والاسترخاء الهيكلي الجزئي التي قد تحدث مع الامتصاص الرطوبة في ssHDX ليس ظاهرة في SSPL. وهذا يحد وضع العلامات في SSPL إلى المنطقة المجاورة مباشرة للالصورة عبر رابط. ولكن، خلافا HDX-MS، MS تحليل / MS من البروتين المسمى تساهميا يمكن أن توفر معلومات هيكلية على مستوى بقايا. منذ وضع العلامات SSPL هو التساهمية ولا رجعة فيه، والعودة لا يحدث التبادل وعينات يمكن إعداد وتحليلها دون القلق من فقدان التسمية. لتسهيل نشر وكيل وضع العلامات وتحسين الكفاءة في وضع العلامات الصلبة المصفوفة، SSPL يمكن أداؤها مع زيادة٪ RH. يمكن أيضا تحسين pLeu امتصاص عن طريق زيادة تركيز وكيل photoreactive. نسبة المولي من البروتين لpLeu يمكن أن تختلف كما تريد. بشكل عام، فائض 100X ضرس pLeu إلى proسوف البروتين ضمان وضع العلامات كاف. ومع ذلك، قد يؤدي ارتفاع تركيز pLeu في فقدان البروتين هيكل العالي في المصفوفة الصلبة. ومن هنا، بالإضافة إلى حركية وضع العلامات وتكوين صياغة ويجب أيضا أن تستند اختيار تركيز pLeu على الحفاظ على السلامة الهيكلية البروتين. كما pLeu تسميات nonselectively XH (حيث X = C، N، O) مجموعة، فمن الممكن أن سواغ مع مواقع العلامات مماثلة يمكن أن تؤثر بشكل كبير على مستوى وضع العلامات البروتين. وبعد أن تتسم تدخل سواغ في توافر pLeu لوضع العلامات البروتين. ومن المعروف أن carbene المتولدة من تفعيل diazirine لا بقايا محددة، لكن تقارير دراسة واحدة التحيز نحو آسيا والمحيط الهادئ وحمض الغلوتاميك 36. في حين انه لامر جيد لمعرفة المزيد عن التفاعلات بقايا محددة، المعلومات الببتيد المستوى هو أيضا مفيدة، ويمكن استخدامها لتصميم سواغ لمنع التعرض المناطق مع ارتفاع مصفوفة في الحالة الصلبة. يوفر SSPL-MS معلومات نوعية مفصلة، ​​ولكنيحتاج البيانات الكمية التي يمكن الحصول عليها وتحتاج إلى مقاييس قوية لتطوير لتحليل الاختلافات صياغة عبر مجموعة متنوعة من أنظمة مجفف بالتجميد. يمكن استخدام تسمية بقايا محددة جنبا إلى جنب مع تحليل MS / MS مواصلة تعزيز قرار إلى مستوى الأحماض الأمينية. الكواشف وضع العلامات مثل 2،3-butanedione لتسمية الارجنتين، N المشتقات -hydroxysuccinimide لليز وN المشتقات -alkylmaleimide لالسيستئين يمكن استخدامها لرسم خريطة بدقة التفاعلات الجزيئية في مسحوق مجفف بالتجميد. ولكن هذه الكواشف هي التي تعتمد على درجة الحموضة وربما لا تكون ردود الفعل كما تسيطر عليها بشكل جيد كما وصفها الضوئي في الحالة الصلبة. نهج بديل هو دمج للصورة عبر رابط في تسلسل البروتين مع استخدام خطوط الخلايا بعامل نمائي، الطفرات موقع الموجه أو سلسلة جانبية الاشتقاق. وقد أظهرت لنا ssHDX-MS وSSPL-MS الدراسات السابقة أن وضع العلامات من البروتين يعتمد على طبيعة ومقدار سواغتستخدم 24،27،28،31-33،37،38. ssHDX-MS من ميغابايت شارك مجفف بالتجميد مع غوانيدين هيدروكلوريد (Gdn.HCl) أظهرت زيادة امتصاص الديوتيريوم من ميغابايت شارك مجفف بالتجميد مع المنخفضة الوزن الجزيئي السكريات 32. في دراسة SSPL-MS منفصلة، ​​ميغابايت شارك مجفف بالتجميد مع Gdn.HCl أظهرت قدرا أكبر من الحماية من وضع العلامات الضوئي من ميغابايت مع السكروز 33. وعلاوة على ذلك، والقياسات الكمية من ssHDX-MS قد ترتبط إلى حد كبير مع استقرار البروتين أثناء التخزين على المدى الطويل 28. وتشير هذه الدراسات إلى أن ssHDX أو SSPL من البروتين يعكس مدى الاحتفاظ الهيكلي من البروتين في مسحوق مجفف بالتجميد. ونحن نعتقد أن الإبقاء على هيكل الثانوي في مساحيق مجفف بالتجميد يوفر بيئة مواتية لوضع العلامات سلسلة جنب مع pLeu وحماية أميد الهيدروجين من الصرف الديوتيريوم. ومع ذلك، مقارنة تفصيلية للمحتوى إعلامي من هذه الطرق تحتاج إلى القيام بها في المستقبل. على الرغم من إنشاء فائدة ssHDX-MS وSSPL-MSكأداة فحص صياغة سيتطلب في نهاية المطاف أن يتم تطبيقها على العديد من البروتينات، والنتائج من دراستنا الأخيرة تدعم اعتماد نطاق واسع. مع مزيد من التطوير، ومن المتوقع أن تكون مفيدة على نطاق واسع لوصف تركيبات البروتين الحالة الصلبة في الصناعة الصيدلانية البيولوجية هذه الأساليب.

