الكتاب نود أن نعترف بدعم من مؤسسة البحوث الوطنية (جبهة الخلاص الوطني -NRFF2011-01 وNRF2015NRF-POC0001-19)، المجلس الوطني للبحوث الطبية (NMRC / CBRG / 0005/2012)، وجامعة نانيانغ التكنولوجية لNJC

1. تشكيل المدعومة الدهن طبقة ثنائية على دعم الصلبة للماء <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الحلول الأسهم الدهون من 10 ملغ / مل 1،2-dioleoyl- SN -glycero-3-phosphocholine (DOPC) و 1 ملغ / مل 1،2-dioleoyl- SN -glycero-3-phosphoethanolamine- N - (lissamine رودامين B السلفونيل) (ره-PE) عن طريق إذابة مساحيق الدهون منها (وزنه بشكل مناسب مقدما مع توازن الكتلة التحليلي) في حل الأيسوبروبانول. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمييع وخلط الحلول الأسهم في الأيسوبروبانول من أجل إعداد خليط الدهن المطلوب في التركيز النهائي. للفحص المجهري مضان وFRAP التجارب، 0.5٪ بالوزن ره-PE ينبغي أن تدرج في خليط الدهون. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حقن خليط الدهن في الأيسوبروبانول في قناة ميكروفلويديك حتى يمتلئ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان خليط الدهن على السطح الزجاجي لمدة 10 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحل تدريجيا محل حل الدهن بمحلول الماء أو العازلة باستخدام مضخة تحوي في معدل تدفق منخفض جدا(10-50 ميكرولتر / دقيقة). بدلا من ذلك، تحل محل خليط الدهن من قبل pipetting المتكررة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شطف القناة تماما مع العازلة الزائد من أجل إزالة الأيسوبروبانول المتبقية. </li></ol> 2. تشكيل التخصيب نسبة الكولسترول في الدم المعتمدة الأغشية ملاحظة: سطح صلب (شافي 2) يدعم الانصهار الحويصلة، ولكن تكوين الغشاء (ارتفاع الكوليسترول في الدم) يمنع الانصهار الحويصلة بسبب حويصلات التخصيب الكولسترول وارتفاع الانحناء صلابة 30. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يعد حل الأسهم التي تحتوي على 10 ملغ / مل DOPC الدهون، و 10 ملغ / مل الكولسترول، و1 ملغ / مل ره-PE عن طريق إذابة أولا مساحيق منها في الأيزوبروبانول. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر الخطوات من 1،2-1،6 باستخدام حلول الأوراق المالية على استعداد في الخطوة 2.1. </li></ol> 3. غشاء سيولة الفحص <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تزج الشريحة الزجاجية في الصوديوم دوديسيل كبريتات (SDS) حل (1٪) لمدة 10 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغسل الشرائح جيدا بالماء منزوع الأيونات وشطف الطرافةح الإيثانول. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضربة الجافة الشرائح باستخدام تيار لطيف من النيتروجين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كشف الشرائح إلى البلازما الأكسجين لمدة 30 ثانية على أقصى قدر من قوة الترددات الراديوية في غرفة الأوكسجين البلازما. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة طلاء طبقة واقية من قعر التجاري غرفة ميكروفلويديك (الشكل 1A) باستخدام الملقط وإرفاق شريحة زجاجية على الجانب زجة من الغرفة (الشكل 1B). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجميع الوصلات والأنابيب في مواقف مدخل ومخرج من الغرفة ووضع قناة ميكروفلويديك على المسرح المجهر (الشكل 1C). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تشكيل طبقة ثنائية الدهون fluorescently المسمى معتمدة في قناة ميكروفلويديك [كرر الخطوة 1 باستخدام تكوين الدهون المطلوب (على سبيل المثال، 0.5 ملغ / مل DOPC) بما في ذلك 0.5٪ بالوزن ره-PE في المذيبات العضوية]. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد موقع الطائرة طبقة ثنائية مع الهدف الغمر النفط 60X (NA 1.49) من أجل التقاط الصور. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اتخاذ صورتين قبل التبييض، ثم الصور التبييض 301؛ م بقعة دائرية واسعة مع 532 نانومتر، و 100 ميغاواط شعاع الليزر. قبل photobleaching من، الاحماء ليزر حتى أصبح شدته مستقر. مباشرة بعد photobleaching من، التقاط سلسلة من الصور كل 1 ثانية لمدة 2 دقيقة من أجل متابعة الانتعاش في كثافة مضان في البقعة المبيضة. </li></ol> 4. الكولسترول الكمي الفحص <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فضح المغلفة ثاني أكسيد السليكون رقاقة الاستشعار الكوارتز الكريستال لالبلازما الأكسجين لمدة 30 ثانية على أقصى قدر من قوة الترددات الراديوية في غرفة الأوكسجين البلازما. إزالة شريحة من الغرفة وجبل فورا الشريحة في غرفة القياس. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل التجربة، الحصول على أول وتيرة وتبديد للرقاقة الاستشعار في الهواء من أجل ضمان التركيب الصحيح. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لQ-تحسس E1 أو E4 QCM-D أداة التجاري، تشغيل البرنامج Q-لينة وانقر على &quot;شراء&quot; وحدد &quot;قياس الإعداد&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في النافذة الجديدة التي تظهر، والتحقق من 3، 5، 7و 9 و 11 و 13 إيحاءات ثم انقر فوق البحث وتشغيل من أجل التحقق من أطياف الرنين. ضبط درجة الحرارة على 24 ° C. إذا واحد أو أكثر ترددات الرنين لا يتفق مع القيم المتوقعة، والتحقق من شريحة متزايدة وإعادة تنفيذ هذه الخطوة، حتى يتم التوصل إلى اتفاق. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدء ضخ تحوي وتتدفق حل العازلة (10 ملي تريس، 150 ملي كلوريد الصوديوم، ودرجة الحموضة 7.5) في غرفة القياس بمعدل تدفق 100 ميكرولتر / دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في البرنامج، انقر فوق &quot;شراء&quot; وحدد &quot;إعادة القياس&quot; من أجل تسجيل تردد صدى والطاقة إشارات تبديد. كرر هذه الخطوة حتى يتم الحصول على خط الأساس مستقرة للتردد وتبديد التحولات. ملاحظة: للحصول على خطوات الآخرة، سيكون هناك تردد وتبديد التحولات الإضافية التي يمكن تسجيلها بوصفها وظيفة من الزمن. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حقن الأيزوبروبانول (بدون دهن) لمدة 10 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حقن خليط من DOPC الدهون / الكولسترول فينسبة المولي المطلوب مع تركيز الدهون الكلي 0.5 ملغ / مل في الأيزوبروبانول لمدة 10 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حقن عازلة لمدة 20 دقيقة بمعدل تدفق 100 ميكرولتر / دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حقن محلول 1 ملي الميثيل β-سيكلودكسترين (MβCD) التي أعدت في المخزن (معدل التدفق 100 ميكرولتر / دقيقة) حتى إشارة التردد تصل قيمة مستقرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قياس التحولات تردد الإيجابية النسبية التي يسببها الخطوة العلاج MβCD وحساب كتلة الكوليسترول وDOPC الدهون عن طريق تحويل Δf تشو وΔf DOPC القيم إلى القيم الجماعية باستخدام المعادلة سوربري [Δm = - (C / N) × Δf، حيث C = 17.7 نانوغرام / سم 2، ن: يغلب]. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حساب الكسر المولي الكوليسترول في SLB، مع الأخذ بعين الاعتبار الأوزان الجزيئية للDOPC الدهون (786.1 جم / مول) والكولسترول (386.6 جم / مول). </li></ol>

