We thank Simon Hayward (Vanderbilt University Medical Center) for the BPH-1 cells; and Thomas Cox and Janine Erler (Biotech Research &amp; Innovation Centre, University of Copenhagen) for their assistance with rheological measurements. MR-T was funded by Worldwide Cancer Research, formerly The Association of International Cancer Research (Grant 08-0803 to JS), The British Embassy Montevideo and Agencia Nacional de Investigacion e Innovacion (UK_RH_2015_1_2 to MR-T). MC was supported by Prostate Cancer UK (Grant S14-017 to JS and GS). KW was funded by The China Scholarship Council. MAM was funded by The Saudi Arabian Cultural Bureau.

<ol>
	<li>Timpl, R., Brown, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Supramolecular+assembly+of+basement+membranes.">Supramolecular assembly of basement membranes.</a> Bioessays. 18 (2), 123-132 (1996).</li><li>Yurchenco, P. D., Ruben, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type+IV+collagen+lateral+associations+in+the+EHS+tumor+matrix.+Comparison+with+amniotic+and+in+vitro+networks.">Type IV collagen lateral associations in the EHS tumor matrix. Comparison with amniotic and in vitro networks.</a> Am J Pathol. 132 (2), 278-291 (1988).</li><li>Halfter, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+composition+and+biomechanical+properties+of+in+vivo-derived+basement+membranes.">Protein composition and biomechanical properties of in vivo-derived basement membranes.</a> Cell Adh Migr. 7 (1), 64-71 (2013).</li><li>Candiello, J., Cole, G. J., Halfter, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-dependent+changes+in+the+structure,+composition+and+biophysical+properties+of+a+human+basement+membrane.">Age-dependent changes in the structure, composition and biophysical properties of a human basement membrane.</a> Matrix Biol. 29 (5), 402-410 (2010).</li><li>To, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diabetes-induced+morphological,+biomechanical,+and+compositional+changes+in+ocular+basement+membranes.">Diabetes-induced morphological, biomechanical, and compositional changes in ocular basement membranes.</a> Exp Eye Res. 116, 298-307 (2013).</li><li>Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphogenesis+and+oncogenesis+of+MCF-10A+mammary+epithelial+acini+grown+in+three-dimensional+basement+membrane+cultures.">Morphogenesis and oncogenesis of MCF-10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures.</a> Methods. 30 (3), 256-268 (2003).</li><li>Bello, D., Webber, M. M., Kleinman, H. K., Wartinger, D. D., Rhim, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Androgen+responsive+adult+human+prostatic+epithelial+cell+lines+immortalized+by+human+papillomavirus+18.">Androgen responsive adult human prostatic epithelial cell lines immortalized by human papillomavirus 18.</a> Carcinogenesis. 18 (6), 1215-1223 (1997).</li><li>Hayward, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+and+characterization+of+an+immortalized+but+non-transformed+human+prostate+epithelial+cell+line:+BPH-1.">Establishment and characterization of an immortalized but non-transformed human prostate epithelial cell line: BPH-1.</a> In Vitro Cell Dev Biol Anim. 31 (1), 14-24 (1995).</li><li>Kaighn, M. E., Narayan, K. S., Ohnuki, Y., Lechner, J. F., Jones, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+and+characterization+of+a+human+prostatic+carcinoma+cell+line+(PC-3).">Establishment and characterization of a human prostatic carcinoma cell line (PC-3).</a> Invest Urol. 17 (1), 16-23 (1979).</li><li>Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleavage+of+structural+proteins+during+the+assembly+of+the+head+of+bacteriophage+T4.">Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.</a> Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).</li><li>Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophoretic+transfer+of+proteins+from+polyacrylamide+gels+to+nitrocellulose+sheets:+procedure+and+some+applications.">Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 76 (9), 4350-4354 (1979).</li><li>Rabilloud, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+protein+silver+staining+in+polyacrylamide+gels:+a+10-year+synthesis.">Mechanisms of protein silver staining in polyacrylamide gels: a 10-year synthesis.</a> Electrophoresis. 11 (10), 785-794 (1990).</li><li>Rodriguez-Teja, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AGE-modified+basement+membrane+cooperates+with+Endo180+to+promote+epithelial+cell+invasiveness+and+decrease+prostate+cancer+survival.">AGE-modified basement membrane cooperates with Endo180 to promote epithelial cell invasiveness and decrease prostate cancer survival.</a> J Pathol. 235 (4), 581-592 (2015).</li><li>Graf, B. W., Boppart, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+and+analysis+of+three-dimensional+cell+culture+models.">Imaging and analysis of three-dimensional cell culture models.</a> Methods Mol Biol. 591, 211-227 (2010).</li><li>Yao, N. Y., Larsen, R. J., Weitz, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+nonlinear+rheology+with+inertio-elastic+oscillations.">Probing nonlinear rheology with inertio-elastic oscillations.</a> J Rheology. 52 (4), 1013-1025 (2008).</li><li>Baker, A. M., Bird, D., Lang, G., Cox, T. R., Erler, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lysyl+oxidase+enzymatic+function+increases+stiffness+to+drive+colorectal+cancer+progression+through+FAK.">Lysyl oxidase enzymatic function increases stiffness to drive colorectal cancer progression through FAK.</a> Oncogene. 32 (14), 1863-1868 (2013).</li><li>Caley, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor-associated+Endo180+requires+stromal-derived+LOX+to+promote+metastatic+prostate+cancer+cell+migration+on+human+ECM+surfaces.">Tumor-associated Endo180 requires stromal-derived LOX to promote metastatic prostate cancer cell migration on human ECM surfaces.</a> Clin Exp Metastasis. 3 (2), 151-165 (2016).</li><li>Sturge, J., Wienke, D., East, L., Jones, G. E., Isacke, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GPI-anchored+uPAR+requires+Endo180+for+rapid+directional+sensing+during+chemotaxis.">GPI-anchored uPAR requires Endo180 for rapid directional sensing during chemotaxis.</a> J Cell Biol. 162 (5), 789-794 (2003).</li><li>Sturge, J., Wienke, D., Isacke, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endosomes+generate+localized+Rho-ROCK-MLC2-based+contractile+signals+via+Endo180+to+promote+adhesion+disassembly.">Endosomes generate localized Rho-ROCK-MLC2-based contractile signals via Endo180 to promote adhesion disassembly.</a> J Cell Biol. 175 (2), 337-347 (2006).</li><li>Rodriguez-Teja, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survival+Outcome+and+EMT+Suppression+Mediated+by+a+Lectin+Domain+Interaction+of+Endo180+and+CD147.">Survival Outcome and EMT Suppression Mediated by a Lectin Domain Interaction of Endo180 and CD147.</a> Mol Cancer Res. 13 (3), 538-547 (2015).</li><li>Paszek, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tensional+homeostasis+and+the+malignant+phenotype.">Tensional homeostasis and the malignant phenotype.</a> Cancer Cell. 8 (3), 241-254 (2005).</li><li>Levental, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+crosslinking+forces+tumor+progression+by+enhancing+integrin+signaling.">Matrix crosslinking forces tumor progression by enhancing integrin signaling.</a> Cell. 139 (5), 891-906 (2009).</li><li>Carson, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Material+characterization+of+ex+vivo+prostate+tissue+via+spherical+indentation+in+the+clinic.">Material characterization of ex vivo prostate tissue via spherical indentation in the clinic.</a> Med Eng Phys. 33 (3), 302-309 (2011).</li><li>Hoyt, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+elasticity+properties+as+biomarkers+for+prostate+cancer.">Tissue elasticity properties as biomarkers for prostate cancer.</a> Cancer Biomark. 4 (4-5), 213-225 (2008).</li><li>Krouskop, T. A., Wheeler, T. M., Kallel, F., Garra, B. S., Hall, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elastic+moduli+of+breast+and+prostate+tissues+under+compression.">Elastic moduli of breast and prostate tissues under compression.</a> Ultrason Imaging. 20 (4), 260-274 (1998).</li><li>Zhang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+characterization+of+viscoelastic+properties+of+human+prostate+correlated+with+histology.">Quantitative characterization of viscoelastic properties of human prostate correlated with histology.</a> Ultrasound Med Biol. 34 (7), 1033-1042 (2008).</li><li>Corona, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Benign+prostatic+hyperplasia:+a+new+metabolic+disease+of+the+aging+male+and+its+correlation+with+sexual+dysfunctions.">Benign prostatic hyperplasia: a new metabolic disease of the aging male and its correlation with sexual dysfunctions.</a> Int J Endocrinol. , (2014).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