الأدوية البروتينية هي أسرع القطاعات نموا في صناعة المستحضرات الصيدلانية الحيوية وتوفر علاجات جديدة واعدة لعلاج أمراض مستعصية في السابق، بما في ذلك اضطرابات هرمونية، وأمراض السرطان وأمراض المناعة الذاتية 1. في عام 2012، وصلت في السوق العالمي biotherapeutics 138000000000 $، ومن المتوقع أن تصل إلى 179000000000 $ بحلول عام 2018 2. البروتينات هي أكبر وأكثر هشاشة من المخدرات جزيء صغير التقليدية وهكذا هي أكثر عرضة لأنواع عديدة من التدهور 3. لضمان ملائمة الجرف الحياة والاستقرار، وغالبا ما يتم وضعها الأدوية البروتينية مثل مجفف بالتجميد (أي تجميد المجفف) مساحيق الصلبة. ومع ذلك، قد بروتين لا يزال يخضع التدهور في الحالة الصلبة، وخاصة إذا لم يتم الحفاظ على هيكلها الأصلي خلال 4،5 عملية تجفيد. ضمان تم الاحتفاظ هذا الهيكل غير ممكنا إلا إذا كانت هناك طرق التحليل التي يمكن تحقيق البروتين التشكل في دولة متينة مع sufficienر القرار. NMR الطيفي 6 و البلورات بالأشعة السينية 7 هي الأساليب عالية الدقة تستخدم عادة لتقييم بنية البروتين في حل والمواد الصلبة البلورية 8. ونظرا لطبيعة سواغ وطرق المعالجة المستخدمة، تركيبات البروتين مجفف بالتجميد وعادة ما تكون غير متبلور بدلا من 9 البلورية. عدم وجود التجانس والنظام المجهري يجعل التقنيات المذكورة أعلاه غير عملي للبروتينات في المواد الصلبة غير متبلور. تحويل فورييه الطيفي بالأشعة تحت الحمراء (FTIR) 10، 11 رامان الطيفي والقريب الطيفي بالأشعة تحت الحمراء (الجرد) 12 وقد استخدمت بانتظام من قبل الصناعة الصيدلانية البيولوجية للمقارنة البروتين هيكل الثانوي في مساحيق مجفف بالتجميد إلى أن من هيكل للدولة حل الأصلي. ومع ذلك، وهذه الأساليب هي دقة منخفضة ويمكن أن توفر معلومات عن التغيرات العالمية في هيكل الثانوي فقط. توصيف الهيكلي الحالة الصلبة باستخدام FTIRوقد أظهرت إما ضعيفة أو فقيرة 13،14 15 العلاقة مع استقرار التخزين على المدى الطويل. هذه القيود تسلط الضوء على الحاجة إلى أساليب مناسبة عالية الدقة لتحديد الاضطرابات الهيكلية البروتين في الحالة الصلبة. وقد برزت العلامات الكيميائية إلى جانب التحلل البروتيني والتحليل الطيفي الشامل باعتبارها نهجا قويا لمراقبة بنية البروتين والتفاعلات الجزيئية في محلول مائي. في تطوير المستحضرات الصيدلانية، وقد استخدمت HDX-MS لرسم خرائط حاتمة في ضد مستضد التفاعلات 16،17، لرسم خريطة التفاعلات مستقبلات المخدرات 18، لرصد آثار التعديلات بعد متعدية على التشكل من المخدرات البروتين 19، وللمقارنة تباين دفعة إلى دفعة في تطوير البدائل الحيوية 20. وبالمثل، استخدمت بروابط photoactivatable لتحديد أهداف المخدرات وتحديد تقارب ملزمة وخصوصية التفاعلات المخدرات مستقبلات 21،22. إلى البريدXTEND تطبيق هذه الأساليب لتركيبات مجفف بالتجميد، وقد وضعت مجموعتنا الحالة الصلبة الطيف الصرف الديوتريوم الهيدروجين كتلة (ssHDX-MS)، والحالة الصلبة قياس الطيف الضوئي وضع العلامات الجماعية (SSPL-MS) لدراسة التشكل البروتين والتفاعلات سواغ في عينات مجفف بالتجميد مع ارتفاع القرار. في كل ssHDX-MS وSSPL-MS، يسمى البروتين تحت ظروف التفاعل المثالية في المواد الصلبة مجفف بالتجميد، ومن ثم يتم إعادة تشكيل العينات وتحليلها بواسطة مطياف الكتلة مع أو بدون هضم بروتين. يوفر ssHDX-MS معلومات عن التعرض الرئيسي لبخار الديوتيريوم السلسلة، في حين يوفر SSPL-MS المعلومات عن البيئة من السلاسل الجانبية (الشكل 1). طريقتين بالتالي يمكن أن توفر معلومات تكميلية حول التشكل البروتين في الحالة الصلبة. هنا، ونحن نقدم بروتوكول عام لدراسة البروتينات في المواد الصلبة باستخدام مجفف بالتجميد ssHDX-MS وSSPL-MS (الشكل 2)، وذلك باستخدام ميجا بايت كمابروتين نموذج. نقدم لك مجموعة من قدرة طريقتين للتمييز الاختلافات في التركيبات مع اثنين من سواغ مختلفة. <img alt="الشكل (1)" src="/files/ftp_upload/52503/52503fig1.jpg" /> الشكل 1: ssHDX وSSPL بنية البروتين الإجراء في المواد الصلبة مجفف بالتجميد من خلال آليات وضع العلامات المختلفة (A) في HDX، وأميد العمود الفقري الهيدروجين التبادل مع الديوتيريوم بوصفها وظيفة من بنية البروتين وD 2 O للمعاقين. في الحالة الصلبة، ومعدل ومدى التبادل الديوتيريوم تعتمد على مستوى D 2 O الامتصاص، والتنقل من البروتين (تتكشف وrefolding الأحداث) وطبيعة سواغ الحالية في المصفوفة الصلبة. (ب) في PL، الأشعة فوق البنفسجية في 365 نانومتر يبدأ تشكيل carbene رد الفعل وسيطة من مجموعة وظيفية diazirine من pLeu ويتم إدراجها غير تحديدا في أي السندات XH (X = أي ذرة)، أو إعلاندائرة التنمية الاقتصادية عبر = C السندات C في جوارها المباشر. في الحالة الصلبة، ومعدل ومدى وضع العلامات تعتمد على التركيز المحلي من وكيل وضع العلامات، والوقت التشعيع، بنية البروتينات وطبيعة سواغ الحالية في المصفوفة الصلبة. وحات A و B تظهر أقصى وضع العلامات النظرية التي يمكن أن تحدث في العمود الفقري وجنبا إلى سلاسل على التوالي في البروتين. <img alt="الشكل 2" src="/files/ftp_upload/52503/52503fig2.jpg" /> الشكل 2: عرض تخطيطي الحالة الصلبة HDX-MS (A) وPL-MS (B) للبروتين في صياغة مجفف بالتجميد.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" >
	<tbody>
		<tr >
			<td >Name of Material/ Equipment</td>
			<td >Company</td>
			<td >Catalog Number</td>
			<td >Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Equine myoglobin</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td>M0630-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >D-(+)-Trehalose dihydrate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td >#T9531</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >D-Sorbitol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td >#240850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >L-Photo-leucine</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td >#22610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Potassium phosphate monobasic</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >#P0662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Potassium phosphate dibasic</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >#P3786</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Deuterium Oxide</td>
			<td>Cambridge Isotope Laboratories</td>
			<td >#DLM-4-PK</td>
			<td>Alternate (Cat. No.: 151882, Sigma-Aldrich)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Immobilized pepsin</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td >#2-3132-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Trypsin</td>
			<td>Promega</td>
			<td >#V511A</td>
			<td>Chymotrypsin (Cat. No.: #V1062, Promega) can be additionally used</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Water, Optima LC/MS grade</td>
			<td >Fisher Chemical</td>
			<td >#7732-18-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Acetonitrile</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >#34998</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Formic acid</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td >#28905</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ESI-TOF Calibrant</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td >#G1969-85000</td>
			<td>Highly flammable liquid</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Protein microtrap</td>
			<td>Michrom Bioresources</td>
			<td >TR1/25108/03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Peptide microtrap</td>
			<td>Michrom Bioresources</td>
			<td >TR1/25109/02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Analytical column</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td >Zorbax 300SB-C18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Freeze dryer</td>
			<td>VirTis AdVantage Plus</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Stratalinker equipped with five 365 nm lamps</td>
			<td>Stratagene Corp.</td>
			<td >Stratalinker 2400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >HPLC</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td >1200 series LC</td>
			<td>Refrigerated LC system for HDX-MS</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ESI-qTOF MS</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td >6520 qTOF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >HDExaminer (HDX-MS data analysis software)</td>
			<td >Sierra Analytics</td>
			<td ></td>
			<td>http://www.massspec.com/HDExaminer.html</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mass spectrometric approaches to study protein structure and interactions in lyophilized powders

