Name: bacterial artificial chromosomes: a functional genomics tool for the study of positive-strand rna viruses
Uploaded: 2015-12-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 20 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Bacterial Artificial Chromosomes: A Functional Genomics Tool for the Study of Positive-strand RNA Viruses at JoVE.com

The authors would like to acknowledge the Utah Science Technology and Research fund for support of YML and the Korea National Research Foundation grants (2009-0069679 and 2010-0010154) for support of SIY. This research was supported by the Utah Agricultural Experiment Station, Utah State University, and approved as journal paper number UAES #8753. Also, the authors thank Dr. Deborah McClellan for editorial assistance.

The authors have declared that they have no competing financial interests.

وقد استخدم البروتوكول الحالي بنجاح لتوليد كامل طول استنساخ [كدنا] المعدية لمدة سلالات مختلفة (CNU / LP2 27 و SA 14 -14-2 28) من JEV، والفيروسة المصفرة التي كدنا] وظيفية وقد ثبت أن من الصعب أصلا لبناء و نشر بسبب سمية الخلية المضيفة وعدم الاستقرار الجيني للكدنا] المستنسخة 8،74-76 هذا البروتوكول يتضمن ثلاثة عناصر رئيسية هي: أولا، تحقيق أقصى قدر من تجميع / التضخيم من نسخة [كدنا المؤمنين من RNA الفيروسي باستخدام عالية الدقة عكس الناسخ / البلمرة DNA. ثانيا، استنساخ الفيروسية المنطقة PRM-E الترميز التي تحتوي على تسلسل السامة (بيانات غير منشورة) 74،77،78 في نسخ منخفضة جدا ناقلات عدد BAC من [كدنا الأولي subcloning لكامل طول الخطوات التجمع كدنا] النهائية؛ والثالث، وذلك باستخدام BAC ناقلات الاستنساخ التي يمكن أن تستوعب DNA الأجنبية بمتوسط ​​حجم 120-350 كيلوبايت، 19-21 التي تتسامح مع ما يبدو أكبر INSE DNAالمحطة المذكورة من القيام ناقلات الاستنساخ الأخرى. وهذا النهج الاستنساخ تكون قابلة للتطبيق بشكل عام إلى العديد من الفيروسات RNA إيجابية حبلا الأخرى، لا سيما تلك التي لديها جينوم الحمض النووي الريبي كبير من ~ 10-32 كيلوبايت. جيل من استنساخ [كدنا] المعدية هو خطوة رئيسية في تطوير نظام الوراثة العكسية للفيروسات RNA، وخاصة بالنسبة للفيروسات RNA إيجابية المنطلق، لأن الجينوم الفيروسي يعمل مرنا كما أن تترجم إلى بروتينات التي ريبوسوم الخلية المضيفة. وبالتالي، يمكن أن يبدأ تكاثر الفيروس عن طريق إدخال الجينوم طول جزيء RNA المستمدة كدنا] إلى الخلية المضيفة عرضة للإصابة. إن وجود المعدية JEV كدنا] استنساخ، عندما جنبا إلى جنب مع تكنولوجيا الحمض النووي المؤتلف، ازداد فهمنا لمختلف جوانب دورة حياة الفيروس على المستوى الجزيئي، مثل التعبير الجيني 73،79 وتكرار الجينوم. 63،64 أيضا، وقد أثبتت كامل طول JEV كدنا] استنساخ ليكون أداة قيمة لتطوير لقاحات مضادة للفيروسات 28 وناقلات توصيل الجينات. &lt;سوب&gt; 80،81 كما هو الحال مع جميع فيروسات RNA إيجابية المنطلق، هناك خطوات حاسمة متعددة في بناء كدنا] وظيفية يمكن الاعتماد عليها لJEV التي الرنا شديدة العدوى ويمكن تصنيعه في المختبر. من الناحية المثالية، ينبغي أن يكون تسلسل الرنا الاصطناعية كتب من نسخة من كامل طول كدنا] متطابقة إلى أن من RNA الجيني الفيروسي، وخاصة 5&#39;- و3&#39;-محطة متواليات المطلوبة لبدء النسخ RNA الفيروسي . 60-62 في البروتوكول الحالي، الحجية 5&#39;- وتم ضمان 3&#39;نهايات من خلال وضع تسلسل SP6 المروج المنبع من أول النوكليوتيدات الأدينين من الجينوم الفيروسي وتحديد المواقع على الاصطناعي Xba I موقع قيود فريدة من نوعها المصب من الماضي الثايمين النوكليوتيدات من الجينوم الفيروسي، على التوالي. توج الرنا الاصطناعية مع أصيلة 5 &#39;و 3&#39; ينتهي من إنتاج النسخ جولة الاعادة من Xba I خطي وMBN المعاملة [كدنا الشركة المصرية للاتصالاتmplate باستخدام SP6 RNA البلمرة معبي مع م 7 G (5 &#39;) تعادل القوة الشرائية (5&#39;) قبعة التناظرية. يمكن تعديل هذا البروتوكول في عدة طرق. لنسخ في المختبر، وآخر بوليميريز RNA عاثية (على سبيل المثال، T3 أو T7) يمكن استخدامها جنبا إلى جنب مع تسلسل المروج واضحة المعالم في 27 كموقع للجولة الاعادة، وهو موقع قيود مختلفة يمكن أن تستخدم إذا كان غير موجود في الجينوم الفيروسي RNA وإذا الاصطناعية من كدنا] خطي ينتهي مع &#39;نهاية 3 الأصيلة. وقد أثبتت أهمية تسلسل النوكليوتيدات 3&#39;نهاية نقصان ~ 10 أضعاف في RNA العدوى عندما يحتوي RNA الاصطناعية ثلاثة أو أربعة النيوكليوتيدات الفيروسات لا علاقة لها في &#39;نهاية 3. 27 وفي النسخ في المختبر رد الفعل، على حد سواء م 7 G (5 &#39;) تعادل القوة الشرائية (5&#39;) ألف وم 7 G (5 &#39;) تعادل القوة الشرائية (5&#39;) G غطاء التناظرية يمكن استخدامها على حد سواء بشكل جيد، على الرغم من أن الأماكن الأخيرة للا علاقة G النوكليوتيدات إضافية من المنبع الفيروسية 5 &#39;-end، ولكن هذابالإضافة إلى ذلك لا يغير من العدوى أو تكرار RNA الاصطناعية. 27 وعلاوة على ذلك، وإزالة القالب كدنا] من النصوص التي كتبها RNA الدناز I الهضم ليست ضرورية لاجراء اختبارات الحمض النووي الريبي العدوى، لأن قالب [كدنا في حد ذاته ليس معديا. 27 وقد تم الآن تطبيق التكنولوجيا BAC لبناء استنساخ [كدنا] المعدية لحفنة من فيروسات RNA إيجابية حبلا، وهما، وهما JEVs، CNU / LP2 27 و SA 14 -14-2 28 (حجم الجينوم، ~ 11 كيلو بايت)؛ اثنين من فيروسات حمى الضنك، BR / 90 26 و NGC 29 (~ 11 كيلو بايت)؛ والبقري الفيروسي فيروس الإسهال، SD1 (~ 12 كيلو بايت) (25)؛ اثنان الكلاسيكية فيروسات حمى الخنازير، C وبادربورن (~ 12 كيلو بايت)؛ 24 فيروس مرض الحدود، جيفهورن (~ 12 كيلو بايت)؛ 24 فيروس متلازمة الجهاز التنفسي والتناسلي الخنازير ، PL97-1 / LP1 (~ 15 كيلو بايت) (30)؛ وفيروس التهاب المعدة والأمعاء انتقال، PUR46-MAD (~ 29 كيلو بايت) (16)؛ والقطط فيروس الصفاق المعدي،DF-2 (~ 29 كيلو بايت) (32)؛ وشديد التاجى المتلازمة التنفسية الحادة، أورباني (~ 30 كيلو بايت)؛ 9 الشرق الأوسط التنفسي متلازمة التاجى، EMC / 2012 (~ 30 كيلو بايت) (17)؛ والتاجى البشري، OC43 (~ 31 كيلوبايت) 31 والميزة الرئيسية لاستخدام البكالوريا لبناء كدنا] هو الاستقرار الجيني عالية من كبيرة، 1- أو 2-نسخة البلازميدات BAC؛ ومع ذلك، فإن الطبيعة الجوهرية للرقم ونسخة منخفضة للغاية لها هي أيضا عيب كبير، بسبب العائدات المنخفضة جدا من الحمض النووي BAC وما يترتب عليه من انخفاض في نقاء DNA BAC مع الاحترام لاستضافة DNA الكروموسومات. في البروتوكول الحالي، يتم تكبير العائد من BAC DNA من خلال زراعة E. القولونية DH10B تحولت مع BAC pBAC المعدية / SA 14 -14-2 في وسط الغنية بالمغذيات، 2xYT. وعلى الرغم من هذه الجهود، ومتوسط ​​العائد هو فقط ~ 15 ميكروغرام من الحمض النووي BAC من 500 مل من مرق 2xYT. أيضا، فإن أفضل طريقة لتحقيق نقاء DNA BAC باستخدام CSCL-EtBr التدرج الكثافة الطرد المركزي لتنقيةبدلا من يشيع استخدامها على أساس العمود البلازميد العزلة. ومع ذلك، فمن المهم أن نأخذ في الاعتبار أن E.-تحولت BAC يجب القولونية لا كسا الأرض لأنه قد يعرض للخطر الاستقرار الجيني للكدنا] المستنسخة، ولا تؤدي زيادة النمو بالضرورة إلى زيادة الغلة أو DNA BAC-نقاء أعلى. بروتوكول الموصوفة هنا هو والكفاءة، وطريقة مبسطة الأمثل لبناء ونشر مستقر وراثيا كامل طول كدنا] المعدية استنساخ باعتباره BAC لJEV، وهو إجراء يعتقد مرة واحدة مستحيلة عمليا. ويمكن أيضا أن تطبق هذه الاستراتيجية استنساخ نفسها إلى العديد من الفيروسات RNA إيجابية حبلا أخرى. بشكل عام، استنساخ [كدنا] المعدية تمكننا من تقديم مجموعة متنوعة من الطفرات (على سبيل المثال، الحذف، الإدراج، والطفرات نقطة) في الجينوم الفيروسي RNA لدراسة الوظائف البيولوجية في تكاثر الفيروس والمرضية. هذا النظام الوراثة العكسية القائم على كدنا] يجعل من الممكن تطوير وقسم التدريب والامتحاناتلقاح ر والمرشحين العلاجية التي تستهدف عامل الفوعة (ق) من معين فيروس RNA إيجابية حبلا من الفائدة. بالإضافة إلى ذلك، يمكن أيضا أن تستخدم هذه التكنولوجيا كدنا] المعدية كناقل الفيروسي، قادرة على التعبير عن جينات غريبة (ق) من الفائدة للعديد من التطبيقات في مجال البحوث الطبية الحيوية.

