Name: modified terminal restriction fragment analysis for quantifying telomere length using in-gel hybridization
Uploaded: 2017-07-10T10:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 29 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Modified Terminal Restriction Fragment Analysis for Quantifying Telomere Length Using In-gel Hybridization at JoVE.com

الكتاب تعترف بدعم من معهد جامعة بيتسبرغ للسرطان بيوبهافيورال الأورام مرفق مشترك التي يتم دعمها جزئيا من قبل جائزة P30CA047904.

<ol>
	<li>Herbert, B. S., Shay, J. W., Wright, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+telomeres+and+telomerase.">Analysis of telomeres and telomerase.</a> Curr Protoc Cell Biol. , 16 (2003).</li><li>Mender, I., Shay, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomere+Restriction+Fragment+(TRF)+Analysis.">Telomere Restriction Fragment (TRF) Analysis.</a> Bio Protoc. 5 (22), (2015).</li><li>Blackburn, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomeres+and+Telomerase:+The+Means+to+the+End+(Nobel+lecture).">Telomeres and Telomerase: The Means to the End (Nobel lecture).</a> Angew Chem Int Ed Engl. 49 (41), 7405-7421 (2010).</li><li>Greider, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomerase+Discovery:+The+Excitement+of+Putting+Together+Pieces+of+the+Puzzle+(Nobel+lecture).">Telomerase Discovery: The Excitement of Putting Together Pieces of the Puzzle (Nobel lecture).</a> Angew Chem Int Ed Engl. 49 (41), 7422-7439 (2010).</li><li>Szostak, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+Ends:+Just+the+Beginning+(Nobel+lecture).">DNA Ends: Just the Beginning (Nobel lecture).</a> Angew Chem Int Ed Engl. 49 (41), 7386-7404 (2010).</li><li>Watson, J. M., Riha, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomeres,+Aging,+and+Plants:+From+Weeds+to+Methuselah+-+A+Mini-Review.">Telomeres, Aging, and Plants: From Weeds to Methuselah - A Mini-Review.</a> Gerontology. 57 (2), 129-136 (2011).</li><li>Lu, W., Zhang, Y., Liu, D., Songyang, Z., Wan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomeres-Structure,+Function,+and+Regulation.">Telomeres-Structure, Function, and Regulation.</a> Exp Cell Res. 319 (2), 133-141 (2013).</li><li>MacNeil, D. E., Bensoussan, H. J., Autexier, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomerase+Regulation+from+Beginning+to+the+End.">Telomerase Regulation from Beginning to the End.</a> Genes (Basel). 7 (9), 64 (2016).</li><li>Fouquerel, E., Opresko, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Convergence+of+The+Nobel+Fields+of+Telomere+Biology+and+DNA+Repair.">Convergence of The Nobel Fields of Telomere Biology and DNA Repair.</a> Photochem Photobiol. , (2016).</li><li>Bernadotte, A., Mikhelson, V. M., Spivak, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Markers+of+Cellular+Senescence.+Telomere+Shortening+as+a+Marker+of+Cellular+Senescence.">Markers of Cellular Senescence. Telomere Shortening as a Marker of Cellular Senescence.</a> Aging (Albany NY). 8 (1), 3-11 (2016).</li><li>Opresko, P. L., Shay, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomere-Associated+Aging+Disorders.">Telomere-Associated Aging Disorders.</a> Ageing Res Rev. , 1568-1637 (2016).</li><li>Chiodi, I., Mondello, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomere+and+Telomerase+Stability+in+Human+Diseases+and+Cancer.">Telomere and Telomerase Stability in Human Diseases and Cancer.</a> Front Biosci (Landmark Ed). 1 (21), 203-224 (2016).</li><li>Blackburn, E. H., Epel, E. S., Lin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Telomere+Biology:+A+Contributory+and+Interactive+Factor+in+Aging,+Disease+Risks,+and+Protection.">Human Telomere Biology: A Contributory and Interactive Factor in Aging, Disease Risks, and Protection.</a> Science. 350 (6265), 1193-1198 (2015).</li><li>Lindqvist, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Psychiatric+Disorders+and+Leukocyte+Telomere+Length:+Underlying+Mechanisms+Linking+Mental+Illness+with+Cellular+Aging.">Psychiatric Disorders and Leukocyte Telomere Length: Underlying Mechanisms Linking Mental Illness with Cellular Aging.</a> Neurosci Biobehav Rev. 55, 333-364 (2015).</li><li>Bodelon, C., Savage, S. A., Gadalla, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomeres+in+Molecular+Epidemiology+Studies.">Telomeres in Molecular Epidemiology Studies.</a> Prog Mol Biol Transl Sci. 125 (113), (2014).</li><li>Kimura, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+telomere+length+by+the+Southern+blot+analysis+of+terminal+restriction+fragment+lengths.">Measurement of telomere length by the Southern blot analysis of terminal restriction fragment lengths.</a> Nat Protoc. 5 (9), 1596-1607 (2010).</li><li>Haussmann, M. F., Mauck, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TECHNICAL+ADVANCES:+New+strategies+for+telomere-based+age+estimation.">TECHNICAL ADVANCES: New strategies for telomere-based age estimation.</a> Mol Ecol Resour. 8 (2), 264-274 (2008).</li><li>Nussey, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+telomere+length+and+telomere+dynamics+in+evolutionary+biology+and+ecology.">Measuring telomere length and telomere dynamics in evolutionary biology and ecology.</a> Methods Ecol Evol. 5 (4), 299-310 (2014).</li><li>Delany, M. E., Krupkin, A. B., Miller, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+of+telomere+sequences+in+birds:+evidence+for+arrays+of+extreme+length+and+for+in+vivo+shortening.">Organization of telomere sequences in birds: evidence for arrays of extreme length and for in vivo shortening.</a> Cytogenet Cell Genet. 90 (1-2), 139-145 (2000).</li><li>Baerlocher, G. M., Vulto, I., de Jong, G., Lansdorp, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry+and+FISH+to+measure+the+average+length+of+telomeres+(flow+FISH).">Flow cytometry and FISH to measure the average length of telomeres (flow FISH).</a> Nat Protoc. 1 (5), 2365-2376 (2006).</li><li>Sanders, J. L., Newman, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomere+length+in+epidemiology:+a+biomarker+of+aging,+age-related+disease,+both,+or+neither.">Telomere length in epidemiology: a biomarker of aging, age-related disease, both, or neither.</a> Epidemiol Rev. 35, 112-131 (2013).</li><li>Parikh, D., Fouquerel, E., Murphy, C. T., Wang, H., Opresko, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomeres+are+partly+shielded+from+ultraviolet-induced+damage+and+proficient+for+nucleotide+excision+repair+of+photoproducts.">Telomeres are partly shielded from ultraviolet-induced damage and proficient for nucleotide excision repair of photoproducts.</a> Nat Commun. 6, 8214 (2015).</li></ol>