أميد الهيدروجين / تبادل الديوتيريوم (ssHDX-MS)، وجنبا إلى سلسلة العلامات التحلل الضوئي (SSPL-MS)، يليه التحليل الطيفي الشامل يمكن أن يكون قيما للتميز تركيبات مجفف بالتجميد من العلاجات البروتين. وضع العلامات تليها الهضم بروتين مناسب يسمح للبنية البروتين والتفاعلات ليتم تعيينها لقرار على مستوى الببتيد. منذ البروتين واستقرت العناصر الهيكلية من خلال شبكة من الروابط الكيميائية من سلاسل الرئيسية والجانبية سلاسل من الأحماض الأمينية، ووضع العلامات محدد من الذرات في بقايا الأحماض الأمينية يوفر نظرة ثاقبة هيكل والتشكل من البروتين. وعلى النقيض من الأساليب الروتينية تستخدم لدراسة البروتينات في المواد الصلبة مجفف بالتجميد (على سبيل المثال، FTIR)، ssHDX-MS وSSPL-MS توفير المعلومات الكمية وللموقع المحدد. مدى التأسيس الديوتيريوم والمعلمات الحركية يمكن أن تكون ذات صلة بسرعة وببطء تبادل حمامات الأميد (سريع N، N بطيئة)، ويعكس بشكل مباشر على درجةري للطي البروتين وهيكل في تركيبات مجفف بالتجميد. وضع العلامات الضوئي مستقر لا يخضع العودة الصرف، وميزة على ssHDX-MS. هنا، ونحن نقدم بروتوكولات وإجراءات تفصيلية لكلا ssHDX-MS وSSPL-MS، وذلك باستخدام الميوجلوبين (ميغابايت)، وبروتين نموذج في تركيبات مجفف بالتجميد تحتوي إما طرهالوز أو السوربيتول.

