Name: utilizing functional genomics screening to identify potentially novel drug targets in cancer cell spheroid cultures
Uploaded: 2016-12-26T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 48 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Utilizing Functional Genomics Screening to Identify Potentially Novel Drug Targets in Cancer Cell Spheroid Cultures at JoVE.com

The authors would like to thank Fredrik Walberg (FACS and imaging facility, ICR) for assistance with microscopy. This work was funded by Breast Cancer Now. RN is the recipient of a Breast Cancer Now Career Development Fellowship (2011MaySF01).

1. إعداد لوحات سيرنا 96-جيدا ملاحظة: الحواف الخارجية للوحة 96-جيدا أكثر عرضة للتبخر مقارنة مع الآبار الأخرى، وبالتالي الحد من كمية الرناوات siRNAs إلى 60 في 96-جيدا لوحة. ملء الآبار الخارجي مع المتوسط ​​العادي أو برنامج تلفزيوني للحد من هذه. وبالإضافة إلى ذلك، فمن المستحسن شاشة التحقق من الزيارات للتخفيف من التحيز لوحة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمييع الرناوات siRNAs إلى 250-500 نانوغرام / ميكرولتر في خفض سيرم (حسب توصيات الشركة الصانعة) وقسامة 10 ميكرولتر من آبار المناسبة من لوحة مرفق منخفضة للغاية. أداء جميع الشاشات في ثلاث نسخ. ملاحظة: تتضمن عدم استهداف (سلبية) وقتل (إيجابية، مثل UBB وPLK1) الضوابط المناسبة سيرنا في تصميم لوحة لضمان كفاءة ترنسفكأيشن يمكن تقييم. استخدام لوحات التعلق منخفض للعمل سيرنا أمر بالغ الأهمية، كما سيتم إضافة الخلايا إلى خليط ترنسفكأيشن. نحن لا نستطيع أن نستبعد بعض الشركات المصنعة منخفضة للغاية التعلققد يكون لوحات آثار خفية على النمو كروي. على هذا النحو فإننا نوصي بأن هذه يتم اختبارها من قبل المستخدم النهائي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بطانات مع أختام لاصقة ومخزن في -20 درجة مئوية. </li></ol> 2. عكسي ترنسفكأيشن من الخط خلية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في يوم من الشاشة، وتذويب لوحات في درجة حرارة الغرفة وتدور لمدة 5 دقائق في 1000 x ج باستخدام جهاز للطرد المركزي المقعد العلوي. إضافة 10 ميكرولتر من انخفاض سيرم التي تحتوي على كاشف الأمثل ترنسفكأيشن إلى كل بئر باستخدام ماصة الأقنية. ترك لوحات لمدة 15 دقيقة للمجمعات ترنسفكأيشن التي تحتوي على سيرنا لتشكيل. ملاحظة: استخدمت هذه الدراسة خط سرطان الثدي خلية BT474 للفحص الجيني وظيفية (مثقف في ارتفاع DMEM الجلوكوز (Dulbecco لتعديل النسر متوسطة) تستكمل مع المصل 10٪ بقري جنيني (FBS) والمضادات الحيوية). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يعرض للتريبسين الخلايا ليتم عرضه (0.05٪ التربسين و 0.53 ملي EDTA) حتى فصل من القارورة، تحييد باستخدام حجم مناسب من specif خط الخليةجيم المتوسطة وتدور لمدة 5 دقائق في 1000 x ج على مقعد بين كبار الطرد المركزي لإزالة التربسين. و resuspend الخلايا مع حجم مناسب من المتوسط ​​وتحديد عدد الخلايا دقيقة باستخدام عداد الخلية. ملاحظة: عادة 5000 خلية لكل جيدا كافية لتكوين كروي في معظم خطوط الخلايا التي تم اختبارها. ومن المهم أن العد بدقة الخلايا كما تعليق خلية واحدة لإجراء مقارنات حجم دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمييع الخلايا إلى 5000 خلية لكل ميكرولتر 180 في المتوسط ​​الباردة (4 درجة مئوية). ملاحظة: سيتم إضافة عناصر مصفوفة الغشاء القاعدي المعاد تؤثر سلبا على كفاءة ترنسفكأيشن ومن المستحسن أن لا يتم استخدامه. خلية خط الأمثل لتأكيد قدرة كروي تشكيل وفعالية ضربة قاضية يجب أن يتم تنفيذ قبل الشاشة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل تعليق خلية إلى الخزان، الماصة لخلط وإضافة 180 ميكرولتر من كل بئر من 96 جيد جدا منخفض لوحة مرفق يحتوي على سيرنا معدة مسبقا (2.1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Centrifugالبريد لوحة في 1000 x ج في precooled 4 درجات مئوية الطرد المركزي لمدة 10 دقيقة ثم العودة إلى حاضنة الثقافة 37 ° C الأنسجة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ملاحظة: سوف تظهر الخلايا كما فسيفساء في قاع الآبار. على مدى المقبلة 12-24 ساعة الخلايا وتجميع معا لتشكيل مجال واحد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد 24 ساعة، ومراقبة الخلايا تشكل كروي واحد في وسط البئر. إضافة 100 ميكرولتر من المتوسط ​​كاملة إلى كل بئر لتشجيع النمو. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجديد المتوسطة بعد ثلاثة أيام. إزالة بلطف 100 ميكرولتر من المتوسط ​​من كل بئر وإضافة 100 ميكرولتر من متوسطة جديدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في يوم 7، قياس حجم كروي الآلي على قارئ لوحة التي يمكن رصد كميا نمو كروي على مر الزمن (انظر القسم 3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد ذلك، وتحديد بقاء الخلية باستخدام الانارة صبغ بقاء الخلية (انظر القسم 4). </li></ol> 3. الآلي الحصول على الصور <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مسح لوحات على المقعد العلوي، الصغيرة بشكل جيد لوحة التصوير الكريات في يوم 7. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"> &lt;لى&gt; افتح البرنامج، حدد ما يلي: &#39;96 -well لوحة &quot;، حدد نوع لوحة المناسب وإدخال اسم التجربة. ملاحظة: يمكن أيضا إضافة أي معلومات إضافية في البرنامج. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حدد التطبيق &quot;Tumorsphere&quot;. تغيير التركيز بحيث كروي هو في التركيز وعلى النقيض الأمثل. ملاحظة: نوصي &quot;صورة التركيز على أساس&quot; كما اختلافات كبيرة في أحجام كروي من المتوقع. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حدد الآبار التي تتطلب مسح و &quot;مسح البداية&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام برنامج الماسح الضوئي لوحة، وتأكد من أن قناع كائن يمثل بدقة حجم كروي. القيام بذلك عن طريق ضبط إعدادات قطر مستعمرة، اتساع الحدود، والحد الأدنى سمك والدقة، الخاصة بكل خط اختبار الخلية 11،12. ملاحظة: سيتم بعد ذلك احتساب مساحة كروي باستخدام خوارزمية البرنامج. على سبيل المثال، لحساب دقيق لمنطقة الكروية BT474 نمت لمدة سبعة أيام ضبط الدقة إلى &#39;العالية&#39; لتعيين د الحد الأدنى لقطر مستعمرة إلى 200 ميكرومتر. هذا يجب أن ينتج ممثل قناع كروي المناسب للمنطقة كروي. ملاحظة: يمكن بعد ذلك يتم تصدير هذه البيانات من الجهاز، وذلك باستخدام وظيفة التصدير، في في شكل ملف البيانات المشروح. التاريخ هو لوحة متوسط ​​تطبيع، جنبا إلى جنب وتحليلها إما عن طريق ض النتيجة أو موحد صارم فرق المتوسط ​​(SSMD) لتحديد الرناوات siRNAs التي كان لها تأثير ذو دلالة إحصائية في منطقة كروي. </li></ol></li></ol> 4. تحديد بقاء الخلية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد أن تم احتساب مساحة كروي، تحديد صلاحية استخدام الانارة صبغ الخلايا قدرتها على البقاء. تحضير كاشف وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة بعناية 100 ميكرولتر من المتوسط ​​من كل بئر وإضافة 100 ميكرولتر من صبغ جدوى. احتضان لوحات لمدة 15 دقيقة ثم مسح باستخدام قارئ لوحة الانارة. ملاحظة: يمكن بعد ذلك يتم تصدير هذه البيانات من الجهاز، وذلك باستخدام وظيفة التصدير، في فيشكل ملف البيانات المشروح. التاريخ هو لوحة متوسط ​​تطبيع، جنبا إلى جنب وتحليلها إما عن طريق ض النتيجة أو موحد صارم فرق المتوسط ​​(SSMD) لتحديد الرناوات siRNAs التي كان لها تأثير ذو دلالة إحصائية على حيوية كروي. </li></ol>