تم تعديل بروتوكول لتوليد 3D عنيبات ​​غدي من MECs في المواد الهلامية الإدارة القائمة على النتائج نقية 6 في دراسة سابقة بإضافة 4 ملغ نوع / مل أنا الكولاجين لمصفوفة الإدارة القائمة على النتائج. أدت إضافة الكولاجين في معامل مرونة من هلام الإدارة القائمة على النتائج زيادة من 175 ± 37-1589 ± 380 الضغط بمقياس الباسكال. هذه الزيادة 9.1 أضعاف في صلابة التضمين النمو والبقاء والهجرة وتمايز MECs 21. تم تعديل بروتوكول مرة أخرى بما في ذلك خطوة العلاج مع د - (-) - الريبوز لتعزيز يشابك غير الأنزيمية من الكولاجين النوع الأول التي أضيفت إلى هلام الإدارة القائمة على النتائج. تم العثور الناتجة من زيادة 15 ضعفا في صلابة للتعاون مع التحول أنكجنيك من MECs لتعزيز السلوك الغازية 22. المنهج التجريبي إضافة النوع الأول الكولاجين إلى المواد الهلامية الإدارة القائمة على النتائج يسهل التفاعل المباشر من MECs مع ألياف الكولاجين، والذي يحدث فقط في الأنسجة البشرية بعد حاجز مادي بين سدىوظهارة التي تقدمها BM يخضع تدهور بروتين. عن طريق توليد عنيبات ​​غدي 3D من المتوقَّع (PECs) في المواد الهلامية الإدارة القائمة على النتائج نقية قبل المعاملة مع GLA، البروتوكول الحالي يفتح الطريق لدراسة كيفية BM صلابة في حد ذاتها يمكن أن تؤدي إلى السلوك الغازية (الشكل 3). مستويات BM صلابة يتسبب في هذا البروتوكول لها أهمية فسيولوجية. الحضانة مع 50 ملي تأجير لمدة 6 ساعة و 14 ساعة على التوالي زاد الرجوعية المرنة للهلام الإدارة القائمة على النتائج النقي إلى 175 ± 90 و 322 ± 160 مقارنة ب 122 ± 55 الضغط بمقياس الباسكال في الهلام الإدارة القائمة على النتائج تعامل مع برنامج تلفزيوني (الجدول 1). هذه الزيادة 1،7-3،2 أضعاف في الإدارة القائمة على النتائج صلابة يلخص 2.5- إلى 3.4 أضعاف زيادة في صلابة لوحظ في خبيث مقارنة البروستاتا الطبيعية أو الأنسجة BPH 23-26. كما هو مبين في منشور صدر مؤخرا 13 التغييرات الشكلية الناجمة عن تراكم AGE والإدارة القائمة على النتائج صلابة في PEC عنيبات ​​يمكن قياسها كميا لتحول كبير إحصائيا من عounded إلى شكل متعدد الأضلاع، وانخفاض اللمعية / المساحة الكلية عنيبية، وجاحظ الخلايا المهاجرة من acina في سن الغنية الإدارة القائمة على النتائج (الشكل 3). ويمكن أيضا Immunoblotting استخدامها لتقييم علامات EMT (مثل فقدان E-كادهيرين 13) وسلوك مقلص (على سبيل المثال فسفرته ضوء الميوسين سلسلة 2، pMLC2 13) في بيكس نمت في وضعها الطبيعي مقابل تصلب الإدارة القائمة على النتائج (الشكل 3). مزيد من التقييم باستخدام تلوين مناعي والفحص المجهري متحد البؤر يمكن تطبيقها على تصور BM (مثل laminin، الكولاجين الرابع وتراكم AGE 13)، الخلوية قمي إلى القاعدية القطبية (على سبيل المثال توطين القمي EEA1: بداية endosomal مستضد 1؛ وGM130: 130 كيلو دالتون رابطة الدول المستقلة جولجي علامة 13) والأنماط الخلوية من جزيئات الالتصاق (على سبيل المثال كادهيرين E التوطين إلى تقاطعات خلية خلية 13) (الشكل 3). <img aLT = &quot;الشكل 3&quot; SRC = &quot;/ ملفات / ftp_upload / 54230 / 54230fig3.jpg&quot; /&gt; الشكل (3): لمحة عامة عن البروتوكولات المختلفة المقدمة هنا يصور الرسم كيفية إعداد وتصلب الغشاء القاعدي المعاد (RBM) مع glycolaldehyde (تفاعل ميلارد)، وكيفية البذور الخلايا إلى الإدارة القائمة على النتائج قاسية، وكيفية تحليل الإدارة القائمة على النتائج شديدة ( مدى تفاعل ميلارد) والإجراءات التي يمكن استخدامها لتحليل التغيرات الخلوية والجزيئية الناجمة عن الإدارة القائمة على النتائج-AGE الغنية. AGE، endproducts غلكأيشن المتقدم؛ BM، الغشاء القاعدي. دابي، 4، 6 diamidino-2-phenylindole. EEA1، في وقت مبكر مستضد endosomal 1؛ GAPDH، غليسيرألدهيد-3-فوسفات نازعة. GLA، glycolaldehyde. جي، جليكاين إيثيل استر، GM130، 130 كيلو دالتون رابطة الدول المستقلة جولجي علامة. ف MLC2 (Thr18 / Ser19)، الميوسين ضوء سلسلة 2 فسفرته في مواقع ثريونين 18 و سيرين 19. الإدارة القائمة على النتائج، الغشاء القاعدي المعاد. SDS-PAGE، كبريتات الصوديوم دوديسيل هلام بولي أكريلاميد الكهربائي. للحصول على شريط RWPE1 عنيبات ​​مقياس = 10 ميكرون. لالخلايا السرطانية PC3شريط الكروية مقياس = 100 ميكرون. تم تعديل هذا الرقم من إشارة 13. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54230/54230fig3large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> سوف خطوات حل المشاكل يكون ضروريا إذا D - يتم اختيار الريبوز وكيلا يشابك الإدارة القائمة على النتائج - (-). خلال تطوير بروتوكول وجد أن المعاملة مع 1 M D - (-) - الريبوز لمدة 72 ساعة، كما هو موضح سابقا عن المواد الهلامية الإدارة القائمة على النتائج / الكولاجين 22، أسفر عن الجفاف وانكماش المواد الهلامية الإدارة القائمة على النتائج. تقييم تركيزات أقل من D - (-) - الريبوز والأوقات العلاج أقصر قد تساعد في التغلب على هذا القيد. يمكن أن تصادف وجود قيود محتملة في التطبيقات المستقبلية للبروتوكول حيث المطلوب مستويات أعلى من الإدارة القائمة على النتائج صلابة. إذا تم استخدامها مرات حضانة أطول وتركيزات أعلى من GLA للحث على مستويات أعلى من الإدارة القائمة على النتائج هلام صلابة سيكون من الضروري ل<html> تقييم ما إذا كانت هذه الشروط معاملة لها تأثير على بقاء الخلية والانتشار، كما هو موضح سابقا (13). كما تجدر الإشارة إلى أن حضانة RWPE-1 الخلايا مع المصل يؤدي الى مثل EMT التحول المظهري والتعرض لمصل أو المواد المحتوية على مصل ينبغي تجنبها. على سبيل المثال، إذا تنطوي على تجارب ترنسفكأيشن بالتدخل قصيرة الحمض النووي الريبي (سيرنا) [أليغنوكليوتيد، ينبغي أن يكون الأمثل الإجراء باستخدام خلايا RWPE-1 نمت في KSFM، دون تبديل الخلايا إلى انخفاض وسائل الإعلام ترنسفكأيشن المصل. هذا العيب يمكن أن يقلل من مستوى الجينات إسكات يتحقق عند استخدام سيرنا عابرة النهج في النموذج. لبعض الأهداف البروتين فإنه ينصح لتوظيف ناقلات shRNA محرض لإسكات الجينات الانضباطي وانخفاض المطلوب في مستويات البروتين. ويمكن أيضا أن تدمج التعديلات التي تتضمن يشابك الأنزيمي خلية اللحمية أو الخلايا السرطانية الليزيل المرتبطة أوكسيديز (لوكس) 17 في نماذج المستقبل. jove_content &quot;&gt; وهذا البروتوكول تسهيل الدراسة المستقبلية للآليات الموالية الغازية الناجمة عن تعتمد على العمر BM صلابة في بيكس (RWPE-1، BPH-1) وتقييم أهداف مكافحة المنتشر في PTCs الغازية (PC3). وبالنظر إلى أن BPH يعتبر اضطراب التمثيل الغذائي 27، هذا البروتوكول يمهد الطريق أيضا نحو لدينا فهم أفضل للعلاقة بين الاضطرابات الأيضية وزيادة خطر الاصابة بسرطان البروستاتا. وبالنظر إلى أن BM صلابة الناجم عن التعرض لأجس قد تكون نقطة انطلاق لغزو في السرطان الأخرى أنواع، وسوف تكون ذات فائدة لاستخدام بروتوكول لانشاء نماذج مماثلة التي تتضمن الخلايا الظهارية الطبيعية والخلايا السرطانية من الأجهزة الأخرى (مثل الثدي والقولون والمبيض والبنكرياس). وتتلخص الخطوات الحاسمة في البروتوكول، جنبا إلى جنب مع توقيتها، في الشكل (4). وخلال الخطوة الأولى من الضروري للحفاظ على حل سهم الإدارة القائمة على النتائج في 4 درجات مئوية في حين أنه يذوب لمنع بول لymerization. لا ينبغي أن توضع نصائح ماصة في حل الأسهم RM حتى وتأثرت إلى 4 درجات مئوية. للخطوة التالية من المهم أيضا لضمان والمتوازنة الشرائح غرفة إلى 4 درجة مئوية قبل والمغلفة هم مع الحل الإدارة القائمة على النتائج. حالما يتم زيادة درجة حرارة المحلول الإدارة القائمة على النتائج فوق 4 درجات مئوية فإنه سيخضع البلمرة لا رجعة فيها لتشكيل مادة هلامية. من الضروري أن الإدارة القائمة على النتائج غير منزعجة خلال المرحلة البلمرة لضمان أن تشكل حتى السطح مناسبة لزراعة الخلايا والتحليل المجهري. ومدة الحضانة مع GLA مع أو بدون مثبطات للتفاعل ميلارد (سيان بورهيدريد الصوديوم وamingoguanidine) تحديد كيفية قاسية يصبح جل الإدارة القائمة على النتائج. فمن المستحسن استخدام حضانة 6 ساعات مع GLA إذا كانت هناك حاجة ظروف شبه صلبة، والحضانة 14 ساعة إذا كانت هناك حاجة ظروف قاسية (الجدول 1). حضانة مرات بديلة أو تركيزات GLA يمكن أن تستخدم إذا كانت مستويات مختلفةمن صلابة والمطلوب. في هذا التحليل حالة الانسيابية من المواد الهلامية الإدارة القائمة على النتائج بحاجة إلى أن تدرج كخطوة أساسية. بعد خطوة من التبريد للتفاعل ميلارد من الحضانة مع جي والخطوات اللاحقة الغسيل مع برنامج تلفزيوني، والمواد الهلامية الإدارة القائمة على النتائج يمكن استخدامها على الفور أو تخزين عند 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 48 ساعة قبل استخدامها للثقافة الخلية. مرة واحدة يتم تعيين مزارع الخلايا تصل من المهم تغيير ثقافة المتوسط ​​(بما في ذلك أي علاج) كل يومين. فمن المستحسن للحفاظ على مزارع الخلايا 3D ل3-12 أيام وفقا لمعايير قيد التحقيق. ل3D عنيبات ​​PEC فمن المستحسن لتحليل الثقافات بعد 6 أيام، ول3D المؤسسة العامة للاتصالات الكروية تحليل ينصح بعد 3 أيام من الثقافة في المقام الأول. <img alt="الشكل (4)" src="/files/ftp_upload/54230/54230fig4.jpg" /> الشكل (4): نظرة عامة بسيطة من بروتوكول مع خطوات الهامة والتوقيت وأشارت فلوالرسم البياني ث يصور كيفية إعداد وتشديد الطابق السفلي غشاء المعاد (RBM) مع glycolaldehyde (مايار رد فعل) مع الخطوات الحاسمة ومواعيد المشار إليها. نقاط حيث البروتوكول يمكن وقفها، والمواد الهلامية الإدارة القائمة على النتائج تخزين، وأشار أيضا. الإدارة القائمة على النتائج، الغشاء القاعدي المعاد. GLA، glycolaldehyde. جي، جليكاين إيثيل استر، ON، بين عشية وضحاها. برنامج تلفزيوني، مخزنة فوسفات المالحة. RT، درجة حرارة الغرفة. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54230/54230fig4large.jpg" target="_blank">الرجاء النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>