هنا، وقد استخدمت ssHDX-MS وSSPL-MS إلى دراسة تأثير سواغ على التشكل والحالة الصلبة تفاعلات تشكيلات ميغابايت مجفف بالتجميد. ونظرا لتركيزات البروتين وسواغ المستخدمة في هذه الدراسة في الجدول 1. ممثل النتائج من ssHDX-MS وSSPL-MS تحليل ميجا بايت مجفف بالتجميد الحصول عليها عن طريق اتباع يتم عرض البروتوكولات المذكورة أعلاه. امتصاص الديوتيريوم في مستوى البروتين سليمة ssHDX-MS قادر على التمييز بين التركيبات ميجا بايت على مستوى سليمة. أظهر أطياف الشامل deconvoluted من ميغابايت سليمة التالية 144 ساعة من ssHDX من MBS صياغة زيادة امتصاص الديوتيريوم من صياغة الدبابة (الشكل 3A). في المتوسط، وأظهرت MBS أكبر 46٪ امتصاص الديوتيريوم من الدبابة (الجدول 2). <img alt="الشكل (3)" src="/files/ftp_upload/52503/52503fig3.jpg"/&gt; الشكل 3: ssHDX-MS لميغابايت سليمة: (A) Deconvoluted الأطياف كتلة ميغابايت سليمة بالديوتيريوم من الصيغ الدبابة (خط الصلبة) وMBS (خط متقطع) بعد 144 ساعة من ssHDX. يظهر الطيف الشامل deconvoluted من ميغابايت سليمة undeuterated أيضا (الخط المنقط). (B) حركية ssHDX لميغابايت سليمة في تركيبات الدبابة (خط الصلبة) وMBS (خط متقطع). تم تركيبها على مدار الساعة من ssHDX إلى معادلة لمدة المرحلة جمعية الأسي باستخدام الرسم البياني الوسادة بريزم البرمجيات الإصدار 5 (ن = 3، ± SD). حركية بالديوتريوم لMBS سليمة والدبابة متشابهة في نقاط زمنية مبكرة (1-4 ساعة)، ولكن MBS أظهرت زيادة التبادل الديوتيريوم مع الزيادة في الوقت المناسب (8-144 ساعة) (الشكل 3B). وهذا يشير إلى أهمية اختيار نقطة زمنية أطول لssHDX في انخفاض RH ودرجة الحرارة الظروف. أيضا، والامتصاص والانتشار 2 O عملية D قد تؤثر على معدل ssHDX في بو الوقت مبكر[إينتس]. وقد أظهرت دراساتنا السابقة أن الامتصاص الرطوبة في ssHDX اكتمال في فترة من ساعة، ولها مساهمة الحد الأدنى لتبادل حركية وراء هذا الوقت. وبالتالي فإن معدل وحظ ومدى الصرف ليست مجرد تدابير D 2 O الادمصاص 27،28. وأشرطة الخطأ صغيرة في الشكل 3B، مشيرا إلى الانحرافات المعيارية من ثلاث عينات ssHDX-MS مستقلة، وتبين أن التجربة هي استنساخه للغاية. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td></td><td> الديوتيريوم امتصاص (٪) ب </td><td> N سريعة ج </td><td> ك ج سريعة </td><td> N بطيئة ج </td><td> ك بطيئة ج </td></tr><tr><td> MBT ل </td><td> 15.9 ± 0.5 </td><td> 13.1 (0.8) </td><td> 0.43 (0.03) </td><td> 11.0 (0.9) </td><td> 0.019 (0.001) </td></tr><tr><td> MBS ل </td><td> 23.2 ± 0.5 </td><td> 15.4 (0.7) </td><td> 0.49 (0.04) </td><td> 19.2 (0.6) </td><td> 0.024 (0.002) </td></tr><tr><td> نسبة التغيير د </td><td> 46٪ </td><td> 18٪ </td><td> 14٪ </td><td> 75٪ </td><td> 26٪ </td></tr></tbody></table> الجدول 2: تدابير الكمية من امتصاص الديوتيريوم في الدراسات ssHDX من الصيغ ميجا بايت) أ (انظر الجدول رقم 1 لتكوين ب نسبة الديوتيريوم امتصاص نسبة إلى الحد الأقصى النظري من قبل ميغابايت سليمة بعد 144 ساعة من HDX في 5 ° C، 43٪ RH (ن = 3. ، يعني ± SD). ج المعلمات التي تحددها الانحدار غير الخطية من البيانات الحركية ssHDX-MS. تم تركيب دوام الصرف الديوتيريوم لحالها ميجا بايت إلى نموذج جمعية biexponential (ؤ 2). القيم بين قوسين هي الأخطاء المعيارية من المعلمات الانحدار. د وكان التغيير في المئة في القياسات CALCUL<html> كما ated 100 × [(القيمة من MBS - القيمة من MBT) / (قيمة من MBT)]. يتم إعطاء المعلمات الانحدار (سريع N، N بطيئة، ك سريعة وبطيئة ك) لحركية امتصاص الديوتيريوم للMBT وMBS في الجدول 2. على الرغم من أن N القيم سريعة وبطيئة N هي أكبر للMBS من الدبابة، والاختلافات في N بطيئة كانت قيم أكبر من الاختلافات في القيم N سريعة. على وجه التحديد، وقيمة سريعة N هي 18٪ فقط أكبر في MBS من في الدبابة، في حين أن قيمة بطيئة N هي 75٪ أكبر في MBS من في الدبابة. وهذا يوحي بأن N القيم بطيئة أصغر في الدبابة قد يكون راجعا إلى زيادة نسبة الاحتفاظ بنية ميجا بايت أو حماية الفئات أميد التي كتبها سواغ التي تتعرض لD 2 O في MBS. ومع ذلك، لا يفهم بوضوح آليات مفصلة. الثوابت معدل (K سريعة وبطيئة ك) لكل من الصيغ متشابهة جدا. معشوقة = &quot;jove_content&quot;&gt; امتصاص الديوتيريوم على مستوى الببتيد وبعد البيبسين الهضم، تم تحديد ما مجموعه 52 الببتيدات. واستخدمت ست شظايا غير زائدة عن الحاجة المقابلة إلى 100٪ من تسلسل ميجا بايت لتحليل ذكرت هنا. يمكن الحصول على معلومات إضافية باستخدام شظايا متداخلة، كما ذكرت من قبل مجموعتنا سابقا 24. تم احتساب امتصاص الديوتيريوم في المئة لكل الببتيد والنتائج من 144 عينات ساعة تآمر (الشكل 4A). وأظهرت حركية HDX لشظايا الهضمية ستة السلوك biexponential (الشكل 4B)، بما يتفق مع مجموعات سكانية فرعية من الهيدروجين الأميد تمر الصرف &quot;سريع&quot; و &quot;بطيء&quot;. <img alt="الشكل (4)" src="/files/ftp_upload/52503/52503fig4.jpg" /> الشكل 4: ssHDX-MS لميغابايت على مستوى الببتيد: (A) امتصاص نسبة الديوتيريوم لمدة 6 غير redu-شظايا الهضمية ndant من ميغابايت في تركيبات الدبابة (الرمادي) وMBS (أبيض) بعد 144 ساعة من HDX. حركية (B) ssHDX لمدة ستة أجزاء الهضمية غير زائدة من ميغابايت في تركيبات الدبابة (خط الصلبة) وMBS (خط متقطع). تم تركيبها على مدار الساعة من ssHDX إلى معادلة لمدة المرحلة جمعية الأسي باستخدام الرسم البياني الوسادة بريزم البرمجيات الإصدار 5 (ن = 3، ± SD). وتعرض المعلمات الانحدار لالببتيدات nonredundant في الشكل 5. والثوابت معدل المجهزة لشظايا الببتيد ليست هي متوسط ​​معدل ثابت للالأميدات الفردية، والثوابت معدل احظ لشظايا الهضمية لا يمكن أن تكون ذات صلة خطيا لتلك للبروتين سليمة. وكانت N القيم سريعة لمعظم أجزاء