<ol>
	<li>Seton-Rogers, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cooperation+of+the+ErbB2+receptor+and+transforming+growth+factor+beta+in+induction+of+migration+and+invasion+in+mammary+epithelial+cells.">Cooperation of the ErbB2 receptor and transforming growth factor beta in induction of migration and invasion in mammary epithelial cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (5), 1257-1262 (2004).</li><li>Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphogenesis+and+oncogenesis+of+MCF-10A+mammary+epithelial+acini+grown+in+three-dimensional+basement+membrane+cultures.">Morphogenesis and oncogenesis of MCF-10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures.</a> Methods. 30 (3), 256-268 (2003).</li><li>Chia, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prognostic+significance+of+a+novel+hypoxia-regulated+marker,+carbonic+anhydrase+IX,+in+invasive+breast+carcinoma.">Prognostic significance of a novel hypoxia-regulated marker, carbonic anhydrase IX, in invasive breast carcinoma.</a> J Clin Oncol. 19 (16), 3660-3668 (2001).</li><li>Trastour, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIF-1alpha+and+CA+IX+staining+in+invasive+breast+carcinomas:+prognosis+and+treatment+outcome.">HIF-1alpha and CA IX staining in invasive breast carcinomas: prognosis and treatment outcome.</a> Int J Cancer. 120 (7), 1451-1458 (2007).</li><li>Wilson, W. R., Hay, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+hypoxia+in+cancer+therapy.">Targeting hypoxia in cancer therapy.</a> Nat Rev Cancer. 11 (6), 393-410 (2011).</li><li>Ros, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+metabolic+screen+identifies+6-phosphofructo-2-kinase/fructose-2,6-biphosphatase+4+as+an+important+regulator+of+prostate+cancer+cell+survival.">Functional metabolic screen identifies 6-phosphofructo-2-kinase/fructose-2,6-biphosphatase 4 as an important regulator of prostate cancer cell survival.</a> Cancer Discov. 2 (4), 328-343 (2012).</li><li>Baenke, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+screening+identifies+MCT4+as+a+key+regulator+of+breast+cancer+cell+metabolism+and+survival.">Functional screening identifies MCT4 as a key regulator of breast cancer cell metabolism and survival.</a> J Pathol. 237 (2), 152-165 (2015).</li><li>Schug, Z. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acetyl-CoA+synthetase+2+promotes+acetate+utilization+and+maintains+cancer+cell+growth+under+metabolic+stress.">Acetyl-CoA synthetase 2 promotes acetate utilization and maintains cancer cell growth under metabolic stress.</a> Cancer Cell. 27 (1), 57-71 (2015).</li><li>Mashimo, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acetate+is+a+bioenergetic+substrate+for+human+glioblastoma+and+brain+metastases.">Acetate is a bioenergetic substrate for human glioblastoma and brain metastases.</a> Cell. 159 (7), 1603-1614 (2014).</li><li>Comerford, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acetate+dependence+of+tumors.">Acetate dependence of tumors.</a> Cell. 159 (7), 1591-1602 (2014).</li><li>Vinci, M., Box, C., Eccles, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+(3D)+tumor+spheroid+invasion+assay.">Three-dimensional (3D) tumor spheroid invasion assay.</a> J Vis Exp. (99), e52686 (2015).</li><li>Vinci, M., Box, C., Zimmermann, M., Eccles, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+spheroid-based+migration+assays+for+evaluation+of+therapeutic+agents.">Tumor spheroid-based migration assays for evaluation of therapeutic agents.</a> Methods Mol Biol. 986, 253-266 (2013).</li><li>Barretina, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Cancer+Cell+Line+Encyclopedia+enables+predictive+modelling+of+anticancer+drug+sensitivity.">The Cancer Cell Line Encyclopedia enables predictive modelling of anticancer drug sensitivity.</a> Nature. 483 (7391), 603-607 (2012).</li><li>Maguire, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SF3B1+mutations+constitute+a+novel+therapeutic+target+in+breast+cancer.">SF3B1 mutations constitute a novel therapeutic target in breast cancer.</a> J Pathol. 235 (4), 571-580 (2015).</li><li>Brough, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+viability+profiles+of+breast+cancer.">Functional viability profiles of breast cancer.</a> Cancer Discov. 1 (3), 260-273 (2011).</li><li>Ferber, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FOXO3a+regulates+reactive+oxygen+metabolism+by+inhibiting+mitochondrial+gene+expression.">FOXO3a regulates reactive oxygen metabolism by inhibiting mitochondrial gene expression.</a> Cell Death Differ. 19 (6), 968-979 (2012).</li><li>Jensen, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FoxO3A+promotes+metabolic+adaptation+to+hypoxia+by+antagonizing+Myc+function.">FoxO3A promotes metabolic adaptation to hypoxia by antagonizing Myc function.</a> EMBO J. 30 (22), 4554-4570 (2011).</li><li>Ivascu, A., Kubbies, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+of+cell-mediated+adhesions+in+breast+cancer+spheroids.">Diversity of cell-mediated adhesions in breast cancer spheroids.</a> Int J Oncol. 31 (6), 1403-1413 (2007).</li><li>Bitler, B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+lethality+by+targeting+EZH2+methyltransferase+activity+in+ARID1A-mutated+cancers.">Synthetic lethality by targeting EZH2 methyltransferase activity in ARID1A-mutated cancers.</a> Nat Med. 21 (3), 231-238 (2015).</li><li>Dow, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inducible+in+vivo+genome+editing+with+CRISPR-Cas9.">Inducible in vivo genome editing with CRISPR-Cas9.</a> Nat Biotechnol. 33 (4), 390-394 (2015).</li></ol>