The authors have no competing financial interests to disclose.

في هذا العمل، وقدم بروتوكول المذيبات الصرف فيها نسبة الدهون في الكحول (الأيزوبروبانول، والإيثانول، أو ن-بروبانول) يتم تحضين مع دعم قوي ثم يتم استبدال الكحول تدريجيا مع حل العازلة مائي من أجل دفع سلسلة والانتقال من مرحلة إنتاج في نهاية المطاف رقائقي المرحلة طبقات ثنائية الدهون 24. وتبين أن طريقة يمكن تصنيع طبقات ثنائية الدهون معتمدة على الأسطح مثل الذهب، وهو مستعصية إلى أسلوب الانصهار الحويصلة. وقد تم تحديد - (0،5 ملغ / مل 0.1) لتشكيل طبقة ثنائية الكامل في صيغ تجريبية القياسية اختبار حتى الآن أمثل مجموعة تركيز الدهون. بتركيزات الدهون أقل من 0.1 ملغ / مل، منفصلة، ​​بقع مجهرية من طبقات ثنائية تشكيلها. من ناحية أخرى، بتركيزات فوق 0.1 ملغ / مل، وأقل من 0.5 ملغ / مل، وشكلت طبقة ثنائية كاملة وموحدة. بتركيزات الدهون فوق هذا النطاق، وطبقة ثنائية السائل لا يزال كما شكلت verifiإد عن طريق تحليل FRAP، ومع ذلك، يكشف مضان المجهر وجود هياكل الدهون إضافية على أعلى من طبقة ثنائية. لافت للنظر، والتشكل من هذه الهياكل الدهون إضافية، على النحو الذي يحدده التحليل QCM-D، يتوقف على الكحول التي تم استخدامها أثناء الخطوة الحضانة. في حالة الإيثانول، والتحولات عالية نسبيا و وΔ Δ D تشبه التوقيع QCM-D تم الحصول عليها طبقة الحويصلة كثف. عندما استخدمت الأيسوبروبانول أو N-بروبانول بدلا من ذلك، كانت و Δ أعلى قليلا من القيمة المتوقعة لطبقة ثنائية (و Δ النهائية بين -30 إلى -40 هرتز)، في حين كان Δ D أعلى بشكل ملحوظ. يتوقع مثل هذه الردود QCM-D لهياكل الدهون طويلة (على سبيل المثال، المذيلات تشبه دودة) جاحظ الخارج من سطح غشاء (كما مرئية بواسطة المجهر مضان في بعض الحالات). سعر الصرف المذيبات هو معلمة هامة أخرى والتي يمكن أن تكون حاسمة، especially عندما يتم استخدام أقل تركيز الدهون (على سبيل المثال، 0.1 ملغ / مل). صرف المذيبات السريع في تركيز منخفض الدهون يمكن أن يؤدي إلى تشكيل طبقات ثنائية غير مكتملة. في غرفة القياس المعيارية المستخدمة لقياس QCM-D في هذه الورقة (Q-تحسس E4 قياس الغرفة)، ومعدلات تدفق نحو 100 ميكرولتر / دقيقة، وكانت مناسبة لتشكيل طبقة ثنائية كاملة تكرار للغاية. لتدفق الخلايا مع هندستها وحجم أخرى، قد معدل التدفق الأمثل تختلف ويجب أن تحدد تجريبيا يعتمد على الخطوات المقترحة في هذه الوثيقة. بالإضافة إلى تشكيل طبقات ثنائية الدهون معتمدة على الأسطح التي هي مستعصية على الانصهار الحويصلة، وSALB يمكن استخدامها للتحايل على الحاجة إلى الحويصلات الدهنية التي يمكن أن تمزق، وبالتالي فتح الباب لتصنيع الأغشية معتمدة مع تركيبة معقدة. كمثال توضيحي التكوين، تم فحص خليط من الدهون مع جزء كبير من الكولسترول. الكولسترول هو عنصر هام من mammعليان أغشية الخلايا، والكسر يمكن الاقتراب 45-50 مول٪ من تكوين الدهون غشاء (على سبيل المثال، في الكريات الحمراء). وبالتالي، يجب حتى نموذج بسيط من طبقة ثنائية الدهون يمثل غشاء الخلية البشرية تشمل الكوليسترول في الدم. في حين الانصهار الحويصلة يمكن استخدامها لصنع طبقات ثنائية الدهون الموائعية تحتوي على 10-15٪ فقط الكوليسترول في الدم، وطريقة SALB يمكن تشكيل طبقات ثنائية الدهون الموائعية تحتوي على كسور عالية من الكوليسترول (ما يصل الى 57٪ مول، كما كميا بواسطة القياسات QCM-D) 36. ومع ذلك، عندما تم رفع مستوى الكولسترول كذلك (إلى 63٪ مول)، وقد لوحظت المجالات شريط شكل 37. وكانت نطاقات تتعايش السائل، تذكرنا تلك التي لوحظت في المنطقة β في الرسم البياني مرحلة من مراحل أحادي الطبقة الكوليسترول / الدهون الفوسفاتية في واجهة بين الهواء والماء. عموما، يتم عرض طريقة SALB أن تكون مقاربة بسيطة وفعالة لتشكيل طبقات ثنائية الدهون المعتمدة، وخصوصا طحالات ن خارج نطاق التقليدية طريقة الانصهار الحويصلة. حتى الآن، تم استخدام QCM-D تقنية ومضان المجهر أساسا لوصف طبقات ثنائية الدهون بدعم شكلتها طريقة SALB. نتطلع، مجموعة واسعة من القياسات التحليلية تقنيات حساسة للسطح، بما في ذلك الرنين مأكل السطح (SPR) 38، قوة المجهر الذري (AFM) 39،40، فورييه تحويل مطياف الأشعة تحت الحمراء 41، والأشعة X 42 والنيوترون انعكاسية 43 يمكن، استخدامها لمزيد من تميز ودراسة تكوينات طبقة ثنائية بسيطة ومعقدة تعد من طريقة SALB. هذه القدرات الناشئة تفتح الباب أمام عدد أكبر من العلماء الذين يمكن استكشاف أغشية الخلايا الاصطناعية من خلال الاستفادة من بروتوكول تجريبي بسيط وقوي.