الهضمية (باستثناء جزء 56-69) في تركيبات MBS أكبر قليلا من تلك التي في الدبابة (الشكل 5A). وبالمثل، أظهر قيم k السريعة عموما اختلاف بسيط بين formulatioنانوثانية وفي مناطق مختلفة من جزيء ميجا بايت (الشكل 5B). ومع ذلك، فإن N القيم بطيئة بطيئة وك لMBS هي أكبر بكثير في جميع أجزاء من لMBT (الشكل 5C و5D). قد يعكس الزيادة الكبيرة في N ك بطيئة وبطيئة للMBS المزيد من التنقل من مجموعات أميد في &quot;بطيئة&quot; تبادل حمامات. <img alt="الرقم 5" src="/files/ftp_upload/52503/52503fig5.jpg" /> الشكل 5: معلمات الحركية ssHDX لميغابايت الببتيدات الهضمية: N بسرعة (A)، (ك) سريع (B)، N بطيئة (C) و K بطيئة (D) القيم التي تم الحصول عليها من الانحدار غير الخطية من البيانات الحركية ssHDX-MS لمدة ستة الببتيدات الهضمية غير زائدة من ميغابايت في تركيبات الدبابة (الرمادي) وMBS ( أبيض) (ن = 3، ± SE). &lt;/ P&gt; وضع العلامات الضوئي في مستوى البروتين سليمة ميغابايت المشع في وجود فائض 20x وpLeu شكلت متعددة MB-pLeu adducts، والكشف عنها من قبل LC-MS (الشكل 6A). أطياف deconvoluted لMBT المشع لمدة 40 دقيقة مع 20x وأظهرت pLeu تصل إلى 3 تسميات مع إضافة +115، +230 +345 ودا لكتلة ميجا بايت غير المسماة. MBS المشع بالمثل مع 20x وأظهر pLeu أقل امتصاص pLeu على مستوى سليمة، مع ما يصل الى 2 السكان المسمى الكشف عنها من قبل LC-MS. <img alt="الشكل (6)" src="/files/ftp_upload/52503/52503fig6.jpg" /> الشكل 6: SSPL-MS لميغابايت سليمة: (A) Deconvoluted أطياف الكتلة لMBT (خط الصلبة) وMBS (خط متقطع) المسمى مع 20x والفائض (5٪ ث / ث) pLeu. ويظهر Deconvoluted الطيف الشامل للالأصلي ميغابايت (MB مجفف بالتجميد والمشع في غياب pLeu) كما خط منقط. U </م&gt; يدل على السكان من البروتين الذي لا يزال ليس لها علامة بعد التشعيع. ويمثل السكان من البروتين يحمل 1 و 2 و 3 بطاقات pLeu كما 1L، 2L و3L على التوالي. حركية (B) SSPL-MS لميغابايت سليمة في تركيبات الدبابة (الدوائر المغلقة) وMBS (دوائر مفتوحة) كدالة للتركيز pLeu. تم المشع جميع العينات لمدة 40 دقيقة. أشرطة الخطأ تقع ضمن حرف. (C) حركية SSPL-MS لميغابايت سليمة في تركيبات الدبابة (الدوائر المغلقة) وMBS (دوائر مفتوحة) مجفف بالتجميد والمشع في وجود 100X الزائد pLeu (20.7٪ ث / ث) بوصفها وظيفة من الزمن التشعيع. أشرطة الخطأ تقع ضمن حرف. في الدراسات الحركية، زادت في المئة من البروتين المسمى أضعافا مضاعفة لكل من الدبابة وMBS مع زيادة الوقت التشعيع (الشكل 6B). أظهر MBS أقل امتصاص pLeu من الدبابة في كل مرة التشعيع. وبدا كل من الصيغ للوصول إلى الهضبة في 40 دقيقة. وهكذا، يمكن دراسة الحركية أن يكون لنا<html> eful لتحديد مدة التشعيع اللازمة للحصول على تفعيل pLeu كاملة. وقد درس أيضا حركية وضع العلامات بوصفها وظيفة من تركيز pLeu (الشكل 6C). زادت في المئة من البروتين المسمى مع تركيز pLeu لكل من الدبابة وMBS. ومع ذلك، في 20.7٪ ث / ث pLeu، أظهرت الدبابة انخفاض في pLeu امتصاص. قد يكون هذا بسبب استبعاد pLeu من سطح البروتين في ارتفاع تركيز pLeu. وبالتالي، ينبغي إجراء دراسة مع تركيز pLeu متفاوتة لتحديد تركيز pLeu المناسب الذي يسمح لوضع العلامات كافية عبر سطح البروتين دون إقصاء السطح. في هذه الدراسة، تم اختيار 20x والزائد pLeu لمزيد من الدراسات على مستوى الببتيد. انخفض عموما وضع العلامات لاحظ لMBS تشير الفقراء جنبا إلى سلسلة الوصول إلى مصفوفة تحتوي على pLeu. وهذا يتفق مع تغيير متعلق بتكوين في وجود السوربيتول الذي يؤدي إلى انخفاض العلامات. المحتوى &quot;&gt; وضع العلامات التحلل الضوئي على مستوى الببتيد وبناء على دراسات وضع العلامات البروتين سليمة، وقد تم اختيار 20x والزائد pLeu لمقارنة الدبابة وMBS على مستوى الببتيد. تم هضمها عينات المسمى مع التربسين وتحليلها بواسطة LC-MS. تم الكشف عن ما مجموعه 40 الببتيدات الموافق 100٪ من تسلسل ميجا بايت لMBT وMBS العينات. في بعض الحالات، قد توفر الهضم زيتية تغطية محدودة تسلسل البروتين إذا وصفت اليس و / أو الارجنتين المخلفات بشكل كبير. لتحسين التغطية تسلسل، وهي مزيج من التربسين كيموتربسين ويمكن أن تستخدم لهضم البروتين المسمى. <img alt="الرقم 7" src="/files/ftp_upload/52503/52503fig7.jpg" /> الرقم 7: SSPL-MS لميغابايت على مستوى الببتيد: كارتون تمثيل ميجا بايت المسمى مع 20x والزائد pLeu (5٪ ث / ث) في وجود طرهالوز (A) والسوربيتول (B). تم هضم البروتين المسمى مع trypsiن والببتيدات وصفت تم تعيينها إلى التركيب البلوري للميجا بايت (PDB ID 1WLA). يتم تلوين المناطق وصفت وغير المسماة أرجواني والأخضر، على التوالي. SSPL-MS مع الهضم التربسين يوفر معلومات نوعية حول الببتيدات وصفها. ونظرا للسكان وصفت مختلف على مستوى سليمة، وآلية منحل من وضع العلامات pLeu والاختلافات في الكفاءة التأين من الببتيدات وصفت وغير المسماة، فإنه من الصعب الحصول على المقاييس الكمية لSSPL-MS بعد الهضم. ومع ذلك، يمكن للمعلومات نوعية لا تزال توفر نظرة ثاقبة البروتين التغييرات متعلق بتكوين على مستوى الببتيد. في هذه الدراسة، وأظهرت كل من الدبابة وMBS تركيبات pLeu امتصاص في معظم أنحاء سطح البروتين. بالمقارنة مع MBS، شظايا الببتيد 32-42، 134-139 و146-153 من الدبابة وأظهرت العلامات pLeu (الشكل 7). وهذا يوحي بأن يتعرض الجانب سلاسل من هذه الأحماض الأمينية لpLeu، حيث أن اللوالب في هذه رجونانوثانية سليمة في المصفوفة الدبابة. في المقابل، والحماية من العلامات pLeu في المصفوفة MBS تتفق مع الاضطرابات الهيكلية في هذه المناطق. وبشكل عام، تشير النتائج من ssHDX-MS وSSPL-MS أن أساليب يمكن أن توفر معلومات تكميلية عالية الدقة على مستوى الببتيد حول العمود الفقري (ssHDX-MS)، وجنبا إلى سلسلة (SSPL-MS) التعرض وسواغ الآثار في تركيبات البروتين مجفف بالتجميد .