Open Access fees were supported by Nexcelom Bioscience, LLC.

يجري استخدام نماذج ثلاثية الأبعاد للسرطان على نحو متزايد لتقييم فعالية من المركبات المعروفة والجديدة التي تم تصميمها لقتل انتقائي الخلايا السرطانية. الكروية الخلايا السرطانية هي هياكل التي تعرض ظروف أكثر مماثلة لتلك التي واجهتها في الأورام في الجسم الحي، وبالتالي المركبات التي زادت فعالية في 3D هم أكثر عرضة ليكون لها تأثير في الجسم الحي. ومع ذلك، هذه الطرائق لا تسمح لتحديد أهداف محتملة الرواية التي لم تكن موضوع تصميم الأدوية التي يمكن أن يكون لها فعالية كبيرة في علاج السرطان. قمنا بتطوير سيرنا علم الجينوم الوظيفي النهج الذي سمح لإسكات الجينات دائم لمدة تصل إلى سبعة أيام في سرطان الكروية خط الخلية. هناك العديد من الخطوات الهامة للبروتوكول التي تتطلب التحسين قبل لا يمكن أن يؤديها شاشة سيرنا. القدرة على تكوين الأجسام الشبه الكروية قابلة للحياة استنساخه على نطاق واسع أمر ضروري. علاوة على ذلك،شروط ترنسفكأيشن ppropriate ينبغي أن يكون الأمثل بدقة. نقترح عليك تجريب عدة الكواشف ترنسفكأيشن مختلفة مع عدم استهداف المناسب وقتل الضوابط قبل محاولة الشاشة. كنا قادرين على إظهار أن العديد من يشيع استخدامها خطوط خلايا سرطان الثدي، وهي BT474، كانت MCF10DCIS.com، MDA-MB-231 وJIMT1 قابلة للسيرنا ترنسفكأيشن. وعلاوة على ذلك، ونحن نقدم إثبات صحة المبدأ البيانات فحص 200 من الجين المتحول في أغلب الأحيان في سرطان الثدي في الكروية BT474، أكدت اعتمادها على التضخيم من HER2 وطفرة أنكجنيك من PIK3CA. ومن المثير للاهتمام، أدى إسكات FOXO3 عامل النسخ إلى انخفاض في حجم كروي ولكن ليس له تأثير كبير على قدرتها على البقاء. ومن المعروف FOXO3 لتنظيم استجابة لنقص الأكسجين، وتغيير القدرة على التمثيل الغذائي للخلايا السرطانية مما يسمح لهم للتكيف بسهولة أكبر مع بيئتها 16. هذا الدور الذي يمكن أن يحتمل تتداخل مع القراءة بقاء الخلية كما يكشف ATP وفرة، واحدة من المنتجات الرئيسية للاستقلاب الخلية. ودعما للمراقبة انخفاض في حجم كروي، فقد تبين أن إسكات FOXO3 في هيلا xenografts ضعف نمو الورم ويتسبب موت الخلايا المبرمج 17. من المهم أن نلاحظ أن بعض الجينات قد تؤثر على قدرة الخلايا السرطانية على الاحتفاظ الهندسة المعمارية 3D، والتي يمكن أن تؤدي إلى ايجابيات كاذبة. على سبيل المثال، أدت ضربة قاضية من E-كادهيرين في حل BT474 هيكل كروي. تم الإبلاغ عن هذا مسبقا باستخدام E-كادهيرين المستهدفة الأجسام المضادة 18. كما هو الحال مع أي منصة الفرز، يجب rescreened الأهداف المحتملة لتقييم استنساخ تأثير ملاحظتها. هناك قيود على هذه التقنية، وهي طبيعة عابرة للضربة قاضية الجينات بوساطة سيرنا. كانت متواصلة إسكات أكثر من سبعة أيام لا يمكن تحقيقها مع سيرنا. وميزة هذا النهج هو أنه يمكن أن يقترن مع مختلف إحيائية أخرىالأصباغ TRIC ليس فقط تلك التي تقيم الجدوى كروي، على سبيل المثال، وإعطاء المعلومات المكانية من نقص الأكسجة كروي أو مراقبة الخلايا التي تمر موت الخلايا المبرمج. وعلاوة على ذلك، لأن بمسح لوحة القارئ سريعة نسبيا وغير الغازية، وتأثير الرناوات siRNAs على حجم كروي يمكن تقييم مرور الوقت بدلا من مجرد عند نقطة نهاية التجريبية. في الواقع، ونحن حاليا بصدد استكشاف العديد من هذه السبل في خط أنابيب الفحص والتدقيق. نهجا بديلا التي تستخدم الثقافات 3D لتحديد تبعيات جديدة هو استخدام المكتبات الكيميائية التي تمنع أي مجموعة واسعة من الأهداف أو أسر معينة من البروتينات. في الواقع، Bitler وآخرون. تستخدم هذه الطريقة تستهدف التعرف على التفاعل الفتك الاصطناعية بين الحالة ARID1A ومثبطات EZH2 في المبيض سرطان الخلايا واضحة (19). وقد سمح اكتشاف كريسبر-Cas9 تكنولوجيا التحرير الجين أيضا لتطوير شاشات الوراثية في الثقافات عضي وفي الجسم الحي. ومع ذلك، رمنهجه يعتمد على وجود مرافق الحيوانات المناسبة ويمكن أن تكلف باهظة 20. في الختام، ونحن نعتقد أننا قمنا بتحديد البروتوكول الذي أكثر دقة النماذج الأكسجين والمغذيات التدرجات، التي هي من سمات المكروية الورم في الجسم الحي، والسماح لتحديد أهداف سرطان جديدة أو التحقق من صحة قوية من الأهداف المحددة. وعلاوة على ذلك، يمكن تطبيق بروتوكول لدينا أي نوع من خط الخلية التي تشكل الكروية، وبالتالي يمكن استخدامها بشكل روتيني في المجتمع أبحاث السرطان للشاشات سيرنا الإنتاجية العالية.