والصلبة المدعومة من الدهون طبقة ثنائية 1 (SLB) هي عبارة عن منصة متعددة الاستخدامات التي تحافظ على الخصائص الأساسية للbiomembranes مثل سمك طبقة ثنائية، الانتشارية الدهون ثنائي الأبعاد، والقدرة على استضافة الجزيئات الحيوية المرتبطة الغشاء. نظرا لتعقيد أغشية الخلايا الطبيعية، وقد أظهرت هذه المنصة بسيطة لتعمل بمثابة منصة فعالة لفي الدراسات المختبرية من العمليات المتعلقة غشاء مثل تشكيل طوف 2، 3 بروتين ملزمة، وفيروس يشبه فيروس الجسيمات ملزمة 4،5 ويشير خلية 6. شكلت على مقربة من دعم قوي، ومنصة SLB متوافق مع مجموعة من القياسات تقنيات حساسة للسطح مثل الكلي المجهر التأمل الداخلي (TIRF)، الكوارتز الكريستال توازن دقيق تبديد (QCM-D)، ومقاومة التحليل الطيفي. وقد وضعت عدة طرق لإنتاج أنواع مختلفة من SLBs، بما في ذلك فقاعة الهواءانهيار 7 وتراجع من ركلة جزاء طباعة حجرية نانوية 8 لبقع الدهون-submicron الحجم، 9 لرزمة طبقة ثنائية وانجميور-بلودجيت (LB) 10 والانصهار الحويصلة (VF) 11 مقابل الممتدة الكامل، واحدة الطلاء الدهون طبقة ثنائية طلاء زيادة ونقصان. وتتكون الطريقة VF من امتصاص الحويصلات unilamellar صغيرة إلى دعم قوي وتمزق عفوي لاحق والانصهار لتشكيل الدهون طبقة ثنائية مستمرة. ومع ذلك، في ظل الظروف الفسيولوجية، حويصلة عفوية تمزق يقتصر أساسا على المواد القائمة على السيليكون مثل ثاني أكسيد السيليكون، والزجاج، والميكا. وبالإضافة إلى ذلك، لا تحدث حويصلة تمزق عفوي في الحويصلات من المؤلفات الدهون المعقدة مثل تلك التي تحتوي على كسور عالية من الكوليسترول أو الدهون سالبة الشحنة. اعتمادا على النظام، قد يكون ذلك حافزا الحويصلة تمزق عن طريق زيادة الخياطة الظروف التجريبية مثل درجة الحرارة 12، 13 درجة الحموضة الحل، والملوحة 14، صدمة التناضحي 15 </sتصل&gt; أو الضغط 16، أو إضافة أيونات ثنائي التكافؤ مثل الكالسيوم 2+ 17. بدلا من ذلك، يمكن عرض غشاء نشط ه الببتيد من أجل زعزعة استقرار طبقة من الحويصلات كثف، مما أدى إلى تمزق الحويصلة وتشكيل طبقة ثنائية بشأن مجموعة من السطوح 18-22. وعلاوة على ذلك، تشكيل طبقة ثنائية الناجح يتطلب إعداد السكان تسيطر عليها بشكل جيد من الحويصلات unilamellar الصغيرة التي يمكن أن يكون مضيعة للوقت وصعب التحقيق في بعض التراكيب الغشاء. لذلك، على الرغم من كفاءتها العالية في الحالات المثلى (على سبيل المثال، بعد واسعة المعالجة تجميد أذاب حويصلات 23)، التطبيق العام لحويصلة الانصهار محدودة بسبب نطاق ركائز مناسبة والتراكيب الغشاء. طريقة بمساعدة مذيب الدهون طبقة ثنائية (SALB) 24-28 هو أسلوب تلفيق البديلة التي لا تتطلب الحويصلات الدهنية. وتستند هذه الطريقة على ترسب سجزيئات الدهون و على سطح صلب في وجود المذيبات العضوية غير قابلة للامتزاج المياه تليها الصرف التدريجي من هذه المذيبات مع حل العازلة مائي من أجل إطلاق عملية تشكيل SLB. خلال الخطوة المذيبات الصرف، وخليط ثلاثي الدهون، المذيبات العضوية، والماء يخضع لمرحلة سلسلة التحولات مع زيادة نسبة المياه، الأمر الذي يؤدي إلى تشكيل هياكل المرحلة رقائقي في حل الجزء الأكبر وSLB على الركيزة الصلبة. الأهم من ذلك، هذا الطريق التجميع الذاتي يتجاوز الحاجة لتمزق الحويصلة، التي عادة ما تكون الخطوة تحد للتحول من الحويصلات كثف إلى SLB. بروتوكول ينطبق على طائفة واسعة من الأسطح بما في ذلك غاز ثاني أكسيد السيليكون، وأكسيد الألومنيوم، الكروم، أكسيد القصدير الإنديوم، والذهب. في هذه الورقة والفيديو المصاحب، وقدم مقارنة بين ترسب الدهون التي SALB وطرق الانصهار الحويصلة. على وجه الخصوص، وتأثير المعلمات التجريبية، بما في ذلك تركيز الدهون، وتناقش معدل التدفق، واختيار من المياه المذيبات العضوية غير قابلة للامتزاج، على نوعية طبقة ثنائية شكلتها طريقة SALB. يتم تنفيذ توصيف تحليلي للSLBs ملفقة من قبل QCM-D، مضان المجهر، والانتعاش بعد مضان photobleaching من (FRAP) التقنيات. رصد QCM-D هو كتلة تقنية قياس حساسة للسطح الذي، منذ العمل الرائد الذي أجراه كيلر وKasemo 29، وقد استخدمت على نطاق واسع لتحقيق كميا