The basement membrane (BM) is a sheet of specialized extracellular matrix (ECM) that maintains stable tissue borders by separating layers of epithelial cells from the stroma1. Covalent crosslinking between adjacent triple helices of collagen IV in the BM stabilizes their lateral association by establishing an irregular network of super-twisted helices2. These collagen IV lattices act as a scaffold for its interaction with laminin and other BM components1. The structural arrangement of the BM provides it with the mechanical strength and rigidity necessary for the normal development of glandular epithelia3. 
During aging and disease the BM progressively thickens and stiffens3,4. For example, a 3-fold increase in the elastic modulus (E) of the ocular BM occurs between the ages of 50 and 80 in the normal population, and this stiffening is further exacerbated in metabolic disorders like diabetes5. The structural and biomechanical changes in the BM that result in its increased stiffness occur when its ECM components, collagen IV and laminin, become non-enzymatically crosslinked following their exposure to advanced glycation endproducts (AGEs).
The purpose of the method described here was to establish a model for the investigation of how BM stiffness, due to AGE exposure, promotes prostate epithelial cell (PEC) and prostate tumour cell (PTC) invasiveness in the context of the switch to metastatic prostate cancer (PCa). To do this a previous method used for generating 3D glandular acini from mammary epithelial cells (MECs) in reconstituted rBM gels6 was adapted to include an additional step where the rBM gels are pre-treated with glycolaldehyde (GLA). Several techniques for assessing GLA induced crosslinking and stiffening of pre-treated rBM gels are described, including photometric analysis, sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS PAGE), confocal microscopy and rheometric analysis. The prostate cell types selected for culture on the pre-stiffened rBM include: RWPE-1, PECs derived from a normal prostate gland7; BPH-1, PECs derived from a prostate gland affected by BPH8; and PC3, metastatic PTCs derived from a secondary tumor located in the vertebral bone of a prostate cancer (PCa) patient9. 
In addition to advancing the study of prostate gland pathology, the protocol for stiffening of rBM gels by their treatment with GLA can be adapted to investigate how BM stiffness contributes to other age-related pathologies and metabolic disorders. For example, the model can be directly applied to investigate how metastatic cancer is induced by BM stiffness in organs such as the breast, colon, ovary and pancreas by the incorporation of appropriate cell types. Furthermore, the protocol can be adapted to investigate how stiff BM promotes biomechanical mechanisms of disease progression in diabetes-related microvascular disease, retinopathy, nephropathy and neuropathy.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:628px;">I - Material for monolayer culture</td>
			<td style="width:265px;"></td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td style="width:401px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BPH-1</td>
			<td>CaP Cell Line Database</td>
			<td>PCaCL-132</td>
			<td>Contact: simon.hayward@mcmail.vanderbilt.edu</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Complete keratinocyte serum-free media&#160;</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>17005-075</td>
			<td>Do not warm at 37 &#186;C before use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal calf serum&#160;</td>
			<td>First Link UK Ltd</td>
			<td>02-00-850</td>
			<td>Store at -20 &#186;C in aliquots</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PC3&#160;</td>
			<td>American Type Culture Collection</td>
			<td>CRL-1435</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin/streptomycin</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15070-063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phosphate Buffer Saline (Dulbecco A) tablets</td>
			<td>Oxoid</td>
			<td>BR0014G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RPMI 1640 medium&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R5886</td>
			<td>warm in 37 &#186;C water bath before use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RWPE-1&#160;</td>
			<td>American Type Culture Collection</td>
			<td>CRL-11609</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypsin-EDTA solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T4049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">II - Material for 3D culture</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Acetonitrile</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>271004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Aminoguanidine hydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>396494</td>
			<td>Irritating to eyes, respiratory system and skin</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Chamber slides, 8-well&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific Nunc Lab-Tek</td>
			<td>TKT-210-816M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Culture Matrix reconstituted basement membrane (rBM) reduced growth factor extract&#160;</td>
			<td>AMS Biotechnology</td>
			<td>3445-005-01</td>
			<td>Store Basement membrane (BM) at -80 &#186;C in aliquots</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cyanogen bromide&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C91492</td>
			<td>Toxic by contact skin and inhalation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Formic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>695076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glycine ethyl ester hydrochloride (GEE)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>50060</td>
			<td>Irritating to eyes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glycolaldehyde dimer (GLA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G6805</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium cyanoborohydride&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71435</td>
			<td>Highly flammable; Toxic by contact skin and inhalation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Syringe filter 0.22 microns</td>
			<td>Appleton Woods</td>
			<td>BC680</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">III - Material to quantify Maillard reaction</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">4&#8217;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)</td>
			<td>ThemoFisher Scientific</td>
			<td>D3571</td>
			<td>light sensitive and store at -20 &#186;C in aliquots</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cloning cylinders</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Goat anti-mouse IgG (H+L) Alexa Fluor 488 conjugate</td>
			<td>ThemoFisher Scientific</td>
			<td>A-11001</td>
			<td>light sensitive</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Goat anti-rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 488 conjugate</td>
			<td>ThemoFisher Scientific</td>
			<td>A-11034</td>
			<td>light sensitive</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Goat serum</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab7481</td>
			<td>Store at -20 &#186;C in aliquots</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vectashield mounting media&#160;</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mouse anti-pentosidine clone PEN-12 mAb</td>
			<td>TransGenic Inc</td>
			<td>KH012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F8775</td>
			<td>Store at -20 &#186;C in aliquots</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rabbit anti-human collagen IV polyclonal antibody&#160;&#160;</td>
			<td>Acris Antibodies</td>
			<td>R1041</td>
			<td>Store at -20 &#186;C in aliquots</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rabbit anti-laminin A/C pAb</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology Inc</td>
			<td>sc-7292</td>
			<td>Store at -20 &#186;C in aliquots</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether (Triton-X100)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Polyethylene glycol sorbitan monolaurate (Tween-20)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dialysis cassette Slide-A-Lyzer</td>
			<td>ThemoFisher Scientific</td>
			<td>66333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">IV - Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ARG2 controlled strain rotational rheometer</td>
			<td>T.A. Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Axiovert S100 (20x magnification) microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CO2 controlled humidified incubation chamber for Zeiss Axio S100 microscope</td>
			<td>Solent Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Confocal Axiovert 200M (40x, 63x magnification) microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Olympus LH50A microscope fitted with a digital camera using phase-contrast&#160;</td>
			<td>Olympus&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PHERAstar Plus plate reader spectrophotometer</td>
			<td>BMG Labtech</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">V - Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Image J 1.47v</td>
			<td>National Institute of Health, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MetaXpress</td>
			<td>Molecular Divices</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