الأورام الصلبة عرض النسيجية كبيرة، وراثي والجزئي البيئي التجانس داخل الورم، الذي يعرض الأطباء مع تحديا كبيرا في القدرة على علاج المرضى بنجاح. غالبية النماذج المستخدمة لتحديد رواية استهدفت العلاجات لا تتضمن الكثير من هذه الميزات. في الواقع، لقد تم تطوير العلاجات المستهدفة الحالية المستخدمة في عيادة في العقد الماضي باستخدام نهج الفرز التي تعتمد على خطوط الخلايا السرطانية المزروعة في ظل ظروف ثنائي الأبعاد (2D) الثقافة. على الرغم من أن هذا أدى إلى نجاحات مختلفة، مثل مثبطات مستقبلات التيروزين كيناز، أصبح من الواضح أن المزيد من النماذج المعقدة من السرطان المطلوبة لنقدر تماما العوامل المساهمة التي تدفع تكون الأورام في الجسم الحي، وزيادة عدد من العلاجات الجديدة التي تجعل الانتقال من نماذج ما قبل السريرية إلى التجارب السريرية. وعلاوة على ذلك، فإنه الآن بتقدير جيد أن أنظمة ثقافة 2D تفشل لتعكس فيفيفو سلوك 1،2. على سبيل المثال، في أورام أوعية دموية سيئة، حيث أن الطلب على الأوكسجين والمواد المغذية داخل المكروية يفوق العرض، ومناطق من الولادات العالية والمنخفضة تتطور. وجود الأكسجين المنخفض (نقص الأكسجين) في الأورام، والكشف عنها من قبل تلطيخ المناعى من المقاطع الورم لعلامات نقص الأوكسجين إنشاء مثل الأنهيدراز الكربونيك التاسع (CAIX)، يرتبط مع نتائج السريرية الأكثر فقرا في سرطان الثدي 3،4 ميزات وهكذا دمج مثل نقص الأكسجين في نماذج الفحص قد يؤدي إلى تعزيز قدرتنا على اكتشاف أهداف المخدرات الرواية التي سوف تكون أكثر فعالية في الجسم الحي. في الواقع، تمكنت بنجاح من استهداف الأورام العدوانية التي تحتوي على نقص الأكسجين هو الأولوية السريرية 5. ويغير التقليدية فحص 2D سيرنا، في محاولة لتلخيص أكثر دقة عناصر من الشروط التي الخلايا السرطانية التي واجهتها في المكروية الورم، وأدى إلى تحديد عدة جينات عشرفي وقد وجد أن تكون مهمة لنمو الورم في الجسم الحي. وتشمل هذه الشاشات الجينومية الوظيفية التي تجرى في ظروف المصل منخفضة 6، 7 ظروف نقص الأوكسجين وفي تركيبة 8. على سبيل المثال، إسكات 6 فوسفو-2-كيناز / الفركتوز-2،6-Biphosphatase 4 (PFKFB4)، وهو بروتين مسؤول عن تنظيم الكربون تحلل الدخول، يتسبب فقط في موت الخلايا المبرمج خطوط سرطان البروستاتا المستمدة من ورم خبيث عندما نمت في مصل الدم المنخفض. كان إسكات PFKFB4 في خطوط خلايا البروستاتا الطبيعية في ظل نفس الظروف أي تأثير، في حين، ونضوب PFKFB4 ذاب تماما نمو البروستاتا خط الخلايا السرطانية xenografts 6. في لوحة طويلة من خطوط خلايا سرطان الثدي، وإسكات أحادية كربوكسيلاز نقل 4 (MCT4) أدى بشكل تفضيلي في الحد من نمو خط الخلية تحت ظروف نقص الأوكسجين. تم التحقق من صحة هذا الضعف في الجسم الحي في سرطان الثدي خط الخلية xenogra المتعامدةFTS. وكان ربما أكثر لافت للنظر، إسكات أسيتيل التميم مخلقة 2 (ACSS2)، وهو الانزيم المسؤول عن تحويل خلات إلى أسيتيل التميم، وانخفاض عدد الخلايا السرطانية تحت ظروف الإجهاد المغذيات (انخفاض الأكسجين والدم) ولكن القليل أو أي تأثير في ظل ظروف ثقافة العادية 8. أثرت الاجتثاث من ACSS2 نمو الثدي وسرطان البروستاتا xenografts مما يشير إلى أن التدرجات الغذائية لا وجود لها في عزلة داخل المكروية الورم وأن الخلايا الموجودة في هذه المناطق ضرورية لتطور الورم 8. وعلاوة على ذلك، تم العثور على ACSS2 أيضا أن من المهم في الإصابة بالورم الأرومي الدبقي وسرطان الخلايا الكبدية 9،10، مما يعني أن زيادة النشاط ACSS2 في الأورام يمكن أن تكون آلية الأساسية التي تدعم النمو في ظل ظروف غير مواتية. بشكل جماعي، هذه الدراسات تثبت أن تلخص الظروف التي واجهتها في الجسم الحي وأداء شاشات سيرنا يسمح لتحديد زأنيس الأساسية للبقاء على قيد الحياة سرطان. وكذلك تؤثر على نمو الخلايا السرطانية 2D تحت ظروف الإجهاد المغذيات، تحول دون استنزاف الجينات المستهدفة في هذه الدراسات السرطان نمو كروي خط الخلية، وهو ما يعكس ما لوحظ في xenografts الورم 6،8. وهكذا، الكروية خط الخلايا السرطانية تحتوي على العديد من الشروط التي واجهتها في المكروية الورم الذي نقل حساسية لإسكات ACSS2. في الواقع، الكروية عرض التدرجات المواد الغذائية (المصل والأوكسجين)، والتغيرات في درجة الحموضة، وثلاثي الأبعاد (3D) خلية خلية الاتصال، ولكن أيضا، وتعديلات في سرعته التكاثري مع الخلايا التي تمر اعتقال دورة الخلية وموت الخلايا المبرمج. ويتمثل ذلك من خلال وجود في الكروية سرطان المناطق الميتة، وهي ميزة لا توجد في ثقافة 2D التقليدية. وقد تم بالفعل استخدام الكروية الخلايا السرطانية كما النماذج ذات الصلة أكثر بيولوجيا لفحص مثبطات جزيء صغير ولكن هذا يسمح فقط للتحقق من صحة فعالية مركب أو تطويعها لأغراض أخرى من كومبوجهاز الأمم المتحدة الإنمائي تصميم أصلا لأمراض أخرى (11). طرق كروي الفحص الحالية لا تسمح لتحليل نضوب جين معين في الإنتاجية العالية من الطريقة عالية المحتوى. هنا، نحن تصف لأول مرة، خط أنابيب علم الجينوم وظيفية لكشف تبعيات جينية معينة باستخدام تكنولوجيا الصغيرة بالتدخل RNA (سيرنا) في سرطان الكروية خط الخلية. لقد قمنا بتصميم مكتبة مفصل مع الرناوات siRNAs استهداف 200 من الجين المتحول في أغلب الأحيان في سرطانات الثدي البشرية وتقييم تأثير استنفاد الجينات على حجم كروي والنشاط الأيضي في BT474 الكروية سرطان الثدي. كنا قادرين على بقوة وبتكاثر كشف عن تأثير ERBB2 وPIK3CA إسكات في الثقافات 3D. وعلاوة على ذلك، فإننا لا يمكن تقييم أثر نضوب الجينات على بنية المكانية الكروية BT474 باستخدام المناعية.