تشكيل طبقة ثنائية. يسمح مضان المجهر التفتيش من التجانس غشاء فضلا عن التصور المجالات الغشاء. تقنية FRAP هي أداة موحدة لتحديد التنقل الجانبي من جزيئات الدهون في SLB، وهي خاصية أساسية من الأغشية الموائعية. الجزء الأول من هذه الدراسة تتضمن تحليل QCM-D من SALB والحويصلة طرق الانصهار تطبيقها على محاولة تشكيل طبقة ثنائية على ثاني أكسيد السيليكون والذهب. في الجزء الثاني،وأظهرت إعداد وتوصيف الأغشية دعم تحتوي على مجموعة من تركيزات الكوليسترول مع أسلوب SALB وتتم مقارنة النتائج مع تلك التي تم الحصول عليها عن طريق أسلوب الانصهار الحويصلة.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1459">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:719px;">QCM-D silicon dioxide-coated substrates</td>
			<td style="width:356px;">QSense AB,&#160; Sweden</td>
			<td style="width:217px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">QCM-D gold-coated substrates</td>
			<td style="width:356px;">QSense AB,&#160; Sweden</td>
			<td style="width:217px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Q-Sense E4 module</td>
			<td>QSense AB,&#160; Sweden</td>
			<td style="width:217px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Plasma Cleaner, PDC-32G</td>
			<td>Harrick Plasma, Ithaca, NY</td>
			<td>PDC-001 (115V)&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:719px;">1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850375P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(lissamine rhodamine B sulfonyl) (ammonium salt) (Rh-PE)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>810150P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">cholesterol</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td style="width:217px;">700000P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Methyl-&#946;-cyclodextrin</td>
			<td style="width:356px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:217px;">C4555</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Isopropanol</td>
			<td style="width:356px;">Sigma&#160;</td>
			<td align="right">673773</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:719px;">Ethanol</td>
			<td style="width:356px;">Sigma&#160;</td>
			<td align="right" style="width:217px;">459844</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:719px;">n-propanol</td>
			<td style="width:356px;">Sigma&#160;</td>
			<td align="right">279544</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:719px;">Sticky-Slide I 0.1 Luer</td>
			<td style="width:356px;">IBIDI</td>
			<td align="right" style="width:217px;">81128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:719px;">Male elbow 1/8&#8221;</td>
			<td style="width:356px;">Cole-Parmer</td>
			<td style="width:217px;">30505-70</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:719px;">Silicon tubing 1.6mm ID</td>
			<td style="width:356px;">IBIDI</td>
			<td align="right" style="width:217px;">10842</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:719px;">Glass coverslip No. 1.5H, 25 mm x 75 mm</td>
			<td style="width:356px;">IBIDI</td>
			<td align="right" style="width:217px;">10812</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:719px;">Reglo Digital M2-2/12 Peristaltic Pump</td>
			<td style="width:356px;">Ismatec</td>
			<td style="width:217px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:719px;">Sodium dodecyl sulfate</td>
			<td style="width:356px;">Sigma&#160;</td>
			<td align="right" style="width:217px;">71725</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