Watch this Scientific Journal Video about Mass Spectrometric Approaches to Study Protein Structure and Interactions in Lyophilized Powders at JoVE.com

Mass Spectrometric Approaches to Study Protein Structure and Interactions in Lyophilized Powders

Here, we present detailed protocols for solid-state amide hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry (ssHDX-MS) and solid-state photolytic labeling mass spectrometry (ssPL-MS) for proteins in solid powders. The methods provide high-resolution information on protein conformation and interactions in the amorphous solid-state, which may be useful in formulation design.

كتلة الطيفية المداخل لدراسة بنية البروتين والتفاعلات في مساحيق المجففة بالتبريد

Amide hydrogen/deuterium exchange (ssHDX-MS) and side-chain photolytic labeling (ssPL-MS) followed by mass spectrometric analysis can be valuable for ...

mass-spectrometric-approaches-to-study-protein-structure-interactions

Google

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Chemistry

Biochemistry

SCIENTISTS IN ACTION

15.6K Views.  Purdue University. Here, we present detailed protocols for solid-state amide hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry (ssHDX-MS) and solid-state photolytic labeling mass spectrometry (ssPL-MS) for proteins in solid powders. The methods provide high-resolution information on protein conformation and interactions in the amorphous solid-state, which may be useful in formulation design. 

Video: Mass Spectrometric Approaches to Study Protein Structure and Interactions in Lyophilized Powders

Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight (MALDI-TOF) Mass Spectrometric Analysis of Intact Proteins Larger than 100 kDa

Effectively determining masses of proteins is critical to many biological studies (e.g. for structural biology investigations). Accurate mass determination allows one to evaluate the correctness of protein primary sequences, the presence of mutations and/or post-translational modifications, the possible protein degradation, the sample homogeneity, and the degree of isotope incorporation in case of labelling (e.g. 13C labelling).
Electrospray ionization (ESI) mass spectrometry (MS) is widely used for mass determination of denatured proteins, but its efficiency is affected by the composition of the sample buffer. In particular, the presence of salts, detergents, and contaminants severely undermines the effectiveness of protein analysis by ESI-MS. Matrix-assisted laser desorption/ionization (MALDI) MS is an attractive alternative, due to its salt tolerance and the simplicity of data acquisition and interpretation. Moreover, the mass determination of large heterogeneous proteins (bigger than 100 kDa) is easier by MALDI-MS due to the absence of overlapping high charge state distributions which are present in ESI spectra.
Here we present an accessible approach for analyzing proteins larger than 100 kDa by MALDI-time of flight (TOF). We illustrate the advantages of using a mixture of two matrices (i.e. 2,5-dihydroxybenzoic acid and &#945;-cyano-4-hydroxycinnamic acid) and the utility of the thin layer method as approach for sample deposition. We also discuss the critical role of the matrix and solvent purity, of the standards used for calibration, of the laser energy, and of the acquisition time. Overall, we provide information necessary to a novice for analyzing intact proteins larger than 100 kDa by MALDI-MS.

Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight MALDI-TOF Mass Spectrometric Analysis of Intact Proteins Larger than 100 kDa

Accurate mass measurement represents an important step during the investigation of proteins. Matrix-assisted laser desorption/ionization (MALDI) mass spectrometry (MS) can be used for such determination and its key advantage is the tolerance to salts, detergents and contaminants. Here we illustrate an accessible approach for the analysis of proteins larger than 100 kDa by MALDI-MS.

بمساعدة مصفوفة الليزر الامتزاز / التأين وقت الرحلة (MALDI-TOF) قداس التحليل الطيفي من البروتينات سليمة أكبر من 100 كيلو دالتون

Effectively determining masses of proteins is critical to many biological studies (e.g. for structural biology investigations). Accurate mass ...

Analyzing Protein Dynamics Using Hydrogen Exchange Mass Spectrometry

All cellular processes depend on the functionality of proteins. Although the functionality of a given protein is the direct consequence of its unique amino acid sequence, it is only realized by the folding of the polypeptide chain into a single defined three-dimensional arrangement or more commonly into an ensemble of interconverting conformations. Investigating the connection between protein conformation and its function is therefore essential for a complete understanding of how proteins are able to fulfill their great variety of tasks. One possibility to study conformational changes a protein undergoes while progressing through its functional cycle is hydrogen-1H/2H-exchange in combination with high-resolution mass spectrometry (HX-MS). HX-MS is a versatile and robust method that adds a new dimension to structural information obtained by e.g. crystallography. It is used to study protein folding and unfolding, binding of small molecule ligands, protein-protein interactions, conformational changes linked to enzyme catalysis, and allostery. In addition, HX-MS is often used when the amount of protein is very limited or crystallization of the protein is not feasible. Here we provide a general protocol for studying protein dynamics with HX-MS and describe as an example how to reveal the interaction interface of two proteins in a complex. &#160;&#160;

Protein conformation and dynamics are key to understanding the relationship between protein structure and function. Hydrogen exchange coupled with high-resolution mass spectrometry is a versatile method to study the conformational dynamics of proteins as well as characterizing protein-ligand and protein-protein interactions, including contact interfaces and allosteric effects.

تحليل ديناميات البروتين عن طريق صرف الهيدروجين الطيف الكتلي

All cellular processes depend on the functionality of proteins. Although the functionality of a given protein is the direct consequence of its unique ...

Bio-layer Interferometry for Measuring Kinetics of Protein-protein Interactions and Allosteric Ligand Effects

We describe the use of Bio-layer Interferometry to study inhibitory interactions of subunit &#949;&#160;with the catalytic complex of Escherichia coli&#160;ATP synthase. Bacterial F-type ATP synthase is the target of a new, FDA-approved antibiotic to combat drug-resistant tuberculosis. Understanding bacteria-specific auto-inhibition of ATP synthase by the C-terminal domain of subunit &#949;&#160;could provide a new means to target the enzyme for discovery of antibacterial drugs. The C-terminal domain of &#949;&#160;undergoes a dramatic conformational change when the enzyme transitions between the active and inactive states, and catalytic-site ligands can influence which of &#949;&#39;s conformations is predominant. The assay measures kinetics of &#949;&#39;s binding/dissociation with the catalytic complex, and indirectly measures the shift of enzyme-bound &#949;&#160;to and from the apparently nondissociable inhibitory conformation. The Bio-layer Interferometry signal is not overly sensitive to solution composition, so it can also be used to monitor allosteric effects of catalytic-site ligands on &#949;&#39;s conformational changes.