<table><tbody><tr><td>Lullaby</td><td>Oz Biosciences</td><td>LL70500&amp;nbsp;</td><td>lipid-based transfection reagent</td></tr><tr><td>Viromer</td><td>Lipocalyx</td><td>VB-01LB-01</td><td>virus-like polymer transfection reagent</td></tr><tr><td>Ultra-low attachment plate</td><td>Corning</td><td>CLS7007</td><td>96 well plate</td></tr><tr><td>Foil plate seals</td><td>ThermoFisher</td><td>AB-0626</td><td></td></tr><tr><td>Luminescent cell viability dye</td><td>Promega</td><td>G7570</td><td>CellTitre-Glo</td></tr><tr><td>Pipette tips (200 &amp;#956;L)</td><td>Starlab</td><td>S1111-0806</td><td></td></tr><tr><td>Pipette tips (10 &amp;#956;L)</td><td>Starlab</td><td>S1111-3800</td><td></td></tr><tr><td>Pipette tips (1, 000 &amp;#956;L)</td><td>Starlab</td><td>S1122-1830</td><td></td></tr><tr><td>Serological pipettes (5 mL)</td><td>Sarstedt</td><td>86.1253.025</td><td></td></tr><tr><td>Serological pipettes (10 mL)</td><td>Sarstedt</td><td>86.1254.025</td><td></td></tr><tr><td>Serological pipettes (25 mL)</td><td>Sarstedt</td><td>86.1685.020</td><td></td></tr><tr><td>RPMI Media</td><td>GIBCO</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>DMEM Media</td><td>GIBCO</td><td>11965-084</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>GIBCO</td><td>31985070</td><td></td></tr><tr><td>Feta bovine serum</td><td>GIBCO</td><td>16140063</td><td></td></tr><tr><td>siRNA</td><td>Dharmacon</td><td>Cherry picked library</td><td></td></tr><tr><td>Countess Cell Counter</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AMQAX1000</td><td></td></tr><tr><td>Cell counting chamber slides</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>C10312</td><td></td></tr><tr><td>Celigo S</td><td>Nexcelom</td><td>contact company</td><td></td></tr><tr><td>Victor X5</td><td>Perkin Elmer</td><td>contact company</td><td></td></tr><tr><td>Benchtop centrifuge</td><td>Various</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Axiovert Inverted brightfield microscope</td><td>Zeiss</td><td>contact company</td><td></td></tr><tr><td>Tissue culture CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;; Incubator</td><td>Various</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mulitichannel pipette</td><td>Various</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

utilizing functional genomics screening to identify potentially novel drug targets in cancer cell spheroid cultures