biomembrane fabrication by the solvent-assisted lipid bilayer (salb) method

من أجل تقليد أغشية الخلايا، طبقة ثنائية المادة الدهنية المدعومة (SLB) هو منصة جذابة والتي تمكن في تحقيق المختبر من العمليات المتعلقة غشاء بينما منح توافق مع الحياة وbiofunctionality على ركائز متينة. الامتزاز عفوية وتمزق الحويصلات فوسفورية هو الأسلوب الأكثر شيوعا لتشكيل SLBs. ومع ذلك، في ظل الظروف الفسيولوجية، والانصهار الحويصلة (VF) يقتصر على مجموعة فرعية فقط من المؤلفات الدهون والدعم الصلبة. هنا، نحن تصف الإجراء العام من خطوة واحدة تسمى بمساعدة مذيب الدهون طبقة ثنائية (SALB) طريقة تشكيل من أجل تشكيل SLBs التي لا تتطلب الحويصلات. الأسلوب ينطوي على SALB ترسب جزيئات الدهون على سطح صلب في وجود المذيبات قابلة للامتزاج المياه العضوية (على سبيل المثال، الأيزوبروبانول) واللاحقة مذيب التبادل مع حل العازلة مائي من أجل إطلاق عملية تشكيل SLB. الخطوة الصرف المذيبات مستمرة تتيح تطبيقالأسلوب في تكوين التدفق من خلال مناسبة لتشكيل طبقة ثنائية الرصد والتعديلات اللاحقة باستخدام مجموعة واسعة من أجهزة الاستشعار الحساسة للسطح. طريقة SALB يمكن استخدامها لصنع SLBs على مجموعة واسعة من السطوح الصلبة للماء، بما في ذلك تلك التي هي مستعصية على الانصهار الحويصلة. وبالإضافة إلى ذلك، فإنه يمكن تصنيع SLBs تتألف من تركيبة الدهون التي لا يمكن إعدادها باستخدام أسلوب الانصهار الحويصلة. هنا، نحن مقارنة النتائج التي تم الحصول عليها مع SALB والتقليدية طرق الانصهار الحويصلة على سطحين ماء توضيحية، وثاني أكسيد السيليكون والذهب. لتحسين ظروف تجريبية لإعداد طبقات ثنائية جودة عالية أعدت من خلال طريقة SALB، وناقش تأثير عوامل مختلفة، بما في ذلك نوع من المذيبات العضوية في خطوة الترسيب، وسعر الصرف المذيبات، وتركيز الدهون مع نصائح استكشاف الأخطاء وإصلاحها . تشكيل الأغشية بدعم تحتوي على كسور عالية من الكوليسترول هو أيضا الشياطينtrated مع أسلوب SALB، وتسليط الضوء على القدرات التقنية للتقنية SALB لمجموعة واسعة من التشكيلات الغشاء.

Watch this Scientific Journal Video about Biomembrane Fabrication by the Solvent-assisted Lipid Bilayer SALB Method at JoVE.com

Biomembrane Fabrication by the Solvent-assisted Lipid Bilayer SALB Method

نقدم بروتوكول تجريبي لتشكيل طبقة ثنائية الدهون معتمدة على ركائز متينة دون استخدام حويصلات الدهنية. ونحن لشرح طريقة خطوة واحدة لتشكيل طبقة ثنائية المادة الدهنية على ثاني أكسيد السيليكون، والذهب، وكذلك الأغشية مدعمة مجال التخصيب الكولسترول للتطبيقات البيولوجية المختلفة.

غشاء حيوي تلفيق من المذيبات بمساعدة الدهون طبقة ثنائية (SALB) طريقة

In order to mimic cell membranes, the supported lipid bilayer (SLB) is an attractive platform which enables in vitro investigation of membrane-related ...

biomembrane-fabrication-solvent-assisted-lipid-bilayer-salb

Google

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biomembrane Fabrication by the Solvent-assisted Lipid Bilayer (SALB) Method

14.6K Views.  Nanyang Technological University.  نقدم بروتوكول تجريبي لتشكيل طبقة ثنائية الدهون معتمدة على ركائز متينة دون استخدام حويصلات الدهنية. ونحن لشرح طريقة خطوة واحدة لتشكيل طبقة ثنائية المادة الدهنية على ثاني أكسيد السيليكون، والذهب، وكذلك الأغشية مدعمة مجال التخصيب الكولستر?...