لالفيروسات RNA، أدلى ظهور تكنولوجيا الحمض النووي المؤتلف في أواخر 1970s من الممكن تحويل الجينوم RNA الفيروسي إلى استنساخ كدنا]، والتي يمكن بعد ذلك نشرها كما البلازميدات في البكتيريا للتلاعب الجيني للفيروسات RNA. 1 فيروس RNA الأول أن يكون كان جزيئيا المستنسخة الجراثيم Qβ، فيروس RNA إيجابي المنطلق الذي يصيب القولونية. البلازميد التي تحتوي على نسخة كدنا] كاملة من الحمض النووي الريبي الجيني Qβ أدت إلى فاجات Qβ المعدية عندما أدخلت E. القولونية. 2 بعد ذلك بوقت قصير، تم تطبيق هذه التقنية لفيروس شلل الأطفال، وهو فيروس RNA إيجابي حبلا من البشر والحيوانات. تم المعدية عند transfected البلازميد تحمل كدنا] بالطول من الحمض النووي الريبي الجيني لفيروس شلل الأطفال في خلايا الثدييات وقادرة على انتاج virions المعدية 3 في هذا النهج &quot;التي تطلق DNA&quot;، يجب نسخها على cDNAs المستنسخة داخل الخلية لبدء النسخ المتماثل RNA الفيروسي؛ومع ذلك، فإنه من غير الواضح كيف يتم بدء النسخ وكيف تتم معالجة النصوص إلى تسلسل الفيروسي الصحيح. وقد أدى هذا الاهتمام إلى وضع بديل &quot;تطلق RNA&quot; النهج، حيث يتم استنساخ نسخة كدنا] كاملة من الجينوم الفيروسي RNA تحت المروج المعترف بها من قبل E. كولاي أو فج RNA البلمرة لإنتاج الرنا الاصطناعية في المختبر مع المعرفة 5 &#39;و 3&#39; تيرميني، التي تخضع لدورة تكاثر الفيروس كاملة عندما قدم إلى الخلايا المضيفة. 4،5 أفيد أول نجاح مع هذا النهج للبروم فيروس الفسيفساء ، 6،7 فيروس RNA إيجابي حبلا من النباتات. ومنذ ذلك الحين، تم وضع نهج أطلقت RNA لمجموعة واسعة من فيروسات RNA إيجابية المنطلق، بما في ذلك الكأسية (Caliciviruses)، alphaviruses، flaviviruses، arteriviruses، والفيروسات الإكليلية. 1،4،5،8 في كل من DNA- RNA وإطلاق أنظمة الوراثة العكسية، بناء القل طول كدنا] استنساخ هو المفتاح لتوليد الحمض النووي RNA المعدية أو من فيروسات RNA إيجابية المنطلق، ولكنه يصبح تحديا كبيرا الفني كما يزيد حجم الجينوم الفيروسي. 9-17 وعلى وجه الخصوص، الجينوم RNA كبير من ~ 10 -32 كيلوبايت تقدم ثلاث عقبات رئيسية في استنساخ [كدنا] وظيفي كامل طول. 18 وتكمن الصعوبة الأولى هي توليف [كدنا المؤمنين نسخ، لأن الإخلاص للRT-PCR يتناسب عكسيا مع طول RNA الفيروسي. العقبة الثانية هي وجود تسلسل السامة، لأن جزيئات الحمض النووي الريبي طويلة أكثر عرضة لتحتوي على تسلسلات غير متوقعة قادرة على صنع جزء كدنا] في البلازميدات غير المستقرة في E. القولونية. العدد الثالث والأكثر أهمية هو توافر ناقل مناسب، لأنه من الصعب العثور على ناقلات الاستنساخ الذي يتسع لادخال كدنا] الفيروسية&gt; 10 كيلو بايت. على مدى العقود الثلاثة الماضية، وقد تم التغلب على هذه العقبات عن طريق العديد من التطورات في علم الإنزيمات، منهجية، وهيد vectorology. 1،4،5،8 ومن بين هؤلاء، وتطوير الواعدة والمبتكرة هي استنساخ كبيرة فيروسات RNA إيجابية حبلا الكروموسومات الاصطناعية البكتيرية المعدية كما (البكالوريا). ناقلات BAC هو البلازميد-نسخة منخفضة الاستنساخ (1-2 نسخ / خلية) استنادا إلى E. عامل الخصوبة القولونية، ويبلغ متوسط ​​حجم إدراج DNA من ~ 120-350 كيلوبايت 19-21 يتم إدخال جزء الحمض النووي في ناقلات BAC بطريقة مماثلة لاستنساخ في ناقلات الاستنساخ العامة؛ ينتج عن ذلك من الحيوانات المستنسخة BAC مستقرة على مدى عدة أجيال في E. القولونية. 22،23 وحتى الآن، وقد استخدمت هذه التكنولوجيا لخلق BAC استنساخ [كدنا] المعدية ل&gt; 10 أعضاء من ثلاث عائلات فيروس RNA إيجابية المنطلق، أي الفيروسات المصفرة، 24-29 Arteriviridae و 30 و Coronaviridae. 9،16،17 ، 31،32 باستخدام فيروس التهاب الدماغ الياباني (JEV) كمثال، تقارير العمل الحالي الإجراءات التفصيلية التي يمكن أن تكونتستخدم لبناء كامل طول BAC المعدية مستقر وراثيا لمجموعة متنوعة من الفيروسات RNA إيجابية حبلا. JEV هو الفيروسة المصفرة الحيوانية 33 التي تم إرسالها في الطبيعة بين الطيور والخنازير، ويستضيف الفقاريات الآخرين من خلال البعوض الناقل. 34،35 في البشر، والعدوى JEV يمكن أن يسبب مرض عصبي التهاب الدماغ الياباني غالبا ما يكون مميتا شديد (JE)، 36 الذي يحدث في آسيا وأجزاء من غرب المحيط الهادئ، 37،38 مع حدوث سنوي يقدر ب ~ 50،000-175،000 الحالات السريرية. 39،40 الجينوم من JEV هو ~ 11 كيلو بايت، واحد الذين تقطعت بهم السبل،-بالمعنى الإيجابي جزيء RNA وتتكون من واحد إطار القراءة المفتوحة (ORF) يحيط بها اثنان مناطق غير الترميز (NCRS) في 5 &#39;و 3&#39; ينتهي. 41،42 وORF يشفر polyprotein التي المشقوق من قبل المضيف والبروتياز الفيروسية لتوليد 10 البروتينات الفردية، المعين C، PRM، E، NS1، NS2A، NS2B، NS3، NS4A، NS4B، وNS5 في N- إلى الاتجاه C-المحطة. 34،43،44 أيضا، عن طريق البريدوأعرب عن شكل xtended من NS1 (NS1 &#39;) من قبل -1 frameshifting الريباسي في الكودونات 8-9 من NS2A. 45،46 من هذه البروتينات 11، والبروتينات الهيكلية الثلاثة (C، PRM، وE) ضرورية لتشكيل المعدية virions، 47،48 وثمانية البروتينات غير الهيكلية المتبقية (NS1 إلى NS5، وNS1 &#39;) هي الحاسمة لتكاثر الفيروس RNA، والتجمع 49-51 الجسيمات، 52-56 والفطري التهرب من الحصانة. 57-59 كل 5&#39; و 3 &#39;NCRS تحتوي يحفظ تسلسل الابتدائية و/ هياكل التعليم العالي شكل RNA الثانوية، 60-62 التي تعتبر هامة لتحوير تكرار RNA الفيروسي. 63،64 يصف هذا البروتوكول الأدوات والأساليب والاستراتيجيات لتوليد كامل طول BAC المعدية من JEV SA 14 -14-2. يحتوي على 28 استنساخ هذا BAC الوظيفي نسخة كدنا] كاملة من الحمض النووي الريبي الجيني JEV، 65 التي تشملها المروج لالبلمرة SP6 RNA المنبعمن الفيروسية 5&#39;نهاية وفريدة من نوعها Xba I موقع تقييد المصب من الفيروسية 3&#39;نهاية لفي المختبر الاعادة النسخ. هذه التكنولوجيا BAC قابلة للتطبيق على بناء كدنا] استنساخ الجزيئية تعمل بكامل طاقتها لمجموعة من الفيروسات RNA إيجابية حبلا.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;1. Molecular Cloning&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2xYT Broth</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y2377</td><td></td></tr><tr><td>[&lt;sup&gt;3&lt;/sup&gt;H]UTP</td><td>PerkinElmer</td><td>NET380250UC</td><td>Radioactive</td></tr><tr><td>50 ml Tube</td><td>Thermo Scientific (Nalgene)</td><td>3114-0050</td><td></td></tr><tr><td>250 ml Bottle</td><td>Beckman Coulter</td><td>356011</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Lonza</td><td>50004</td><td></td></tr><tr><td>Agarose (Low Melting Point)</td><td>Life Technologies (Invitrogen)</td><td>16520-100</td><td></td></tr><tr><td>AvaI</td><td>New England BioLabs</td><td>R0152S</td><td></td></tr><tr><td>AvrII</td><td>New England BioLabs</td><td>R0174S</td><td></td></tr><tr><td>BamHI</td><td>New England BioLabs</td><td>R0136S</td><td></td></tr><tr><td>BsiWI</td><td>New England BioLabs</td><td>R0553S</td><td></td></tr><tr><td>BsrGI</td><td>New England BioLabs</td><td>R0575S</td><td></td></tr><tr><td>Butanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A399-1&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Cesium Chloride</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1595-1</td><td></td></tr><tr><td>Chloramphenicol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0378</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2432</td><td>Carcinogenic</td></tr><tr><td>DE-81 Filter Paper</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>3658-023</td><td></td></tr><tr><td>dNTP mix</td><td>Life Technologies (Invitrogen)</td><td>18427-088</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; DH10B&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies (Invitrogen)</td><td>18297-010</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023</td><td></td></tr><tr><td>Ethidium Bromide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7637</td><td>Toxic and highly mutagenic</td></tr><tr><td>Filter Column (Plasmid Maxiprep Kit)</td><td>Life Technologies (Invitrogen)</td><td>K2100-26</td><td></td></tr><tr><td>Glacial Acetic Acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6283</td><td>Irritating</td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5400</td><td></td></tr><tr><td>Glycogen&amp;nbsp;</td><td>Roche</td><td>10901393001</td><td></td></tr><tr><td>High-fidelity DNA Polymerase</td><td>New England BioLabs</td><td>M0491S</td><td></td></tr><tr><td>Isoamyl Alcohol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I9392</td><td>Flammable</td></tr><tr><td>Isopropanol&amp;nbsp;</td><td>Amresco</td><td>0918</td><td>Flammable</td></tr><tr><td>LB Broth</td><td>Life Technologies (Invitrogen)</td><td>12795-027</td><td></td></tr><tr><td>Lithium Chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L9650</td><td></td></tr><tr><td>Lysozyme</td><td>Amresco</td><td>0663</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium Chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>M-MLV Reverse Transcriptase</td><td>Life Technologies (Invitrogen)</td><td>18080-044</td><td></td></tr><tr><td>Mung Bean Nuclease</td><td>New England BioLabs</td><td>M0250S</td><td></td></tr><tr><td>Needle (18G, 20G)</td><td>BD</td><td>305196, 305175</td><td>Biohazardous (Sharps waste)</td></tr><tr><td>NotI</td><td>New England BioLabs</td><td>R0189S</td><td></td></tr><tr><td>Oligonucleotide</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>Custom Oligonucleotide Synthesis</td><td></td></tr><tr><td>PacI</td><td>New England BioLabs</td><td>R0547S</td><td></td></tr><tr><td>pBeloBAC11</td><td>New England BioLabs</td><td>ER2420S (E4154S)</td><td></td></tr><tr><td>Phenol (Buffer-Saturated)</td><td>Life Technologies (Invitrogen)</td><td>15513-039</td><td>Toxic and highly corrosive</td></tr><tr><td>Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol</td><td>Life Technologies (Invitrogen)</td><td>15593-031</td><td>Toxic and highly corrosive</td></tr><tr><td>Phenol:Guanidine Isothiocyanate</td><td>Life Technologies (Ambion)</td><td>10296-010</td><td>Toxic, corrosive, and irritating</td></tr><tr><td>Pme I</td><td>New England BioLabs</td><td>R0560S</td><td></td></tr><tr><td>Potassium Acetate</td><td>Amresco</td><td>0698</td><td></td></tr><tr><td>RNase Inhibitor</td><td>Life Technologies (Invitrogen)</td><td>10777-019</td><td></td></tr><tr><td>rNTP Set</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>27-2025-01</td><td></td></tr><tr><td>Sealable Polypropylene Tube (16 &amp;times; 76 mm)&amp;nbsp;</td><td>Beckman Coulter</td><td>342413</td><td></td></tr><tr><td>SfiI</td><td>New England BioLabs</td><td>R0123S</td><td></td></tr><tr><td>Sma I</td><td>New England BioLabs</td><td>R0141S</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Acetate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2889</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Dodecyl Sulfate</td><td>Amresco</td><td>0227</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Hydroxide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5881</td><td></td></tr><tr><td>SP6 RNA Polymerase</td><td>New England BioLabs</td><td>M0207S</td><td></td></tr><tr><td>Spin Column (Plasmid Miniprep Kit)</td><td>Life Technologies (Invitrogen)</td><td>K2100-11</td><td></td></tr><tr><td>Syringe</td><td>HSW NORM-JECT</td><td>4200.000V0</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA Ligase</td><td>New England BioLabs</td><td>M0202S</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Amresco</td><td>0826</td><td></td></tr><tr><td>tRNA (yeast)</td><td>Life Technologies (Invitrogen)</td><td>15401-011</td><td></td></tr><tr><td>XbaI&amp;nbsp;</td><td>New England BioLabs</td><td>R0145S</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;2. Cell Culture&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alpha Minimal Essential Medium</td><td>Life Technologies (Gibco)</td><td>12561-049</td><td></td></tr><tr><td>Conical Tube (50 mL)</td><td>VWR</td><td>21008-242</td><td></td></tr><tr><td>Crystal Violet&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0775</td><td></td></tr><tr><td>Culture Dish (150 mm)&amp;nbsp;</td><td>TPP</td><td>93150&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Cuvette (2-mm Gap)</td><td>Harvard Apparatus</td><td>450125&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies (Gibco)</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1635</td><td>Toxic and carcinogenic</td></tr><tr><td>Glutamine</td><td>Life Technologies (Gibco)</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>Minimal Essential Medium</td><td>Life Technologies (Gibco)</td><td>61100-061</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Life Technologies (Gibco)</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>Potassium Chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>Potassium Phosphate Monobasic</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9791</td><td></td></tr><tr><td>Six-Well Plate</td><td>TPP</td><td>92006</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Phosphate Dibasic</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3264</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0.25%)</td><td>Life Technologies (Gibco)</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>Vitamins</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6895</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;3. Equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agarose Gel Electrophoresis System</td><td>Mupid</td><td>MPDEXU-01</td><td></td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; Incubator</td><td>Thermo Scientific</td><td>Heracell 150i</td><td></td></tr><tr><td>Desktop Centrifuge&amp;nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>ST16R</td><td></td></tr><tr><td>Electroporator</td><td>Harvard Apparatus</td><td>ECM 830</td><td></td></tr><tr><td>Longwave Ultraviolet Lamps (Handheld)</td><td>UVP</td><td>UVGL-58</td><td></td></tr><tr><td>Tabletop Centrifuge</td><td>Beckman Coulter</td><td>368826</td><td></td></tr><tr><td>Thermocycler</td><td>Life Technologies (Applied Biosystems)</td><td>GeneAmp PCR System 9700</td><td></td></tr><tr><td>Vortexer</td><td>Scientific Industries</td><td>G-560</td><td></td></tr><tr><td>Water Bath</td><td>Jeio Tech</td><td>WB-10E</td><td></td></tr></tbody></table>