تحديد الأحداث سائق وظيفية في سرطان أمر أساسي لتعزيز فهمنا للبيولوجيا السرطان والتي لا غنى عنها لاكتشاف الجيل القادم من أهداف عقار جديد. أصبح من الواضح أن المزيد من النماذج المعقدة من السرطان يطلب منها أن نقدر العوامل المساهمة التي تدفع تكون الأورام في الجسم الحي، وزيادة فعالية العلاجات الجديدة التي تجعل الانتقال من نماذج ما قبل السريرية إلى التجارب السريرية. هنا نقدم منهجية لتوليد الأجسام الشبه الكروية الورم موحدة وقابلة للتكرار التي يمكن أن تخضع لفحص وظيفي سيرنا. هذه الأجسام الشبه الكروية تعرض العديد من الخصائص التي توجد في الأورام الصلبة التي ليست موجودة في الثقافة يومين البعد التقليدية. وتبين لنا أن العديد من خطوط خلايا سرطان الثدي شيوعا هي قابلة للهذا البروتوكول. وعلاوة على ذلك، ونحن نقدم إثبات صحة المبدأ البيانات باستخدام سرطان الثدي خط الخلية BT474، مؤكدا علىالاعتماد على التضخيم من عامل نمو البشرة مستقبلات HER2 وتحور فوسفتيدلينوستول-4،5-biphosphate 3-كيناز (PIK3CA) عندما نمت كما الكروية الورم. وأخيرا، ونحن قادرون على مواصلة التحقيق والتأكد من تأثير المكاني لهذه التبعيات باستخدام المناعية.

Watch this Scientific Journal Video about Utilizing Functional Genomics Screening to Identify Potentially Novel Drug Targets in Cancer Cell Spheroid Cultures at JoVE.com

Utilizing Functional Genomics Screening to Identify Potentially Novel Drug Targets in Cancer Cell Spheroid Cultures

Identifying novel drug targets that transition from pre-clinical testing to human trials is a scientific priority. To that end, here we describe a functional genomics approach for examining the impact of gene depletion on cancer cell line spheroids, which more appropriately model human cancers in vivo.

الاستفادة من علم الجينوم وظيفية الفرز لتحديد أهداف المخدرات رواية يحتمل في الثقافات كروي الخلية السرطانية

The identification of functional driver events in cancer is central to furthering our understanding of cancer biology and indispensable for the discovery ...

utilizing-functional-genomics-screening-to-identify-potentially-novel

Research

JoVE Journal

Cancer Research

11.3K Views.  The Institute of Cancer Research. Identifying novel drug targets that transition from pre-clinical testing to human trials is a scientific priority. To that end, here we describe a functional genomics approach for examining the impact of gene depletion on cancer cell line spheroids, which more appropriately model human cancers in vivo.

Video: Utilizing Functional Genomics Screening to Identify Potentially Novel Drug Targets in Cancer Cell Spheroid Cultures

Preparation and Metabolic Assay of 3-dimensional Spheroid Co-cultures of Pancreatic Cancer Cells and Fibroblasts

Many cancer types, including pancreatic cancer, have a dense fibrotic stroma that plays an important role in tumor progression and invasion. Activated cancer associated fibroblasts are a key component of the tumor stroma that interact with cancer cells and support their growth and survival. Models that recapitulate the interaction of cancer cells and activated fibroblasts are important tools for studying the stromal biology and for development of antitumor agents. Here, a method is described for the rapid generation of robust 3-dimensional (3D) spheroid co-culture of pancreatic cancer cells and activated pancreatic fibroblasts that can be used for subsequent biological studies. Additionally, described is the use of 3D spheroids in carrying out functional metabolic assays to probe cellular bioenergetics pathways using an extracellular flux analyzer paired with a spheroid microplate. Pancreatic cancer cells (Patu8902) and activated pancreatic fibroblast cells (PS1) were co-cultured and magnetized using a biocompatible nanoparticle assembly. Magnetized cells were rapidly bioprinted using magnetic drives in a 96 well format, in growth media to generate spheroids with a diameter ranging between 400-600 &#181;m within 5-7 days of culture. Functional metabolic assays using Patu8902-PS1 spheroids were then carried out using the extracellular flux technology to probe cellular energetic pathways. The method herein is simple, allows consistent generation of cancer cell-fibroblast spheroid co-cultures and can be potentially adapted to other cancer cell types upon optimization of the current described methodology.

Here, a method is described for the preparation of 3-dimensional (3D) spheroid co-culture of pancreatic cancer cells and fibroblasts, followed by measurement of metabolic functions using an extracellular flux analyzer.

الإعداد والتحليل الأيضي الثقافات المشارك كروي ثلاثي الأبعاد لخلايا سرطان البنكرياس والخلايا الليفية

Many cancer types, including pancreatic cancer, have a dense fibrotic stroma that plays an important role in tumor progression and invasion. Activated ...