Video: Biomembrane Fabrication by the Solvent-assisted Lipid Bilayer SALB Method

Constant Pressure-controlled Extrusion Method for the Preparation of Nano-sized Lipid Vesicles

Liposomes are artificially prepared vesicles consisting of natural and synthetic phospholipids that are widely used as a cell membrane mimicking platform to study protein-protein and protein-lipid interactions3, monitor drug delivery4,5, and encapsulation4. Phospholipids naturally create curved lipid bilayers, distinguishing itself from a micelle.6 Liposomes are traditionally classified by size and number of bilayers, i.e. large unilamellar vesicles (LUVs), small unilamellar vesicles (SUVs) and multilamellar vesicles (MLVs)7. In particular, the preparation of homogeneous liposomes of various sizes is important for studying membrane curvature that plays a vital role in cell signaling, endo- and exocytosis, membrane fusion, and protein trafficking8. Several groups analyze how proteins are used to modulate processes that involve membrane curvature and thus prepare liposomes of diameters &lt;100 - 400 nm to study their behavior on cell functions3. Others focus on liposome-drug encapsulation, studying liposomes as vehicles to carry and deliver a drug of interest9. Drug encapsulation can be achieved as reported during liposome formation9. Our extrusion step should not affect the encapsulated drug for two reasons, i.e. (1) drug encapsulation should be achieved prior to this step and (2) liposomes should retain their natural biophysical stability, securely carrying the drug in the aqueous core. These research goals further suggest the need for an optimized method to design stable sub-micron lipid vesicles.
Nonetheless, the current liposome preparation technologies (sonication10, freeze-and-thaw10, sedimentation) do not allow preparation of liposomes with highly curved surface (i.e. diameter &lt;100 nm) with high consistency and efficiency10,5, which limits the biophysical studies of an emerging field of membrane curvature sensing. Herein, we present a robust preparation method for a variety of biologically relevant liposomes.
Manual extrusion using gas-tight syringes and polycarbonate membranes10,5 is a common practice but heterogeneity is often observed when using pore sizes &lt;100 nm due to due to variability of manual pressure applied. We employed a constant pressure-controlled extrusion apparatus to prepare synthetic liposomes whose diameters range between 30 and 400 nm. Dynamic light scattering (DLS)10, electron microscopy11 and nanoparticle tracking analysis (NTA)12 were used to quantify the liposome sizes as described in our protocol, with commercial polystyrene (PS) beads used as a calibration standard. A near linear correlation was observed between the employed pore sizes and the experimentally determined liposomes, indicating high fidelity of our pressure-controlled liposome preparation method. Further, we have shown that this lipid vesicle preparation method is generally applicable, independent of various liposome sizes. Lastly, we have also demonstrated in a time course study that these prepared liposomes were stable for up to 16 hours. A representative nano-sized liposome preparation protocol is demonstrated below.

This protocol describes an extrusion method for preparing lipid vesicles of sub-micron sizes with a high degree of homogeneity. This method uses a pressure-controlled system with controlled nitrogen flow rates for liposome preparation. The lipid preparation1,2, liposome extrusion, and size characterization will be presented herein.

ثابت الطريقة النتوء الضغط التي تسيطر عليها لإعداد الحويصلات الدهن نانو الحجم

Liposomes are artificially prepared vesicles consisting of natural and synthetic phospholipids that are widely used as a cell membrane mimicking platform ...

Microfluidic Chip Fabrication and Method to Detect Influenza

Fast and effective diagnostics play an important role in controlling infectious disease by enabling effective patient management and treatment. Here, we present an integrated microfluidic thermoplastic chip with the ability to amplify influenza A virus in patient nasopharyngeal (NP) swabs and aspirates. Upon loading the patient sample, the microfluidic device sequentially carries out on-chip cell lysis, RNA purification and concentration steps within the solid phase extraction (SPE), reverse transcription (RT) and polymerase chain reaction (PCR) in RT-PCR chambers, respectively. End-point detection is performed using an off-chip Bioanalyzer (Agilent Technologies, Santa Clara, CA). For peripherals, we used a single syringe pump to drive reagent and samples, while two thin film heaters were used as the heat sources for the RT and PCR chambers. The chip is designed to be single layer and suitable for high throughput manufacturing to reduce the fabrication time and cost. The microfluidic chip provides a platform to analyze a wide variety of virus and bacteria, limited only by changes in reagent design needed to detect new pathogens of interest.

An integrated microfluidic thermoplastic chip has been developed for use as a molecular diagnostic. The chip performs nucleic acid extraction, reverse transcriptase, and PCR. Methods for fabricating and running the chip are described.

ميكروفلويديك تصنيع المعالج وطريقة للكشف عن الأنفلونزا

Fast  and effective diagnostics play an important role in controlling infectious  disease by enabling effective patient management and treatment. Here, we ...

Formation of Biomembrane Microarrays with a Squeegee-based Assembly Method

Lipid bilayer membranes form the plasma membranes of cells and define the boundaries of subcellular organelles. In nature, these membranes are heterogeneous mixtures of many types of lipids, contain membrane-bound proteins and are decorated with carbohydrates. In some experiments, it is desirable to decouple the biophysical or biochemical properties of the lipid bilayer from those of the natural membrane. Such cases call for the use of model systems such as giant vesicles, liposomes or supported lipid bilayers (SLBs). Arrays of SLBs are particularly attractive for sensing applications and mimicking cell-cell interactions. Here we describe a new method for forming SLB arrays. Submicron-diameter SiO2 beads are first coated with lipid bilayers to form spherical SLBs (SSLBs). The beads are then deposited into an array of micro-fabricated submicron-diameter microwells. The preparation technique uses a "squeegee" to clean the substrate surface, while leaving behind SSLBs that have settled into microwells. This method requires no chemical modification of the microwell substrate, nor any particular targeting ligands on the SSLB. Microwells are occupied by single beads because the well diameter is tuned to be just larger than the bead diameter. Typically, more 75% of the wells are occupied, while the rest remain empty. In buffer SSLB arrays display long-term stability of greater than one week. Multiple types of SSLBs can be placed in a single array by serial deposition, and the arrays can be used for sensing, which we demonstrate by characterizing the interaction of cholera toxin with ganglioside GM1. We also show that phospholipid vesicles without the bead supports and biomembranes from cellular sources can be arrayed with the same method and cell-specific membrane lipids can be identified.