how to study basement membrane stiffness as a biophysical trigger in prostate cancer and other age-related pathologies or metabolic diseases

نحن هنا وصف بروتوكول التي يمكن استخدامها لدراسة المكروية الفيزيائية الحيوية ذات الصلة إلى زيادة سماكة وتصلب الغشاء القاعدي (BM) خلال الأمراض المرتبطة بالعمر واضطرابات التمثيل الغذائي (مثل السرطان والسكري وأمراض الاوعية الدموية الدقيقة، واعتلال الشبكية، اعتلال الكلية والاعتلال العصبي) . فرضية من هذا النموذج هو يشابك غير الأنزيمية من BM (RBM) المصفوفة التي أعيد تنظيمها العلاج مع glycolaldehyde (GLA) لتعزيز المتقدمة غلكأيشن endproduct (AGE) جيل عن طريق تفاعل ميلارد. تعامل أمثلة من التقنيات المخبرية التي يمكن استخدامها لتأكيد جيل AGE، يشابك غير الأنزيمية وزيادة صلابة في GLA ترد الإدارة القائمة على النتائج. وتشمل هذه إعداد الإدارة القائمة على النتائج الأم (تعامل مع الفوسفات مخزنة المالحة، PBS) وتصلب الإدارة القائمة على النتائج (تعامل مع GLA) لتحديد ما يلي: محتوى AGE من خلال تحليل الضوئية والفحص المجهري مناعي، يشابك غير الأنزيمية من قبل الصوديوم دوديسيل كبريتات بولي أكريلاميدالكهربائي للهلام (SDS PAGE)، وكذلك الفحص المجهري متحد البؤر، وفي زيادة صلابة باستخدام rheometry. الإجراء الموضح هنا يمكن أن تستخدم لزيادة صلابة (الرجوعية المرنة، E) الإدارة القائمة على النتائج تصل إلى 3.2 أضعاف، بما يتفق مع القياسات التي أجريت في الاصحاء المريضة أنسجة البروستاتا البشرية. لإعادة المكروية الفيزيائية الحيوية المرتبطة بالشيخوخة والبروستات غدة المريضة أدخلت ثلاثة أنواع خلايا البروستاتا إلى الإدارة القائمة على النتائج المحلية وتصلب الإدارة القائمة على النتائج: RWPE-1، الخلايا الظهارية البروستاتا (المتوقَّع (PECs)) المشتقة من غدة البروستاتا الطبيعية. BPH-1، المتوقَّع (PECs) المستمدة من غدة البروستاتا تتأثر تضخم البروستاتا الحميد (BPH). وPC3، الخلايا المتنقل المستمدة من سرطان العظم الثانوي القادمة من سرطان البروستاتا. ويمكن قياس معلمات متعددة، بما في ذلك حجم وشكل وخصائص الغازية من عنيبات ​​غدي 3D التي شكلتها RWPE-1 و BPH-1 على مواطن مقابل تصلب الإدارة القائمة على النتائج، ومتوسط ​​طول الخلية، وسرعة المهاجرة واستمرار حركة الخلية من spher 3Dالكويكبات التي شكلتها خلايا PC3 تحت نفس الظروف. خلية مسارات الإشارات وتوطين التحت خلوية من البروتينات يمكن أيضا تقييم.

3D البروستاتا عنيبات ​​مثقف على الجثة الإدارة القائمة على النتائج بعد 6 أيام في الثقافة، المتوقَّع (PECs) مشتقة من نسيج البروستاتا الطبيعية (RWPE-1) (الشكل 1A) والأنسجة BPH (BPH-1) (الشكل 1B) شكل عنيبات ​​على مواطن (PBS المعالجة) الإدارة القائمة على النتائج التي يتم تنظيمها في الكروية زي الظهارية الخلايا. يكون لهذه عنيبات ​​أيضا خصائص بيكس درجة عالية من التنظيم مع قمي لالقاعدية القطبية واللمعية مرئية الفضاء 13،20. وعنيبات ​​التي شكلتها المتوقَّع (PECs) مشتقة من نسيج البروستاتا الطبيعية (RWPE-1) (الشكل 1A) والأنسجة BPH (BPH-1) (الشكل 1B) على تشديد الإدارة القائمة على النتائج (-AGE الغني) (تعامل مع GLA) لديها بنية تعطلت (تحويل من كروي إلى متعدد الأضلاع في الشكل وخلايا جاحظ / المهاجرة من عنيبات ​​في سن الغنية RBM) (الشكل 1A). هذه<html> تتميز عنيبات ​​أيضا المتوقَّع (PECs) غير منظمة للغاية التي فقدت الأقطاب-قمي لالقاعدية مع مساحة اللمعية صغيرة أو معدومة 13. <img alt="شكل 1" src="/files/ftp_upload/54230/54230fig1.jpg" /> الشكل 1: البروستات طلائي الخلايا كما نمت 3D غدية عنيبات ​​على الأصلية والجثة بدروم إعادة تشكيل غشاء (RBM) (A) صور Brightfield من RWPE-1 الخلايا نمت لمدة 12 ساعة تصل إلى 6 أيام على المواد الهلامية الإدارة القائمة على النتائج تعامل مع برنامج تلفزيوني (اللغة الأم) أو 50 ملي glycolaldehyde لمدة 14 ساعة (-AGE غنية، شديدة)؛ شريط النطاق = 50 ميكرون. (ب) BPH-1 الخلايا، ونمت كما هو موضح في لوحة A؛ الحانات النطاق = 50 ميكرون. البيانات ممثل من 3 تجارب مستقلة. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54230/54230fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <html> الجدول 1 &quot;SRC =&quot; / ملفات / ftp_upload / 54230 / 54230table1.jpg &quot;/&gt; وقد نمت خصائص البروستات طلائي RWPE-1 عنيبات ​​نمت على السكان الأصليين، وشبه الجثة والجثة بدروم إعادة تشكيل غشاء (RBM) RWPE-1 عنيبات ​​على الإدارة القائمة على النتائج قبل تعامل مع برنامج تلفزيوني لمدة 14 ساعة (اللغة الأم)، glycolaldehyde (GLA: الجدول 1. ) لمدة 6 ساعة (شبه قاسية) أو تأجير لمدة 14 ساعة (قاسية). لشكل عنيبية، فإن النسبة المئوية (٪) ± الانحراف المعياري (SD) جولة، وحسبت عنيبات ​​شبه مضلع والمضلع من 5 تجارب مستقلة (50 عنيبات ​​كميا في حالة). تم احتساب نسبة حجم عنيبية (الأم الإدارة القائمة على النتائج = 100٪) من 3 تجارب مستقلة. للغزو، وحسبت٪ ± عنيبات ​​SD مع واحد أو أكثر من الخلايا جاحظ من 3 تجارب مستقلة. ويتم احتساب تغيير أضعاف بقسمة متوسط ​​القيمة التي تم الحصول عليها تحت ظروف شبه شديدة أو شديدة من القيمة المطابقة للشروط المحلية. قيم P تحسب باستخدام اختبار (ت) الطالب (α = 0.05). ontent &quot;FO: المحافظة على together.within الصفحات =&quot; 1 &quot;&gt; AGE تعتمد زيادة الإدارة القائمة على النتائج صلابة تعزز PC3 البروستاتا هجرة الخلايا السرطانية خلايا PC3 نمت على الإدارة القائمة على النتائج الأم تهاجر من خلال الحفاظ على استمرار الاتصال خلية خلية، في حين أن خلايا PC3 نمت على AGE الغني (قاسية) الإدارة القائمة على النتائج التحرك بشكل مستقل عن بعضها البعض (الشكل 2A). بعد 72 ساعة في خلايا PC3 الثقافة تشكل بؤر (الكروية) على مواطن (PBS المعالجة) الإدارة القائمة على النتائج، في حين أن خلايا PC3 على تصلب (-AGE الغنية) الإدارة القائمة على النتائج لا من الكروية والهجرة بشكل مستقل (الشكل 2B). خلايا PC3 على تصلب الإدارة القائمة على النتائج (-AGE الغنية) هي أكثر ممدود من خلايا PC3 نمت على الأم الإدارة القائمة على النتائج (الشكل 2C). خلايا PC3 على تصلب الإدارة القائمة على النتائج تهاجر أسرع من خلايا PC3 نمت على الإدارة القائمة على النتائج الأم (الشكل 2D). خلايا PC3 على تصلب الإدارة القائمة على النتائج عرض انخفاضا في استمرار بالمقارنة مع خلايا PC3 نمت على الأم الإدارة القائمة على النتائج (الشكل 2E). <img aLT = &quot;الشكل 2&quot; SRC = &quot;/ ملفات / ftp_upload / 54230 / 54230fig2.jpg&quot; /&gt; الشكل 2: البروستات الهجرة ورم خلية على الأصلية والجثة بدروم إعادة تشكيل غشاء (RBM) (A) صور Brightfield من خلايا PC3 نمت على المواد الهلامية الإدارة القائمة على النتائج تعامل مع برنامج تلفزيوني (الأم) أو glycolaldehyde 50 ملي لمدة 14 ساعة (-AGE الأغنياء، وقاسية) . تم تصوير الخلايا باستخدام المجهر brightfield (الهدف 10X)، ومعدل حيازة 1 صورة في ساعة لمدة 12 ساعة تليها خلية تتبع لتوليد مسارات. الصور المعروضة تتوافق مع نقاط الوقت بعد 0، 3، 6، 9 و 12 ساعة. وتظهر مسارات الخلايا وحيدة لنقطة زمنية 12 ساعة. شريط مقياس = 100 ميكرون. خلايا (ب) PC3 مثقف على الإدارة القائمة على النتائج الأم أو شديدة لمدة 72 ساعة، وتصويرها كما هو موضح في لوحة (A). شريط مقياس = 100 ميكرون. ويوضح التفاصيل منطقة مختارة في 2X التكبير. (C) يعني ± SD طول الخلية (ميكرون)؛ فرق كبير بين الإدارة القائمة على النتائج المحلية وقاسية الإدارة القائمة على النتائج (ع = 1.2 × 10 -23). ( <strأونج&gt; D) يعني ± SD سرعة (ميكرون / ساعة) تحسب من مسارات الخلية؛ فرق كبير بين الإدارة القائمة على النتائج المحلية وتصلب الإدارة القائمة على النتائج (ع = 0.004). (E) يعني ± SD استمرار حركة الخلية (نسبة D / T، حيث D = المسافة من البداية الى النهاية لمسار الخلية، T = الطول الكلي للمسار الخلية). فرق كبير بين الإدارة القائمة على النتائج المحلية وتصلب الإدارة القائمة على النتائج (ع = 0.0007). لوحات وقد تم تحليل CE&gt; 10 الخلايا، البيانات هو ممثل من 3 تجارب مستقلة. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54230/54230fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>