bacterial artificial chromosomes: a functional genomics tool for the study of positive-strand rna viruses

Reverse genetics, an approach to rescue infectious virus entirely from a cloned cDNA, has revolutionized the field of positive-strand RNA viruses, whose genomes have the same polarity as cellular mRNA. The cDNA-based reverse genetics system is a seminal method that enables direct manipulation of the viral genomic RNA, thereby generating recombinant viruses for molecular and genetic studies of both viral RNA elements and gene products in viral replication and pathogenesis. It also provides a valuable platform that allows the development of genetically defined vaccines and viral vectors for the delivery of foreign genes. For many positive-strand RNA viruses such as Japanese encephalitis virus (JEV), however, the cloned cDNAs are unstable, posing a major obstacle to the construction and propagation of the functional cDNA. Here, the present report describes the strategic considerations in creating and amplifying a genetically stable full-length infectious JEV cDNA as a bacterial artificial chromosome (BAC) using the following general experimental procedures: viral RNA isolation, cDNA synthesis, cDNA subcloning and modification, assembly of a full-length cDNA, cDNA linearization, in vitro RNA synthesis, and virus recovery. This protocol provides a general methodology applicable to cloning full-length cDNA for a range of positive-strand RNA viruses, particularly those with a genome of &gt;10 kb in length, into a BAC vector, from which infectious RNAs can be transcribed in vitro with a bacteriophage RNA polymerase.