Supported lipid bilayers and natural membrane particles are convenient systems that can approximate the properties of cell membranes and be incorporated in a variety of analytical strategies. Here we demonstrate a method for preparing microarrays composed of supported lipid bilayer-coated SiO2 beads, phospholipid vesicles or natural membrane particles.

تشكيل غشاء حيوي ميكروأرس مع الطريقة الجمعية مقرها الممسحة-

Lipid bilayer membranes form the plasma membranes of cells and define the boundaries of subcellular organelles. In nature, these membranes are ...

Lipid Bilayer Vesicle Generation Using Microfluidic Jetting

Bottom-up synthetic biology presents a novel approach for investigating and reconstituting biochemical systems and, potentially, minimal organisms. This emerging field engages engineers, chemists, biologists, and physicists to design and assemble basic biological components into complex, functioning systems from the bottom up. Such bottom-up systems could lead to the development of artificial cells for fundamental biological inquiries and innovative therapies1,2. Giant unilamellar vesicles (GUVs) can serve as a model platform for synthetic biology due to their cell-like membrane structure and size. Microfluidic jetting, or microjetting, is a technique that allows for the generation of GUVs with controlled size, membrane composition, transmembrane protein incorporation, and encapsulation3. The basic principle of this method is the use of multiple, high-frequency fluid pulses generated by a piezo-actuated inkjet device to deform a suspended lipid bilayer into a GUV. The process is akin to blowing soap bubbles from a soap film. By varying the composition of the jetted solution, the composition of the encompassing solution, and/or the components included in the bilayer, researchers can apply this technique to create customized vesicles. This paper describes the procedure to generate simple vesicles from a droplet interface bilayer by microjetting.

Microfluidic jetting against a droplet interface lipid bilayer provides a reliable way to generate vesicles with control over membrane asymmetry, incorporation of transmembrane proteins, and encapsulation of material. This technique can be applied to study a variety of biological systems where compartmentalized biomolecules are desired.

الدهون طبقة ثنائية الحويصلة انشاء طريق ميكروفلويديك النفث

Bottom-up synthetic biology presents a novel approach for investigating and reconstituting biochemical systems and, potentially, minimal organisms. This ...

Polymeric Microneedle Array Fabrication by Photolithography

This manuscript describes the fabrication of polymeric microneedle (MN) arrays by photolithography. It involves a simple mold-free process by using a photomask consisting of embedded micro-lenses. Embedded micro-lenses were found to influence MN geometry (sharpness). Robust MN arrays with tip diameters ranging between 41.5 &#181;m &#177; 8.4 &#181;m and 71.6 &#181;m &#177; 13.7 &#181;m, with two different lengths (1,336 &#181;m &#177; 193 &#181;m and 957 &#181;m &#177; 171 &#181;m) were fabricated. These MN arrays may provide potential applications in delivery of low molecular and macromolecular therapeutic agents through skin.

Here, we present a protocol describing a mold-free fabrication process of the polymeric microneedles by photolithography.

البوليمر تصنيع صفيف إبرة مجهرية من قبل الطباعة التصويرية

This manuscript describes the fabrication of polymeric microneedle (MN) arrays by photolithography. It involves a simple mold-free process by using a ...

Solid Lipid Nanoparticles (SLNs) for Intracellular Targeting Applications

Nanoparticle-based delivery vehicles have shown great promise for intracellular targeting applications, providing a mechanism to specifically alter cellular signaling and gene expression. In a previous investigation, the synthesis of ultra-small solid lipid nanoparticles (SLNs) for topical drug delivery and biomarker detection applications was demonstrated. SLNs are a well-studied example of a nanoparticle delivery system that has emerged as a promising drug delivery vehicle. In this study, SLNs were loaded with a fluorescent dye and used as a model to investigate particle-cell interactions. The phase inversion temperature (PIT) method was used for the synthesis of ultra-small populations of biocompatible nanoparticles. A 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenylphenyltetrazolium bromide (MTT) assay was utilized in order to establish appropriate dosing levels prior to the nanoparticle-cell interaction studies. Furthermore, primary human dermal fibroblasts and mouse dendritic cells were exposed to dye-loaded SLN over time and the interactions with respect to toxicity and particle uptake were characterized using fluorescence microscopy and flow cytometry. This study demonstrated that ultra-small SLNs, as a nanoparticle delivery system, are suitable for intracellular targeting of different cell types.

Solid Lipid Nanoparticles SLNs for Intracellular Targeting Applications

In this study, a method for synthesizing ultra-small populations of biocompatible nanoparticles was described, as well as several in vitro methods by which to assess their cellular interactions.

الصلبة الدهون النانوية (SLNs) لاستهداف التطبيقات بين الخلايا

Nanoparticle-based delivery vehicles have shown great promise for intracellular targeting applications, providing a mechanism to specifically alter ...