Watch this Scientific Journal Video about How to Study Basement Membrane Stiffness as a Biophysical Trigger in Prostate Cancer and Other Age-related Pathologies or Metabolic Diseases at JoVE.com

How to Study Basement Membrane Stiffness as a Biophysical Trigger in Prostate Cancer and Other Age-related Pathologies or Metabolic Diseases

نحن هنا شرح بروتوكول لنمذجة المكروية الفيزيائية الحيوية حيث يشابك وزيادة تصلب الغشاء القاعدي (BM) الناجم عن endproducts غلكأيشن المتقدم (أجس) له أهمية المرضية.

كيفية دراسة بدروم غشاء تصلب بمثابة الزناد البيوفيزيائية في سرطان البروستاتا وعلوم الأمراض الأخرى ذات الصلة العمر أو الأمراض الاستقلابية

Here we describe a protocol that can be used to study the biophysical microenvironment related to increased thickness and stiffness of the basement ...

how-to-study-basement-membrane-stiffness-as-biophysical-trigger

Research

JoVE Journal

Cancer Research

9.6K Views.  Universidad de la República (UDELAR).  نحن هنا شرح بروتوكول لنمذجة المكروية الفيزيائية الحيوية حيث يشابك وزيادة تصلب الغشاء القاعدي (BM) الناجم عن endproducts غلكأيشن المتقدم (أجس) له أهمية المرضية. 

Video: How to Study Basement Membrane Stiffness as a Biophysical Trigger in Prostate Cancer and Other Age-related Pathologies or Metabolic Diseases

Coculture Assays to Study Macrophage and Microglia Stimulation of Glioblastoma Invasion

Glioblastoma multiforme (grade IV glioma) is a very aggressive human cancer with a median survival of 1 year post diagnosis. Despite the increased understanding of the molecular events that give rise to glioblastomas, this cancer still remains highly refractory to conventional treatment. Surgical resection of high grade brain tumors is rarely complete due to the highly infiltrative nature of glioblastoma cells. Therapeutic approaches which attenuate glioblastoma cell invasion therefore is an attractive option. Our laboratory and others have shown that tumor associated macrophages and microglia (resident brain macrophages) strongly stimulate glioblastoma invasion. The protocol described in this paper is used to model glioblastoma-macrophage/microglia interaction using in vitro culture assays. This approach can greatly facilitate the development and/or discovery of drugs that disrupt the communication with the macrophages that enables this malignant behavior. We have established two robust coculture invasion assays where microglia/macrophages stimulate glioma cell invasion by 5 - 10 fold. Glioblastoma cells labelled with a fluorescent marker or constitutively expressing a fluorescent protein are plated without and with macrophages/microglia on matrix-coated polycarbonate chamber inserts or embedded in a three dimensional matrix. Cell invasion is assessed by using fluorescent microscopy to image and count only invasive cells on the underside of the filter. Using these assays, several pharmacological inhibitors (JNJ-28312141, PLX3397, Gefitinib, and Semapimod), have been identified which block macrophage/microglia stimulated glioblastoma invasion.

Understanding the malignant behavior of cancer requires creating accurate models of how tumor cells interact with components of the tumor microenvironment, such as macrophages. Here we describe two methods to study glioblastoma cell interaction with tumor associated macrophages and microglia where the effect on glioblastoma invasion is assessed.

Coculture فحوصات لدراسة البلاعم والخلايا الدبقية الصغيرة تحفيز من ورم أرومي دبقي الغزو

Glioblastoma multiforme (grade IV glioma) is a very aggressive human cancer with a median survival of 1 year post diagnosis. Despite the increased ...

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

Drosophila melanogaster has emerged as a powerful experimental system for functional and mechanistic studies of tumor development and progression in the context of a whole organism. Sophisticated techniques to generate genetic mosaics facilitate induction of visually marked, genetically defined clones surrounded by normal tissue. The clones can be analyzed through diverse molecular, cellular and omics approaches. This study describes how to generate fluorescently labeled clonal tumors of varying malignancy in the eye/antennal imaginal discs (EAD) of Drosophila larvae using the Mosaic Analysis with a Repressible Cell Marker (MARCM) technique. It describes procedures how to recover the mosaic EAD and brain from the larvae and how to process them for simultaneous imaging of fluorescent transgenic reporters and antibody staining. To facilitate molecular characterization of the mosaic tissue, we describe a protocol for isolation of total RNA from the EAD. The dissection procedure is suitable to recover EAD and brains from any larval stage. The fixation and staining protocol for imaginal discs works with a number of transgenic reporters and antibodies that recognize Drosophila proteins. The protocol for RNA isolation can be applied to various larval organs, whole larvae, and adult flies. Total RNA can be used for profiling of gene expression changes using candidate or genome-wide approaches. Finally, we detail a method for quantifying invasiveness of the clonal tumors. Although this method has limited use, its underlying concept is broadly applicable to other quantitative studies where cognitive bias must be avoided.