Watch this Scientific Journal Video about Bacterial Artificial Chromosomes: A Functional Genomics Tool for the Study of Positive-strand RNA Viruses at JoVE.com

Bacterial Artificial Chromosomes: A Functional Genomics Tool for the Study of Positive-strand RNA Viruses

Here, a protocol is presented for creating an infectious bacterial artificial chromosome containing a full-length cDNA of the positive-strand genomic RNA of Japanese encephalitis virus. This protocol can be used to construct a functional cDNA of other positive-strand RNA viruses, making it a powerful genomic tool for studying virus biology.

بكتيريا الاصطناعية الكروموسومات: أداة علم الجينوم وظيفية لدراسة الفيروسات RNA إيجابي حبلا

Reverse genetics, an approach to rescue infectious virus entirely from a cloned cDNA, has revolutionized the field of positive-strand RNA viruses, whose ...

bacterial-artificial-chromosomes-functional-genomics-tool-for-study

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

21.3K Views.  Utah State University. Here, a protocol is presented for creating an infectious bacterial artificial chromosome containing a full-length cDNA of the positive-strand genomic RNA of Japanese encephalitis virus. This protocol can be used to construct a functional cDNA of other positive-strand RNA viruses, making it a powerful genomic tool for studying virus biology.

Video: Bacterial Artificial Chromosomes: A Functional Genomics Tool for the Study of Positive-strand RNA Viruses

Simple and Robust in vivo and in vitro Approach for Studying Virus Assembly

In viruses with positive-sense RNA genomes pathogenic to humans, animals and plants, progeny encapsidation into mature and stable virions is a cardinal phase during establishment of infection in a given host. Consequently, study of encapsidation deciphers the information regarding the know-how of the mechanism regulating virus assembly to form infectious virions. Such information is vital in formulating novel methods of curbing virus spread and disease control. Virus encapsidation can be studied in vivo and in vitro. Genome encapsidation in vivo is a highly regulated selective process involving macromolecular interactions and subcellular compartmentalization. Therefore, study leading to dissect events encompassing virus encapsidation in vivo would provide basic knowledge to understand how viruses proliferate and assemble. Recently in vitro encapsidation has been exploited for the research in the area of biomedical imaging and therapeutic applications. Non-enveloped plant viruses stand far ahead in the venture of in vitro encapsidation of the negatively charged foreign material. Brome mosaic virus (BMV), a non-enveloped multicomponent RNA virus pathogenic to plants, has been used as a model system for studying genome packaging in vivo and in vitro. For encapsidation assays in Nicotiana benthamiana plants, Agrobacterium -mediated transient expression, refer to as agroinfiltration, is an efficient and robust technique for the synchronized delivery and expression of multiple components to the same cell. In this approach, a suspension of Agrobacterium tumefaciens cells carrying binary plasmid vectors carrying cDNAs of desiredviral mRNAs is infiltrated into the intercellular space withina leaf using nothing more sophisticated than a 1 ml disposable syringe (without needle). This process results in the transfer of DNA insert into plant cells; the T-DNA insert remains transiently in the nucleus and is then transcribed by the host polymerase II, leading to the transient expression. The resulting mRNA transcript (capped and polyadenylated) is then exported to the cytoplasm for translation. After approximately 24 to 48 hours of incubation,sections of infiltrated leaves can be sampled for microscopyor biochemical analyses. Agroinfiltration permits large numbers (hundreds to thousands) of cells to be transfected simultaneously. For in vitro encapsidation, purified virions of BMV are dissociated into capsid protein by dialyzing against dissociation buffer containing calcium chloride followed by removal of RNA and un-dissociated virions by centrifugation. Genome depleted capsid protein subunits are then reassembled with desired viral genome components or non-viral components such as indocyanine dye.