Automated Lipid Bilayer Membrane Formation Using a Polydimethylsiloxane Thin Film

An artificial lipid bilayer, or black lipid membrane (BLM), is a powerful tool for studying ion channels and protein interactions, as well as for biosensor applications. However, conventional BLM formation techniques have several drawbacks and they often require specific expertise and laborious processes. In particular, conventional BLMs suffer from low formation success rates and inconsistent membrane formation time. Here, we demonstrate a storable and transportable BLM formation system with controlled thinning-out time and enhanced BLM formation rate by replacing conventionally used films (polytetrafluoroethylene, polyoxymethylene, polystyrene) to polydimethylsiloxane (PDMS). In this experiment, a porous-structured polymer such as PDMS thin film is used. In addition, as opposed to conventionally used solvents with low viscosity, the use of squalene permitted a controlled thinning-out time via slow solvent absorption by PDMS, prolonging membrane lifetime. In addition, by using a mixture of squalene and hexadecane, the freezing point of the lipid solution was increased (~16 &#176;C), in addition, membrane precursors were produced that can be indefinitely stored and readily transported. These membrane precursors have reduced BLM formation time of &#60; 1 hr and achieved a BLM formation rate of ~80%. Moreover, ion channel experiments with gramicidin A demonstrated the feasibility of the membrane system.

We demonstrate a storable, transportable lipid bilayer formation system. A lipid bilayer membrane can be formed within 1 hr with over 80% success rate when a frozen membrane precursor is brought to ambient temperature. This system will reduce laborious processes and expertise associated with ion channels.

الآلي الدهن طبقة ثنائية غشاء تشكيل باستخدام ثنائي ميثيل بولي سيلوكسان رقيقة

An artificial lipid bilayer, or black lipid membrane (BLM), is a powerful tool for studying ion channels and protein interactions, as well as for ...

Ligand Nano-cluster Arrays in a Supported Lipid Bilayer

Currently there is considerable interest in creating ordered arrays of adhesive protein islands in a sea of passivated surface for cell biological studies. In the past years, it has become increasingly clear that living cells respond, not only to the biochemical nature of the molecules presented to them but also to the way these molecules are presented. Creating protein micro-patterns is therefore now standard in many biology laboratories; nano-patterns are also more accessible. However, in the context of cell-cell interactions, there is a need to pattern not only proteins but also lipid bilayers. Such dual proteo-lipidic patterning has so far not been easily accessible. We offer a facile technique to create protein nano-dots supported on glass and propose a method to backfill the inter-dot space with a supported lipid bilayer (SLB). From photo-bleaching of tracer fluorescent lipids included in the SLB, we demonstrate that the bilayer exhibits considerable in-plane fluidity. Functionalizing the protein dots with fluorescent groups allows us to image them and to show that they are ordered in a regular hexagonal lattice. The typical dot size is about 800 nm and the spacing demonstrated here is 2 microns. These substrates are expected to serve as useful platforms for cell adhesion, migration and mechano-sensing studies.

We present a protocol to functionalize glass with nanometric protein patches surrounded by a fluid lipid bilayer. These substrates are compatible with advanced optical microscopy and are expected to serve as platform for cell adhesion and migration studies.

صالحة يجند نانو الكتلة في الدهن طبقة ثنائية المعتمدة

Currently there is considerable interest in creating ordered arrays of adhesive protein islands in a sea of passivated surface for cell biological ...

A Simple and Scalable Fabrication Method for Organic Electronic Devices on Textiles

Today, wearable electronics devices combine a large variety of functional, stretchable, and flexible technologies. However, in many cases, these devices cannot be worn under everyday conditions. Therefore, textiles are commonly considered the best substrate to accommodate electronic devices in wearable use. In this paper, we describe how to selectively pattern organic electroactive materials on textiles from a solution in an easy and scalable manner. This versatile deposition technique enables the fabrication of wearable organic electronic devices on clothes.

In this paper, we present a protocol to selectively deposit organic materials on textiles, which allows for the direct integration of organic electronic devices with wearables. The fabricated devices can be fully integrated in textiles, respecting their mechanical appearance and enabling sensing capabilities.

وبسيطة وقابلة للتطوير أسلوب تلفيق لعضوي الأجهزة الإلكترونية بشأن المنسوجات

Today, wearable electronics devices combine a large variety of functional, stretchable, and flexible technologies. However, in many cases, these devices ...

Fabrication of Decellularized Cartilage-derived Matrix Scaffolds

Osteochondral defects lack sufficient intrinsic repair capacity to regenerate functionally sound bone and cartilage tissue. To this extent, cartilage research has focused on the development of regenerative scaffolds. This article describes the development of scaffolds that are completely derived from natural cartilage extracellular matrix, coming from an equine donor. Potential applications of the scaffolds include producing allografts for cartilage repair, serving as a scaffold for osteochondral tissue engineering, and providing in vitro models to study tissue formation. By decellularizing the tissue, the donor cells are removed, but many of the natural bioactive cues are thought to be retained. The main advantage of using such a natural scaffold in comparison to a synthetically produced scaffold is that no further functionalization of polymers is required to drive osteochondral tissue regeneration. The cartilage-derived matrix scaffolds can be used for bone and cartilage tissue regeneration in both in vivo and in vitro settings.

Decellularized cartilage-derived scaffolds can be used as a scaffold to guide cartilage repair and as a means to regenerate osteochondral tissue. This paper describes the decellularization process in detail and provides suggestions to use these scaffolds in in vitro settings.

تصنيع السقالات مصفوفة ديسيلولاريزيد المستمدة من الغضروف

Osteochondral defects lack sufficient intrinsic repair capacity to regenerate functionally sound bone and cartilage tissue. To this extent, cartilage ...