Generation of High-Throughput Three-Dimensional Tumor Spheroids for Drug Screening

Cancer cells have routinely been cultured in two dimensions (2D) on a plastic surface. This technique, however, lacks the true environment a tumor mass is exposed to in vivo. Solid tumors grow not as a sheet attached to plastic, but instead as a collection of clonal cells in a three-dimensional (3D) space interacting with their neighbors, and with distinct spatial properties such as the disruption of normal cellular polarity. These interactions cause 3D-cultured cells to acquire morphological and cellular characteristics which are more relevant to in vivo tumors. Additionally, a tumor mass is in direct contact with other cell types such as stromal and immune cells, as well as the extracellular matrix from all other cell types. The matrix deposited is comprised of macromolecules such as collagen and fibronectin.
In an attempt to increase the translation of research findings in oncology from bench to bedside, many groups have started to investigate the use of 3D model systems in their drug development strategies. These systems are thought to be more physiologically relevant because they attempt to recapitulate the complex and heterogeneous environment of a tumor. These systems, however, can be quite complex, and, although amenable to growth in 96-well formats, and some now even in 384, they offer few choices for large-scale growth and screening. This observed gap has led to the development of the methods described here in detail to culture tumor spheroids in a high-throughput capacity in 1536-well plates. These methods represent a compromise to the highly complex matrix-based systems, which are difficult to screen, and conventional 2D assays. A variety of cancer cell lines harboring different genetic mutations are successfully screened, examining compound efficacy by using a curated library of compounds targeting the Mitogen-Activated Protein Kinase or MAPK pathway. The spheroid culture responses are then compared to the response of cells grown in 2D, and differential activities are reported. These methods provide a unique protocol for testing compound activity in a high-throughput 3D setting.

Across a wide variety of disease indications, more physiologically relevant models are being developed and implemented into drug discovery programs. The new model system described here demonstrates how three-dimensional tumor spheroids can be cultured and screened in a high-throughput 1536-well plate-based system to search for new oncology drugs.

جيل الماغنيسيوم الفائق الورم ثلاثية الأبعاد لفحص المخدرات

Cancer cells have routinely been cultured in two dimensions (2D) on a plastic surface. This technique, however, lacks the true environment a tumor mass is ...

Physiologic Patient Derived 3D Spheroids for Anti-neoplastic Drug Screening to Target Cancer Stem Cells

In this protocol, we outline the procedure for generation of tumor spheroids within 384-well hanging droplets to allow for high-throughput screening of anti-cancer therapeutics in a physiologically representative microenvironment. We outline the formation of patient derived cancer stem cell spheroids, as well as, the manipulation of these spheroids for thorough analysis following drug treatment. Specifically, we describe collection of spheroid morphology, proliferation, viability, drug toxicity, cell phenotype and cell localization data. This protocol focuses heavily on analysis techniques that are easily implemented using the 384-well hanging drop platform, making it ideal for high throughput drug screening. While we emphasize the importance of this model in ovarian cancer studies and cancer stem cell research, the 384-well platform is amenable to research of other cancer types and disease models, extending the utility of the platform to many fields. By improving the speed of personalized drug screening and the quality of screening results through easily implemented physiologically representative 3D cultures, this platform is predicted to aid in the development of new therapeutics and patient-specific treatment strategies, and thus have wide-reaching clinical impact.

This protocol describes generation of patient-derived spheroids, and downstream analysis including quantification of proliferation, cytotoxicity testing, flow cytometry, immunofluorescence staining and confocal imaging, in order to assess drug candidates&#8217; potential as anti-neoplastic therapeutics. This protocol supports precision medicine with identification of specific drugs for each patient and stage of disease.

الفيزيولوجيالمريض المستمدة 3D Spheroids لفحص المخدرات المضادة للأورام لاستهداف الخلايا الجذعية السرطان

In this protocol, we outline the procedure for generation of tumor spheroids within 384-well hanging droplets to allow for high-throughput screening of ...

Assessing Cell Viability and Death in 3D Spheroid Cultures of Cancer Cells

Three-dimensional spheroids of cancer cells are important tools for both cancer drug screens and for gaining mechanistic insight into cancer cell biology. The power of this preparation lies in its ability to mimic many aspects of the in vivo conditions of tumors while being fast, cheap, and versatile enough to allow relatively high-throughput screening. The spheroid culture conditions can recapitulate the physico-chemical gradients in a tumor, including the increasing extracellular acidity, increased lactate, and decreasing glucose and oxygen availability, from the spheroid periphery to its core. Also, the mechanical properties and cell-cell interactions of in vivo tumors are in part mimicked by this model. The specific properties and consequently the optimal growth conditions, of 3D spheroids, differ widely between different types of cancer cells. Furthermore, the assessment of cell viability and death in 3D spheroids requires methods that differ in part from those employed for 2D cultures. Here we describe several protocols for preparing 3D spheroids of cancer cells, and for using such cultures to assess cell viability and death in the context of evaluating the efficacy of anticancer drugs.

Here, we present several simple methods for evaluating viability and death in 3D cancer cell spheroids, which mimic the physico-chemical gradients of in vivo tumors much better than the 2D culture. The spheroid model, therefore, allows evaluation of the cancer drug efficacy with improved translation to in vivo conditions.

تقييم صلاحية الخلية والموت في الثقافات الكروية ثلاثية الأبعاد للخلايا السرطانية

Three-dimensional spheroids of cancer cells are important tools for both cancer drug screens and for gaining mechanistic insight into cancer cell biology. ...

Robotic Production of Cancer Cell Spheroids with an Aqueous Two-phase System for Drug Testing

Cancer cell spheroids present a relevant in vitro model of avascular tumors for anti-cancer drug testing applications. A detailed protocol for producing both mono-culture and co-culture spheroids in a high throughput 96-well plate format is described in this work. This approach utilizes an aqueous two-phase system to confine cells into a drop of the denser aqueous phase immersed within the second aqueous phase. The drop rests on the well surface and keeps cells in close proximity to form a single spheroid. This technology has been adapted to a robotic liquid handler to produce size-controlled spheroids and expedite the process of spheroid production for compound screening applications. Spheroids treated with a clinically-used drug show reduced cell viability with increase in the drug dose. The use of a standard micro-well plate for spheroid generation makes it straightforward to analyze viability of cancer cells of drug-treated spheroids with a micro-plate reader. This technology is straightforward to implement both robotically and with other liquid handling tools such as manual pipettes.

A protocol for robotic printing of cancer cell spheroids in a high throughput 96-well plate format using an aqueous two-phase system is presented.

الإنتاج الآلي للسرطان خلية الأجسام الشبه الكروية مع نظام مائي مرحلتين لاختبار المخدرات

Cancer cell spheroids present a relevant in vitro model of avascular tumors for anti-cancer drug testing applications. A detailed protocol for producing ...