Simple and Robust in vivo and in vitro Approach for Studying Virus Assembly

A simple, efficient and robust way to synchronize the delivery of multiple viral components to plant cells via Agrobacterium-mediated transient expression is described. This approach is amenable for studying replication, encapsidation followed by in vitro reassembly of non-viral components into genome depleted optical viral ghosts suitable for biomedical applications.

بسيطة وقوية في الجسم الحي و في المختبر مدخل لدراسة الجمعية فيروس

In viruses with positive-sense RNA genomes pathogenic to humans, animals and plants, progeny encapsidation into mature and stable virions is a cardinal ...

High-throughput Screening for Broad-spectrum Chemical Inhibitors of RNA Viruses

RNA viruses are responsible for major human diseases such as flu, bronchitis, dengue, Hepatitis C or measles. They also represent an emerging threat because of increased worldwide exchanges and human populations penetrating more and more natural ecosystems. A good example of such an emerging situation is chikungunya virus epidemics of 2005-2006 in the Indian Ocean. Recent progresses in our understanding of cellular pathways controlling viral replication suggest that compounds targeting host cell functions, rather than the virus itself, could inhibit a large panel of RNA viruses. Some broad-spectrum antiviral compounds have been identified with host target-oriented assays. However, measuring the inhibition of viral replication in cell cultures using reduction of cytopathic effects as a readout still represents a paramount screening strategy. Such functional screens have been greatly improved by the development of recombinant viruses expressing reporter enzymes capable of bioluminescence such as luciferase. In the present report, we detail a high-throughput screening pipeline, which combines recombinant measles and chikungunya viruses with cellular viability assays, to identify compounds with a broad-spectrum antiviral profile.

In vitro assays to measure virus replication have been greatly improved by the development of recombinant RNA viruses expressing luciferase or other enzymes capable of bioluminescence. Here we detail a high-throughput screening pipeline that combines such recombinant strains of measles and chikungunya viruses to isolate broad-spectrum antivirals from chemical libraries.

الإنتاجية العالية للفحص واسع الطيف الكيميائية مثبطات الحمض النووي الريبي الفيروسات

RNA viruses are responsible for major human diseases such as flu, bronchitis, dengue, Hepatitis C or measles. They also represent an emerging threat ...

Reverse Genetics to Engineer Positive-Sense RNA Virus Variants

The lack of a convenient method for the iterative generation of diverse full-length viral variants has impeded the study of directed evolution in RNA viruses. By integrating a full RNA genome error-prone PCR and reverse genetics, random genome-wide substitution mutagenesis can be induced. We have developed a method using this technique to synthesize diverse libraries to identify viral mutants with phenotypes of interest. This method, called full-length mutant RNA synthesis (FL-MRS), offers the following advantages: (i) the ability to create a large library via a highly efficient one-step error-prone PCR; (ii) the ability to create groups of libraries with varying levels of genetic diversity by manipulating the fidelity of DNA polymerase; (iii) the creation of a full-length PCR product that can directly serve as a template for mutant RNA synthesis; and (iv) the ability to create RNA that can be delivered into host cells as a non-selected input pool to screen for viral mutants of the desired phenotype. We have found, using a reverse genetics approach, that FL-MRS is a reliable tool to study viral-directed evolution at all stages in the life cycle of the hepatitis C virus, JFH1 isolate. This technique appears to be an invaluable tool to employ directed evolution to understand adaptation, replication, and the role of viral genes in pathogenesis and antiviral resistance in positive-sense RNA viruses.

The protocol describes a method for introducing controllable genetic diversity in the hepatitis C virus genome by combining full-length mutant RNA synthesis using error-prone PCR and reverse genetics. The method provides a model for phenotype selection and can be used for 10 kb long positive-sense RNA virus genomes.

علم الوراثة العكسي لهندسة متغيرات فيروس الحمض النووي الريبي ذات الحس الإيجابي

The lack of a convenient method for the iterative generation of diverse full-length viral variants has impeded the study of directed evolution in RNA ...

Genetics

Generation and Assembly of Virus-Specific Nucleocapsids of the Respiratory Syncytial Virus

The use of an authentic RNA template is critical to advance the fundamental knowledge of viral RNA synthesis that can guide both mechanistic discovery and assay development in virology. The RNA template of nonsegmented negative-sense (NNS) RNA viruses, such as the respiratory syncytial virus (RSV), is not an RNA molecule alone but rather a nucleoprotein (N) encapsidated ribonucleoprotein complex. Despite the importance of the authentic RNA template, the generation and assembly of such a ribonucleoprotein complex remain sophisticated and require in-depth elucidation. The main challenge is that the overexpressed RSV N binds non-specifically to cellular RNAs to form random nucleocapsid-like particles (NCLPs). Here, we established a protocol to obtain RNA-free N (N0) first by co-expressing N with a chaperone phosphoprotein (P), then assembling N0 with RNA oligos with the RSV-specific RNA sequence to obtain virus-specific nucleocapsids (NCs). This protocol shows how to overcome the difficulty in the preparation of this traditionally challenging viral ribonucleoprotein complex.

For in-depth mechanistic analysis of the respiratory syncytial virus (RSV) RNA synthesis, we report a protocol of utilizing the chaperone phosphoprotein (P) for coexpression of the RNA-free nucleoprotein (N0) for subsequent in vitro assembly of the virus-specific nucleocapsids (NCs).

توليد وتجميع النوى الخاصة بالفيروسات من الفيروسات المتزامنة التنفسية

The use of an authentic RNA template is critical to advance the fundamental knowledge of viral RNA synthesis that can guide both mechanistic discovery and ...