The protocols here describe kinetic assays of protein-protein interactions with Bio-layer Interferometry. F-type ATP synthase, which is involved in cellular energy metabolism, can be inhibited by its &#949; subunit in bacteria. We have adapted Bio-layer Interferometry to study interactions of the catalytic complex with &#949;&#8217;s inhibitory C-terminal domain.

التداخل الحيوي طبقة لقياس حركية البروتين البروتين التفاعلات والآثار تفارغي يجند

We describe the use of Bio-layer Interferometry to study inhibitory interactions of subunit &#949;&#160;with the catalytic complex of Escherichia ...

Analyzing Protein Architectures and Protein-Ligand Complexes by Integrative Structural Mass Spectrometry

Proteins are an important class of biological macromolecules that play many key roles in cellular functions including gene expression, catalyzing metabolic reactions, DNA repair and replication. Therefore, a detailed understanding of these processes provides critical information on how cells function. Integrative structural MS methods offer structural and dynamical information on protein complex assembly, complex connectivity, subunit stoichiometry, protein oligomerization and ligand binding. Recent advances in integrative structural MS have allowed for the characterization of challenging biological systems including large DNA binding proteins and membrane proteins. This protocol describes how to integrate diverse MS data such as native MS and ion mobility-mass spectrometry (IM-MS) with molecular dynamics simulations to gain insights into a helicase-nuclease DNA repair protein complex. The resulting approach provides a framework for detailed studies of ligand binding to other protein complexes involved in important biological processes.

Mass spectrometry (MS) has emerged as an important tool for the investigation of structure and dynamics of macromolecular assemblies. Here, we integrate MS-based approaches to interrogate protein complex formation and ligand binding.

تحليل البروتين أبنية ومجمعات البروتين-يجند بالتكامل الهيكلي الكتلي

Proteins are an important class of biological macromolecules that play many key roles in cellular functions including gene expression, catalyzing ...

A Two-Step Pyrolysis-Gas Chromatography Method with Mass Spectrometric Detection for Identification of Tattoo Ink Ingredients and Counterfeit Products

Tattoo inks are complex mixtures of ingredients. Each of them possesses different chemical properties which have to be addressed upon chemical analysis. In this method for two-step pyrolysis online coupled to gas chromatography mass spectrometry (py-GC-MS) volatile compounds are analyzed during a first desorption run. In the second run, the same dried sample is pyrolyzed for analysis of non-volatile compounds such as pigments and polymers. These can be identified by their specific decomposition patterns. Additionally, this method can be used to differentiate original from counterfeit inks. Easy screening methods for data evaluation using the average mass spectra and self-made pyrolysis libraries are applied to speed up substance identification. Using specialized evaluation software for pyrolysis GS-MS data, a fast and reliable comparison of the full chromatogram can be achieved. Since GC-MS is used as separation technique, the method is limited to volatile substances upon desorption and after pyrolysis of the sample. The method can be applied for quick substance screening in market control surveys since it requires no sample preparation steps.

This method for two-step pyrolysis online coupled to gas chromatography with mass spectrometric detection and data evaluation protocol can be used for multi-component analysis of tattoo inks and discrimination of counterfeit products.

طريقه التحلل اللوني للغاز بخطوتين مع الكشف الطيفي الشامل لتحديد مكونات حبر الوشم والمنتجات المزيفة

Tattoo inks are complex mixtures of ingredients. Each of them possesses different chemical properties which have to be addressed upon chemical analysis. ...

Capillary Electrophoresis Mass Spectrometry Approaches for Characterization of the Protein and Metabolite Corona Acquired by Nanomaterials

The adsorption of biomolecules from surrounding biological matrices to the surface of nanomaterials (NMs) to form the corona has been of interest for the past decade. Interest in the bio-nano interface arises from the fact that the biomolecular corona confers a biological identity to NMs and thus causes the body to identify them as &#8220;self&#8221;. For example, previous studies have demonstrated that the proteins in the corona are capable of interacting with membrane receptors to influence cellular uptake and established that the corona is responsible for cellular trafficking of NMs and their eventual toxicity. To date, most research has focused upon the protein corona and overlooked the possible impacts of the metabolites included in the corona or synergistic effects between components in the complete biomolecular corona. As such, this work demonstrates methodologies to characterize both the protein and metabolite components of the biomolecular corona using bottom-up proteomics and metabolomics approaches in parallel. This includes an on-particle digest of the protein corona with a surfactant used to increase protein recovery, and a passive characterization of the metabolite corona by analyzing metabolite matrices before and after NM exposures. This work introduces capillary electrophoresis &#8211; mass spectrometry (CESI-MS) as a new technique for NM corona characterization. The protocols outlined here demonstrate how CESI-MS can be used for the reliable characterization of both the protein and metabolite corona acquired by NMs. The move to CESI-MS greatly decreases the volume of sample required (compared to traditional liquid chromatography &#8211; mass spectrometry (LC-MS) approaches) with multiple injections possible from as little as 5 &#181;L of sample, making it ideal for volume limited samples. Furthermore, the environmental consequences of analysis are reduced with respect to LC-MS due to the low flow rates (&#60;20 nL/min) in CESI-MS, and the use of aqueous electrolytes which eliminates the need for organic solvents.

Here we present a protocol to characterize the complete biomolecular corona, proteins, and metabolites, acquired by nanomaterials from biofluids using a capillary electrophoresis &#8211; mass spectrometry approach.

نهج قياس الطيف الكتلي للكهربائية الشعرية لتوصيف البروتين والايض كورونا المكتسبة من المواد النانوية

The adsorption of biomolecules from surrounding biological matrices to the surface of nanomaterials (NMs) to form the corona has been of interest for the ...

Covalent Labeling with Diethylpyrocarbonate for Studying Protein Higher-Order Structure by Mass Spectrometry

Characterizing a protein&#39;s higher-order structure is essential for understanding its function. Mass spectrometry (MS) has emerged as a powerful tool for this purpose, especially for protein systems that are difficult to study by traditional methods. To study a protein&#39;s structure by MS, specific chemical reactions are performed in solution that encode a protein&#39;s structural information into its mass. One particularly effective approach is to use reagents that covalently modify solvent accessible amino acid side chains. These reactions lead to mass increases that can be localized with residue-level resolution when combined with proteolytic digestion and tandem mass spectrometry. Here, we describe the protocols associated with use of diethylpyrocarbonate (DEPC) as a covalent labeling reagent together with MS detection. DEPC is a highly electrophilic molecule capable of labeling up to 30% of the residues in the average protein, thereby providing excellent structural resolution. DEPC has been successfully used together with MS to obtain structural information for small single-domain proteins, such as &#946;2-microglobulin, to large multi-domain proteins, such as monoclonal antibodies.