Bioengineering

Establishing 3-Dimensional Spheroids from Patient-Derived Tumor Samples and Evaluating their Sensitivity to Drugs

Despite remarkable advances in understanding tumor biology, the vast majority of oncology drug candidates entering clinical trials fail, often due to a lack of clinical efficacy. This high failure rate illuminates the inability of the current preclinical models to predict clinical efficacy, mainly due to their inadequacy in reflecting tumor heterogeneity and the tumor microenvironment. These limitations can be addressed with 3-dimensional (3D) culture models (spheroids) established from human tumor samples derived from individual patients. These 3D cultures represent real-world biology better than established cell lines that do not reflect tumor heterogeneity. Furthermore, 3D cultures are better than 2-dimensional (2D) culture models (monolayer structures) since they replicate elements of the tumor environment, such as hypoxia, necrosis, and cell adhesion, and preserve the natural cell shape and growth. In the present study, a method was developed for preparing primary cultures of cancer cells from individual patients that are 3D and grow in multicellular spheroids. The cells can be derived directly from patient tumors or patient-derived xenografts. The method is widely applicable to solid tumors (e.g., colon, breast, and lung) and is also cost-effective, as it can be performed in its entirety in a typical cancer research/cell biology lab without relying on specialized equipment. Herein, a protocol is presented for generating 3D tumor culture models (multicellular spheroids) from primary cancer cells and evaluating their sensitivity to drugs using two complementary approaches: a cell-viability assay (MTT) and microscopic examinations. These multicellular spheroids can be used to assess potential drug candidates, identify potential biomarkers or therapeutic targets, and investigate the mechanisms of response and resistance.

The present protocol describes generating 3D tumor culture models from primary cancer cells and evaluating their sensitivity to drugs using cell-viability assays and microscopic examinations.

إنشاء كرويات 3 الأبعاد من عينات الورم المشتقة من المريض وتقييم حساسيتها للأدوية

Despite remarkable advances in understanding tumor biology, the vast majority of oncology drug candidates entering clinical trials fail, often due to a ...

Generation of 3D Tumor Spheroids for Drug Evaluation Studies

In recent decades, in addition to monolayer-cultured cells, three-dimensional tumor spheroids have been developed as a potentially powerful tool for the evaluation of anticancer drugs. However, the conventional culture methods lack the ability to manipulate the tumor spheroids in a homogeneous manner at the three-dimensional level. To address this limitation, in this paper, we present a convenient and effective method of constructing average-sized tumor spheroids. Additionally, we describe a method of image-based analysis using artificial intelligence-based analysis software that can scan the whole plate and obtain data on three-dimensional spheroids. Several parameters were studied. By using a standard method of tumor spheroid construction and a high-throughput imaging and analysis system, the effectiveness and accuracy of drug tests performed on three-dimensional spheroids can be dramatically increased.

This article demonstrates a standardized method for constructing three-dimensional tumor spheroids. A strategy for spheroid observation and image-based deep-learning analysis using an automated imaging system is also described.

توليد كرويات الورم 3D لدراسات تقييم المخدرات

In recent decades, in addition to monolayer-cultured cells, three-dimensional tumor spheroids have been developed as a potentially powerful tool for the ...

فحص على نطاق الجينوم لتحديد ومقارنة الأهداف العلاجية في الأورام

Genetic Profiling and Genome-Scale Dropout Screening to Identify Therapeutic Targets in Mouse Models of Malignant Peripheral Nerve Sheath Tumor

Malignant Peripheral Nerve Sheath Tumors (MPNSTs) are derived from Schwann cells or their precursors. In patients with the tumor susceptibility syndrome neurofibromatosis type 1 (NF1), MPNSTs are the most common malignancy and the leading cause of death. These rare and aggressive soft-tissue sarcomas offer a stark future, with 5-year disease-free survival rates of 34-60%. Treatment options for individuals with MPNSTs are disappointingly limited, with disfiguring surgery being the foremost treatment option. Many once-promising therapies such as tipifarnib, an inhibitor of Ras signaling, have failed clinically. Likewise, phase II clinical trials with erlotinib, which targets the epidermal growth factor (EFGR), and sorafenib, which targets the vascular endothelial growth factor receptor (VEGF), platelet-derived growth factor receptor (PDGF), and Raf, in combination with standard chemotherapy, have also failed to produce a response in patients. 
In recent years, functional genomic screening methods combined with genetic profiling of cancer cell lines have proven useful for identifying essential cytoplasmic signaling pathways and the development of target-specific therapies. In the case of rare tumor types, a variation of this approach known as cross-species comparative oncogenomics is increasingly being used to identify novel therapeutic targets. In cross-species comparative oncogenomics, genetic profiling and functional genomics are performed in genetically engineered mouse (GEM) models and the results are then validated in the rare human specimens and cell lines that are available. 
This paper describes how to identify candidate driver gene mutations in human and mouse MPNST cells using whole exome sequencing (WES). We then describe how to perform genome-scale shRNA screens to identify and compare critical signaling pathways in mouse and human MPNST cells and identify druggable targets in these pathways. These methodologies provide an effective approach to identifying new therapeutic targets in a variety of human cancer types.

تسليط الضوء على المؤلف: إيجاد أهداف علاجية جديدة لورم غمد الأعصاب المحيطية الخبيث من خلال شاشات shRNA على نطاق الجينوم 

We have developed a cross-species comparative oncogenomics approach utilizing genomic analyses and functional genomic screens to identify and compare therapeutic targets in tumors arising in genetically engineered mouse models and the corresponding human tumor type.

التنميط الجيني وفحص التسرب على نطاق الجينوم لتحديد الأهداف العلاجية في نماذج الفئران لورم غمد العصب المحيطي الخبيث

Malignant Peripheral Nerve Sheath Tumors (MPNSTs) are derived from Schwann cells or their precursors. In patients with the tumor susceptibility syndrome ...

الاستفادة من علم الجينوم وظيفية الفرز لتحديد أهداف المخدرات رواية يحتمل في الثقافات كروي الخلية السرطانية

Summary

Explore More Videos

PLAYLIST