Biochemistry

Modeling The Lifecycle Of Ebola Virus Under Biosafety Level 2 Conditions With Virus-like Particles Containing Tetracistronic Minigenomes

Ebola viruses cause severe hemorrhagic fevers in humans and non-human primates, with case fatality rates as high as 90%. There are no approved vaccines or specific treatments for the disease caused by these viruses, and work with infectious Ebola viruses is restricted to biosafety level 4 laboratories, significantly limiting the research on these viruses. Lifecycle modeling systems model the virus lifecycle under biosafety level 2 conditions; however, until recently such systems have been limited to either individual aspects of the virus lifecycle, or a single infectious cycle. Tetracistronic minigenomes, which consist of Ebola virus non-coding regions, a reporter gene, and three Ebola virus genes involved in morphogenesis, budding, and entry (VP40, GP1,2, and VP24), can be used to produce replication and transcription-competent virus-like particles (trVLPs) containing these minigenomes. These trVLPs can continuously infect cells expressing the Ebola virus proteins responsible for genome replication and transcription, allowing us to safely model multiple infectious cycles under biosafety level 2 conditions. Importantly, the viral components of this systems are solely derived from Ebola virus and not from other viruses (as is, for example, the case in systems using pseudotyped viruses), and VP40, GP1,2 and VP24 are not overexpressed in this system, making it ideally suited for studying morphogenesis, budding and entry, although other aspects of the virus lifecycle such as genome replication and transcription can also be modeled with this system. Therefore, the tetracistronic trVLP assay represents the most comprehensive lifecycle modeling system available for Ebola viruses, and has tremendous potential for use in investigating the biology of Ebola viruses in future. Here, we provide detailed information on the use of this system, as well as on expected results.

Work with infectious Ebola viruses is restricted to biosafety level 4 laboratories. Tetracistronic minigenome-containing replication and transcription-competent virus like particles (trVLPs) represent a lifecycle modeling system that allows us to safely model multiple infectious cycles under biosafety level 2 conditions, relying exclusively on Ebola virus components.

نماذج دورة حياة فيروس الايبولا تحت شروط السلامة الأحيائية المستوى 2 مع جزيئات تشبه الفيروسات يحتوي على Tetracistronic Minigenomes

Ebola viruses cause severe hemorrhagic fevers in humans and non-human primates, with case fatality rates as high as 90%. There are no approved vaccines or ...

Combining Analysis of DNA in a Crude Virion Extraction with the Analysis of RNA from Infected Leaves to Discover New Virus Genomes

This metagenome approach is used to identify plant viruses with circular DNA genomes and their transcripts. Often plant DNA viruses that occur in low titers in their host or cannot be mechanically inoculated to another host are difficult to propagate to achieve a greater titer of infectious material. Infected leaves are ground in a mild buffer with optimal pH and ionic composition recommended for purifying most bacilliform Para retroviruses. Urea is used to break up inclusion bodies that trap virions and to dissolve cellular components. Differential centrifugation provides further separation of virions from plant contaminants. Then proteinase K treatment removes the capsids. Then the viral DNA is concentrated and used for next-generation sequencing (NGS). The NGS data are used to assemble contigs which are submitted to NCBI-BLASTn to identify a subset of virus sequences in the generated dataset. In a parallel pipeline, RNA is isolated from infected leaves using a standard column-based RNA extraction method. Then ribosome depletion is carried out to enrich for a subset of mRNA and virus transcripts. Assembled sequences derived from RNA sequencing (RNA-seq) were submitted to NCBI-BLASTn to identify a subset of virus sequences in this dataset. In our study, we identified two related full-length badnavirus genomes in the two datasets. This method is preferred to another common approach which extracts the aggregate population of small RNA sequences to reconstitute plant virus genomic sequences. This latter metagenomic pipeline recovers virus related sequences that are retro-transcribing elements inserted into the plant genome. This is coupled to biochemical or molecular assays to further discern the actively infectious agents. The approach documented in this study, recovers sequences representative of replicating viruses that likely indicate active virus infection.

Here we present a new approach to identify plant viruses with double-strand DNA genomes. We use standard methods to extract DNA and RNA from infected leaves and carry out next-generation sequencing. Bioinformatic tools assemble sequences into contigs, identify contigs representing virus genomes and assign genomes to taxonomic groups.

الجمع بين تحليل للحمض النووي في مجال استخراج النفط خام Virion بتحليل الحمض النووي الريبي من الأوراق المصابة اكتشاف جينومات الفيروس الجديد

This metagenome approach is used to identify plant viruses with circular DNA genomes and their transcripts. Often plant DNA viruses that occur in low ...

Arbovirus Infections As Screening Tools for the Identification of Viral Immunomodulators and Host Antiviral Factors

RNA interference- and genome editing-based screening platforms have been widely used to identify host cell factors that restrict virus replication. However, these screens are typically conducted in cells that are naturally permissive to the viral pathogen under study. Therefore, the robust replication of viruses in control conditions may limit the dynamic range of these screens. Furthermore, these screens may be unable to easily identify cellular defense pathways that restrict virus replication if the virus is well-adapted to the host and capable of countering antiviral defenses. In this article, we describe a new paradigm for exploring virus-host interactions through the use of screens that center on naturally abortive infections by arboviruses such as vesicular stomatitis virus (VSV). Despite the ability of VSV to replicate in a wide range of dipteran insect and mammalian hosts, VSV undergoes a post-entry, abortive infection in a variety of cell lines derived from lepidopteran insects, such as the gypsy moth (Lymantria dispar). However, these abortive VSV infections can be &#34;rescued&#34; when host cell antiviral defenses are compromised. We describe how VSV strains encoding convenient reporter genes and restrictive L. dispar cell lines can be paired to set-up screens to identify host factors involved in arbovirus restriction. Furthermore, we also show the utility of these screening tools in the identification of virally encoded factors that rescue VSV replication during coinfection or through ectopic expression, including those encoded by mammalian viruses. The natural restriction of VSV replication in L. dispar cells provides a high signal-to-noise ratio when screening for the conditions that promote VSV rescue, thus enabling the use of simplistic luminescence- and fluorescence-based assays to monitor the changes in VSV replication. These methodologies are valuable for understanding the interplay between host antiviral responses and viral immune evasion factors.

Here, we present the protocols to identify 1) virus-encoded immunomodulators that promote arbovirus replication and 2) eukaryotic host factors that restrict arbovirus replication. These fluorescence- and luminescence-based methods allow researchers to rapidly obtain quantitative readouts of arbovirus replication in simplistic assays with low signal-to-noise ratios.

التهابات المفصليات كفحص أدوات للتعرف على العوامل المضادة للفيروسات إيمونومودولاتورس والمضيف الفيروسية

RNA interference- and genome editing-based screening platforms have been widely used to identify host cell factors that restrict virus replication. ...