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

This protocol demonstrates how to generate fluorescently marked, genetically defined clonal tumors in the Drosophila eye/antennal imaginal discs (EAD). It describes how to dissect the EAD and brain from the third instar larvae and how to process them to visualize and quantify gene expression changes and tumor invasiveness.

ال<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; تخيلي ورم القرص نموذج: التصور والكمي للالتعبير الجيني وغزو الورم عن طريق الفسيفساء الوراثية

Drosophila melanogaster has emerged as a powerful experimental system for functional and mechanistic studies of tumor development and progression in the ...

Hyperpolarized 13C Metabolic Magnetic Resonance Spectroscopy and Imaging

In the past decades, new methods for tumor staging, restaging, treatment response monitoring, and recurrence detection of a variety of cancers have emerged in conjunction with the state-of-the-art positron emission tomography with 18F-fluorodeoxyglucose ([18F]-FDG PET). 13C magnetic resonance spectroscopic imaging (13CMRSI) is a minimally invasive imaging method that enables the monitoring of metabolism in vivo and in real time. As with any other method based on 13C nuclear magnetic resonance (NMR), it faces the challenge of low thermal polarization and a subsequent low signal-to-noise ratio due to the relatively low gyromagnetic ratio of 13C and its low natural abundance in biological samples. By overcoming these limitations, dynamic nuclear polarization (DNP) with subsequent sample dissolution has recently enabled commonly used NMR and magnetic resonance imaging (MRI) systems to measure, study, and image key metabolic pathways in various biological systems. A particularly interesting and promising molecule used in 13CMRSI is [1-13C]pyruvate, which, in the last ten years, has been widely used for in vitro, preclinical, and, more recently, clinical studies to investigate the cellular energy metabolism in cancer and other diseases. In this article, we outline the technique of dissolution DNP using a 3.35 T preclinical DNP hyperpolarizer and demonstrate its usage in in vitro studies. A similar protocol for hyperpolarization may be applied for the most part in in vivo studies as well. To do so, we used lactate dehydrogenase (LDH) and catalyzed the metabolic reaction of [1-13C]pyruvate to [1-13C]lactate in a prostate carcinoma cell line, PC3, in vitro using 13CMRSI.

Hyperpolarized 13C Metabolic Magnetic Resonance Spectroscopy and Imaging

Dynamic nuclear polarization with subsequent sample dissolution has enabled real-time studies of metabolism in biological systems. Hyperpolarized [1-13C]pyruvate was used to study lactate dehydrogenase activity in a prostate carcinoma cell line in vitro.

In the past decades, new methods for tumor staging, restaging, treatment response monitoring, and recurrence detection of a variety of cancers have ...

The Colon-26 Carcinoma Tumor-bearing Mouse as a Model for the Study of Cancer Cachexia

Cancer cachexia is the progressive loss of skeletal muscle mass and adipose tissue, negative nitrogen balance, anorexia, fatigue, inflammation, and activation of lipolysis and proteolysis systems. Cancer patients with cachexia benefit less from anti-neoplastic therapies and show increased mortality1. Several animal models have been established in order to investigate the molecular causes responsible for body and muscle wasting as a result of tumor growth. Here, we describe methodologies pertaining to a well-characterized model of cancer cachexia: mice bearing the C26 carcinoma2-4. Although this model is heavily used in cachexia research, different approaches make reproducibility a potential issue. The growth of the C26 tumor causes a marked and progressive loss of body and skeletal muscle mass, accompanied by reduced muscle cross-sectional area and muscle strength3-5. Adipose tissue is also lost. Wasting is coincident with elevated circulating levels of pro-inflammatory cytokines, particularly Interleukin-6 (IL-6)3, which is directly, although not entirely, responsible for C26 cachexia. It is well-accepted that a primary mechanism by which the C26 tumor induces muscle tissue depletion is the activation of skeletal muscle proteolytic systems. Thus, expression of muscle-specific ubiquitin ligases, such as atrogin-1/MAFbx and MuRF-1, represent an accepted method for the evaluation of the ongoing muscle catabolism2. Here, we present how to execute this model in a reproducible manner and how to excise several tissues and organs (the liver, spleen, and heart), as well as fat and skeletal muscles (the gastrocnemius, tibialis anterior, and quadriceps). We also provide useful protocols that describe how to perform muscle freezing, sectioning, and fiber size quantification.

Mice bearing the Colon-26 (C26) carcinoma represent a classical model of cancer cachexia. Progressive muscle wasting occurs in association with tumor growth, over-expression of muscle-specific ubiquitin ligases, and reductions in muscle cross-sectional area. Fat loss is also observed. Cachexia is studied in a time-dependent manner with increasing severity of wasting.

كولون-26 سرطان الفأر نموذجا لدراسة سرطان دنف الحاملة للورم

Cancer cachexia is the progressive loss of skeletal muscle mass and adipose tissue, negative nitrogen balance, anorexia, fatigue, inflammation, and ...

Detection of Mitochondria Membrane Potential to Study CLIC4 Knockdown-induced HN4 Cell Apoptosis In Vitro

Depletion of the mitochondrial membrane potential (MMP, &#916;&#936;m) is considered the earliest event in the apoptotic cascade. It even occurs ahead of nuclear apoptotic characteristics, including chromatin condensation and DNA breakage. Once the MMP collapses, cell apoptosis will initiate irreversibly. A series of lipophilic cationic dyes can pass through the cell membrane and aggregate inside the matrix of mitochondrion, and serve as fluorescence marker to evaluate MMP change. As one of the six members of the Cl- intracellular channel (CLIC) family, CLIC4 participates in the cell apoptotic process mainly through the mitochondrial pathway. Here we describe a detailed protocol to measure MMP via monitoring the fluorescence fluctuation of Rhodamine 123 (Rh123), through which we study apoptosis induced by CLIC4 knockdown. We discuss the advantages and limitations of the application of confocal laser scanning and normal fluorescence microscope in detail, and also compare it with other methods.

Detection of Mitochondria Membrane Potential to Study CLIC4 Knockdown-induced HN4 Cell Apoptosis In Vitro

Here we present a detailed protocol for the application of rhodamine 123 to identify the mitochondrial membrane potential (MMP) and study CLIC4 knockdown-induced HN4 cell apoptosis in vitro. Under common fluorescence microscope and confocal laser scanning fluorescence microscope, the real-time change of the MMP was recorded.

الكشف عن إمكانات غشاء الميتوكوندريا لدراسة CLIC4 HN4 المستحثة بضربه قاضية الخلية المبرمج في المختبر

Depletion of the mitochondrial membrane potential (MMP, &#916;&#936;m) is considered the earliest event in the apoptotic cascade. It even occurs ahead of ...

Phosphopeptide Enrichment Coupled with Label-free Quantitative Mass Spectrometry to Investigate the Phosphoproteome in Prostate Cancer

Phosphoproteomics involves the large-scale study of phosphorylated proteins. Protein phosphorylation is a critical step in many signal transduction pathways and is tightly regulated by kinases and phosphatases. Therefore, characterizing the phosphoproteome may provide insights into identifying novel targets and biomarkers for oncologic therapy. Mass spectrometry provides a way to globally detect and quantify thousands of unique phosphorylation events. However, phosphopeptides are much less abundant than non-phosphopeptides, making biochemical analysis more challenging. To overcome this limitation, methods to enrich phosphopeptides prior to the mass spectrometry analysis are required. We describe a procedure to extract and digest proteins from tissue to yield peptides, followed by an enrichment for phosphotyrosine (pY) and phosphoserine/threonine (pST) peptides using an antibody-based and/or titanium dioxide (TiO2)-based enrichment method. After the sample preparation and mass spectrometry, we subsequently identify and quantify phosphopeptides using liquid chromatography-mass spectrometry and analysis software.