The experimental procedures for performing diethylpyrocarbonate-based covalent labeling with mass spectrometric detection are described. Diethylpyrocarbonate is simply mixed with the protein or protein complex of interest, leading to the modification of solvent accessible amino acid residues. The modified residues can be identified after proteolytic digestion and liquid chromatography/mass spectrometry analysis.

وضع العلامات التساهمية مع ديثيلبيروبونات لدراسة بنية البروتين الأعلى ترتيبا حسب قياس الطيف الكتلي

Characterizing a protein&#39;s higher-order structure is essential for understanding its function. Mass spectrometry (MS) has emerged as a powerful tool ...

Multi-Faceted Mass Spectrometric Investigation of Neuropeptides in Callinectes sapidus

Neuropeptides are signaling molecules that regulate almost all physiological and behavioral processes, such as development, reproduction, food intake, and response to external stressors. Yet, the biochemical mechanisms and full complement of neuropeptides and their functional roles remain poorly understood. Characterization of these endogenous peptides is hindered by the immense diversity within this class of signaling molecules. Additionally, neuropeptides are bioactive at concentrations 100x - 1000x lower than that of neurotransmitters and are prone to enzymatic degradation after synaptic release. Mass spectrometry (MS) is a highly sensitive analytical tool that can identify, quantify, and localize analytes without comprehensive a priori knowledge. It is well-suited for globally profiling neuropeptides and aiding in the discovery of novel peptides. Due to the low abundance and high chemical diversity of this class of peptides, several sample preparation methods, MS acquisition parameters, and data analysis strategies have been adapted from proteomics techniques to allow optimal neuropeptide characterization. Here, methods are described for isolating neuropeptides from complex biological tissues for sequence characterization, quantitation, and localization using liquid chromatography (LC)-MS and matrix-assisted laser desorption/ionization (MALDI)-MS. A protocol for preparing a neuropeptide database from the blue crab, Callinectes sapidus, an organism without comprehensive genomic information, is included. These workflows can be adapted to study other classes of endogenous peptides in different species using a variety of instruments.

Multi-Faceted Mass Spectrometric Investigation of Neuropeptides in Callinectes sapidus

Mass spectrometric characterization of neuropeptides provides sequence, quantitation, and localization information. This optimized workflow is not only useful for neuropeptide studies, but also other endogenous peptides. The protocols provided here describe sample preparation, MS acquisition, MS analysis, and database generation of neuropeptides using LC-ESI-MS, MALDI-MS spotting, and MALDI-MS imaging.

التحقيق الطيفي الكتلي متعدد الأوجه للببتيدات العصبية في Callinectes sapidus

Neuropeptides are signaling molecules that regulate almost all physiological and behavioral processes, such as development, reproduction, food intake, and ...

Extraction of Non-Protein Amino Acids from Cyanobacteria for Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry Analysis

Non-protein amino acids (NPAAs) are a large class of amino acids (AAs) that are not genetically encoded for translation into proteins. The analysis of NPAAs can provide crucial information about cellular uptake and/or function, metabolic pathways, and potential toxicity. &#946;-methylamino-L-alanine (BMAA) is a neurotoxic NPAA produced by various algae species and is associated with an increased risk for neurodegenerative diseases, which has led to significant research interest. There are numerous ways to extract AAs for analysis, with liquid chromatography-tandem mass spectrometry being the most common, requiring protein precipitation followed by acid hydrolysis of the protein pellet. Studies on the presence of BMAA in algal species provide contradictory results, with the use of unvalidated sample preparation/extraction and analysis a primary cause. Like most NPAAs, protein precipitation in 10% aqueous TCA and hydrolysis with fuming HCl is the most appropriate form of extraction for BMAA and its isomers aminoethylglycine (AEG) and 2,4-diaminobutyric acid (2,4-DAB). The present protocol describes the steps in a validated NPAA extraction method commonly used in research and teaching laboratories.

The present protocol describes the extraction of non-protein amino acids from biological matrices via trichloroacetic acid (TCA) protein precipitation and acid hydrolysis before analysis using liquid chromatography-tandem mass spectrometry.

استخراج الأحماض الأمينية غير البروتينية من البكتيريا الزرقاء لتحليل الطيف الكتلي الترادفي للكروماتوغرافيا السائلة

Non-protein amino acids (NPAAs) are a large class of amino acids (AAs) that are not genetically encoded for translation into proteins. The analysis of ...

Microsampling in Targeted Mass Spectrometry-Based Protein Analysis of Low-Abundance Proteins

This paper presents a protocol with detailed descriptions for efficient sample cleanup of low-abundance proteins from dried samples. This is performed using bead-based proteolysis prior to proteotypic peptide affinity-capture and liquid chromatography tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) determination. The procedure can be applied to both conventional dried samples using paper cards (e.g., dried blood spots [DBSs] and dried serum spots [DSSs]), as well as samples collected with newer sampling methods such as volumetric absorptive microsampling (VAMS). In addition to describing this procedure, the preparation of both trypsin beads and antibody-coated beads is presented in a step-by-step manner in this work. The advantages of the presented procedure are time-efficient proteolysis using beads and selective robust cleanup using peptide affinity-capture. The current procedure describes the determination of the low-abundance small-cell lung cancer (SCLC) biomarker, progastrin-releasing peptide (ProGRP), in dried serum (both DSSs and VAMS). Detailed procedures for bead preparation make it easier to implement the workflow in new applications or other laboratories. It is demonstrated that the results may be dependent on the sampling material; for the present project, higher signal intensities were seen for samples collected using VAMS compared to DSSs.

A protocol is presented for the determination of low-abundance biomarkers from dried serum samples exemplified with the biomarker progastrin-releasing peptide (ProGRP). Antibody-coated magnetic beads are used for the selective cleanup and enrichment of a proteotypic ProGRP peptide. The captured peptide is subsequently analyzed by liquid chromatography-tandem mass spectrometry.

أخذ العينات المجهرية في تحليل البروتين القائم على قياس الطيف الكتلي المستهدف للبروتينات منخفضة الوفرة

This paper presents a protocol with detailed descriptions for efficient sample cleanup of low-abundance proteins from dried samples. This is performed ...