Confocal Imaging of Double-Stranded RNA and Pattern Recognition Receptors in Negative-Sense RNA Virus Infection

Double-stranded (ds) RNA is produced as a replicative intermediate during RNA virus infection. Recognition of dsRNA by host pattern recognition receptors (PRRs) such as the retinoic acid (RIG-I) like receptors (RLRs) RIG-I and melanoma differentiation-associated protein 5 (MDA-5) leads to the induction of the innate immune response. The formation and intracellular distribution of dsRNA in positive-sense RNA virus infection has been well characterized by microscopy. Many negative-sense RNA viruses, including some arenaviruses, trigger the innate immune response during infection. However, negative-sense RNA viruses were thought to produce low levels of dsRNA, which hinders the imaging study of PRR recognition of viral dsRNA. Additionally, infection experiments with highly pathogenic arenaviruses must be performed in high containment biosafety level facilities (BSL-4). The interaction between viral RNA and PRRs for highly pathogenic RNA virus is largely unknown due to the additional technical challenges that researchers need to face in the BSL-4 facilities. Recently, a monoclonal antibody (Mab) (clone 9D5) originally used for pan-enterovirus detection has been found to specifically detect dsRNA with a higher sensitivity than the traditional J2 or K1 anti-dsRNA antibodies. Herein, by utilizing the 9D5 antibody, we describe a confocal microscopy protocol that has been used successfully to visualize dsRNA, viral protein and PRR simultaneously in individual cells infected by arenavirus. The protocol is also suitable for imaging studies of dsRNA and PRR distribution in pathogenic arenavirus infected cells in BSL4 facilities.

Double-stranded RNA produced during RNA virus replication can be recognized by pattern recognition receptors to induce an innate immune response. For negative-sense RNA viruses, the interaction between the low-level dsRNA and PRRs remains unclear. We have developed a confocal microscopy method to visualize arenavirus dsRNA and PRR in individual cells.

تصوير [كنفوكل] الحمض النووي الريبي مزدوج-الذين تقطعت بهم السبل ونمط الاعتراف مستقبلات في الإصابة بفيروسات الرنا الشعور السلبي

Double-stranded (ds) RNA is produced as a replicative intermediate during RNA virus infection. Recognition of dsRNA by host pattern recognition receptors ...

Generation, Amplification, and Titration of Recombinant Respiratory Syncytial Viruses

The use of recombinant viruses has become crucial in basic or applied virology. Reverse genetics has been proven to be an extremely powerful technology, both to decipher viral replication mechanisms and to study antivirals or provide development platform for vaccines. The construction and manipulation of a reverse genetic system for a negative-strand RNA virus such as a respiratory syncytial virus (RSV), however, remains delicate and requires special know-how. The RSV genome is a single-strand, negative-sense RNA of about 15 kb that serves as a template for both viral RNA replication and transcription. Our reverse genetics system uses a cDNA copy of the human RSV long strain genome (HRSV). This cDNA, as well as cDNAs encoding viral proteins of the polymerase complex (L, P, N, and M2-1), are placed in individual expression vectors under T7 polymerase control sequences. The transfection of these elements in BSR-T7/5 cells, which stably express T7 polymerase, allows the cytoplasmic replication and transcription of the recombinant RSV, giving rise to genetically modified virions. A new RSV, which is present at the cell surface and in the culture supernatant of BSRT7/5, is gathered to infect human HEp-2 cells for viral amplification. Two or three rounds of amplification are needed to obtain viral stocks containing 1 x 106 to 1 x 107 plaque-forming units (PFU)/mL. Methods for the optimal harvesting, freezing, and titration of viral stocks are described here in detail. We illustrate the protocol presented here by creating two recombinant viruses respectively expressing free green fluorescent protein (GFP) (RSV-GFP) or viral M2-1 fused to GFP (RSV-M2-1-GFP). We show how to use RSV-GFP to quantify RSV replication and the RSV-M2-1-GFP to visualize viral structures, as well as viral protein dynamics in live cells, by using video microscopy techniques.

We describe a method for generating and amplifying genetically modified respiratory syncytial viruses (RSVs) and an optimized plaque assay for RSVs. We illustrate this protocol by creating two recombinant viruses that respectively allow quantification of RSV replication and live analysis of RSV inclusion bodies and inclusion bodies-associated granules dynamics.

جيل، والتضخيم، ومعايرة المؤتلف من فيروسات الجهاز التنفسي المخلوي

The use of recombinant viruses has become crucial in basic or applied virology. Reverse genetics has been proven to be an extremely powerful technology, ...

Rescue of Recombinant Zika Virus from a Bacterial Artificial Chromosome cDNA Clone

The association of Zika virus (ZIKV) infection with neurological complications during the recent worldwide outbreak and the lack of approved vaccines and/or antivirals have underscored the urgent need to develop ZIKV reverse genetic systems to facilitate the study of ZIKV biology and the development of therapeutic and/or prophylactic approaches. However, like with other flaviviruses, the generation of ZIKV full-length infectious cDNA clones has been hampered due to the toxicity of viral sequences during its amplification in bacteria. To overcome this problem, we have developed a nontraditional approach based on the use of bacterial artificial chromosomes (BACs). Using this approach, the full-length cDNA copy of the ZIKV strain Rio Grande do Norte Natal (ZIKV-RGN) is generated from four synthetic DNA fragments and assembled into the single-copy pBeloBAC11 plasmid under the control of the human cytomegalovirus (CMV) immediate-early promoter. The assembled BAC cDNA clone is stable during propagation in bacteria, and infectious recombinant (r)ZIKV is recovered in Vero cells after transfection of the BAC cDNA clone. The protocol described here provides a powerful technique for the generation of infectious clones of flaviviruses, including ZIKV, and other positive-strand RNA viruses, particularly those with large genomes that have stability problems during bacterial&#160;propagation.

The recent epidemic of Zika virus highlights the importance of establishing reverse genetic approaches to develop vaccines and/or therapeutic strategies. Here, we describe the protocol to rescue an infectious recombinant Zika virus from a full-length cDNA clone assembled in a bacterial artificial chromosome under the control of the human cytomegalovirus immediate-early promoter.

إنقاذ فيروس زيكا المؤتلف من استنساخ cDNA كروموسوم اصطناعي جرثومي

The association of Zika virus (ZIKV) infection with neurological complications during the recent worldwide outbreak and the lack of approved vaccines ...

بكتيريا الاصطناعية الكروموسومات: أداة علم الجينوم وظيفية لدراسة الفيروسات RNA إيجابي حبلا

Summary

Explore More Videos

PLAYLIST