This protocol describes a procedure to extract and enrich phosphopeptides from prostate cancer cell lines or tissues for an analysis of the phosphoproteome via mass spectrometry-based proteomics.

تخصيب فوسفوبيبتيدي مقترنة بكمية خالية من تسمية الطيف الكتلي للتحقيق في فوسفوبروتيومي في سرطان البروستاتا

Phosphoproteomics involves the large-scale study of phosphorylated proteins. Protein phosphorylation is a critical step in many signal transduction ...

Yeast As a Chassis for Developing Functional Assays to Study Human P53

The finding that the well-known mammalian P53 protein can act as a transcription factor (TF) in the yeast S. cerevisiae has allowed for the development of different functional assays to study the impacts of 1) binding site [i.e., response element (RE)] sequence variants on P53 transactivation specificity or 2) TP53 mutations, co-expressed cofactors, or small molecules on P53 transactivation activity. Different basic and translational research applications have been developed. Experimentally, these approaches exploit two major advantages of the yeast model. On one hand, the ease of genome editing enables quick construction of qualitative or quantitative reporter systems by exploiting isogenic strains that differ only at the level of a specific P53-RE to investigate sequence-specificity of P53-dependent transactivation. On the other hand, the availability of regulated systems for ectopic P53 expression allows the evaluation of transactivation in a wide range of protein expression. Reviewed in this report are extensively used systems that are based on color reporter genes, luciferase, and the growth of yeast to illustrate their main methodological steps and to critically assess their predictive power. Moreover, the extreme versatility of these approaches can be easily exploited to study different TFs including P63 and P73, which are other members of TP53 gene family.

Presented here are four protocols to construct and exploit yeast Saccharomyces cerevisiae reporter strains to study human P53 transactivation potential, impacts of its various cancer-associated mutations, co-expressed interacting proteins, and the effects of specific small molecules.

الخميرة كهيكل لتطوير الاختبارات الوظيفية لدراسة P53 الإنسان

The finding that the well-known mammalian P53 protein can act as a transcription factor (TF) in the yeast S. cerevisiae has allowed for the development of ...

Important Endpoints and Proliferative Markers to Assess Small Intestinal Injury and Adaptation using a Mouse Model of Chemotherapy-Induced Mucositis

Intestinal adaptation is the natural compensatory mechanism that occurs when the bowel is lost due to trauma. The adaptive responses, such as crypt cell proliferation and increased nutrient absorption, are critical in recovery, yet poorly understood. Understanding the molecular mechanism behind the adaptive responses is crucial to facilitate the identification of nutrients or drugs to enhance adaptation. Different approaches and models have been described throughout the literature, but a detailed descriptive way to essentially perform the procedures is needed to obtain reproducible data. Here, we describe a method to estimate important endpoints and proliferative markers of small intestinal injury and compensatory hyperproliferation using a model of chemotherapy-induced mucositis in mice. We demonstrate the detection of proliferating cells using a cell cycle specific marker, as well as using small intestinal weight, crypt depth, and villus height as endpoints. Some of the critical steps within the described method are the removal and weighing of the small intestine and the rather complex software system suggested for the measurement of this technique. These methods have the advantages that they are not time-consuming, and that they are cost-effective and easy to carry out and measure.

Here, we present a protocol to establish important endpoints and proliferative markers of small intestinal injury and compensatory hyperproliferation using a model of chemotherapy-induced mucositis. We demonstrate the detection of proliferating cells using a cell cycle specific marker and using small intestinal weight, crypt depth, and villus height as endpoints.

نقاط النهاية الهامة وعلامات التكاثر لتقييم إصابات الأمعاء الصغيرة والتكيف باستخدام نموذج الماوس من الغشاء المخاطي الناجم عن العلاج الكيميائي

Intestinal adaptation is the natural compensatory mechanism that occurs when the bowel is lost due to trauma. The adaptive responses, such as crypt cell ...

In Vitro Assay to Study Tumor-macrophage Interaction

Tumor associated macrophages (TAMs) account for a large percentage of cells in the tumor mass for different types of cancers. Glioblastoma (GBM), a malignant brain tumor with no cure, has up to a half the tumor mass TAMs. TAMs can be pro-tumoral or anti-tumoral, depending on the activation of specific genes in the cells. Genetic mutations in the tumors, through regulating cytokine expression, can affect recruitment of TAMs to the tumor microenvironment. Here, we describe a quantitative cell-based assay to assess macrophage recruitment by the conditioned medium from the tumor cells. This assay uses the human macrophage cell line MV-4-11 to study macrophage attraction by the conditioned medium from glioblastoma, allowing for high reproducibility and low variability. Data generated with this assay can contribute to a better understanding of the interaction between the tumor and the tumor microenvironment. Similar assay can be used to assess interaction between the tumor cells and other immune cells, including T cells and natural killer (NK) cells.

This article represents a useful in vitro assay to evaluate the capability of conditioned medium from tumor cells to attract macrophages.

في المختبر الاختبار لدراسة التفاعل الورم الضامة

Tumor associated macrophages (TAMs) account for a large percentage of cells in the tumor mass for different types of cancers. Glioblastoma (GBM), a ...

Prostate Organoid Cultures as Tools to Translate Genotypes and Mutational Profiles to Pharmacological Responses

Presented here is a protocol to study pharmacodynamics, stem cell potential, and cancer differentiation in prostate epithelial organoids. Prostate organoids are androgen responsive, three-dimensional (3D) cultures grown in a defined medium that resembles the prostatic epithelium. Prostate organoids can be established from wild-type and genetically engineered mouse models, benign human tissue, and advanced prostate cancer. Importantly, patient derived organoids closely resemble tumors in genetics and in vivo tumor biology. Moreover, organoids can be genetically manipulated using CRISPR/Cas9 and shRNA systems. These controlled genetics make the organoid culture attractive as a platform for rapidly testing the effects of genotypes and mutational profiles on pharmacological responses. However, experimental protocols must be specifically adapted to the 3D nature of organoid cultures to obtain reproducible results. Described here are detailed protocols for performing seeding assays to determine organoid formation capacity. Subsequently, this report shows how to perform drug treatments and analyze pharmacological response via viability measurements, protein isolation, and RNA isolation. Finally, the protocol describes how to prepare organoids for xenografting and subsequent in vivo growth assays using subcutaneous grafting. These protocols yield highly reproducible data and are widely applicable to 3D culture systems.

Presented here is a protocol to study pharmacological responses in prostate epithelial organoids. Organoids closely resemble in vivo biology and recapitulate patient genetics, making them attractive model systems. Prostate organoids can be established from wildtype prostates, genetically engineered mouse models, benign human tissue, and advanced prostate cancer.

كيفية دراسة بدروم غشاء تصلب بمثابة الزناد البيوفيزيائية في سرطان البروستاتا وعلوم الأمراض الأخرى ذات الصلة العمر أو الأمراض الاستقلابية

Summary

Explore More Videos

PLAYLIST