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

بعد الكهربائي، تشويه الحمض النووي الجيني أعلى من 800 بي بي. يمكن أن يحدث هذا إذا كانت إنزيمات التقييد خاطئة أو إذا كانت هناك حاجة لإنزيمات إضافية (كما هو موضح أعلاه). وهناك تفسير آخر محتمل هو أن البروتين لا يزال تعلق على الحمض النووي. عند تحديد تركيز الحمض النووي من قبل ا...

تيلوميرس، وتقع في نهايات الكروموسومات، وتكرر النيوكليوتيدات من تسلسل تغغ (على الكروموسومات البشرية) التي تلعب دورا حاسما في حماية المعلومات الوراثية الخلوية 3 ، 4 ، 5 . التيلوميرات هي عدة آلاف من أزواج قاعدة في الطول وتعمل على حماية سلامة بقية الكروموسوم خلال تكرار الحمض النووي. النسخ المتماثل من الكروموسومات ليست مثالية مما أدى إلى الغايات من الكروموسوم لا يتم نسخ تماما. ويسمى هذا عدم الكفاءة في تكرار &quot;مشكلة تكرار نهاية&quot; ويؤدي إلى فقدان بعض تيلومير يكرر خلال كل جولة من النسخ المتماثل 6 ، 7 . يمكن استعادة طول تيلومير بعد انقسام الخلايا عن طريق تيلوميراز، وهو انزيم الذي يحل محل تسلسل تيلومير المفقودة 8 ، 9 . ومع ذلك، التيلوميراز ليس كذلكتنشيطها في معظم الخلايا الجسدية البشرية ونتيجة لذلك، مع مرور الوقت، سوف تلوميرس تقصير، مما أدى في النهاية إلى الشيخوخة الخلوية 10 . نظرا لتقصير التيلومير، تعتبر التيلوميرات علامة بيولوجية للشيخوخة وخطر الأمراض المرتبطة بالعمر 11 ، 12 . بالإضافة إلى ذلك، يمكن أن تتأثر طول تيلومير من العوامل الوراثية والبيئية، ونمط الحياة وغيرها من المحفزات مثل الإجهاد التأكسدي، مشيرا إلى أن طول تيلومير يمكن أن تلعب دورا كعلامة بيولوجية في الدراسات السمية والوبائية والسلوكية 13 ، 14 ، 15 . توضح هذه المقالة تقنية لقياس طول التيلومير باستخدام تحليل مقطعي طرفية مقسم (ترف) تم تكييفه من مندر وشاي 2 وكيمورا وآخرون. 16 ، ومثل هربرت، شاي والريغهت 1 و هوسمان و موك 17 . تقليديا، تحليل ترف ينطوي على إجراء لطخة الجنوبية. وتعتبر البقع الجنوبية &quot;معيار الذهب&quot; لدراسة طول تيلومير وتستخدم بنشاط لدراسة طول الكريات البيض في دراسات علم الأوبئة 18 . يستخدم هذا التحليل ترف هضم الحمض النووي الجيني ترك وراء تيلومير يكرر. ثم يتم فصل شظايا الحمض النووي عن طريق الرحلان الكهربائي، والتشويه والتحويل إلى غشاء النيتروسليلوز. يتم تهجين متواليات التيلومير إلى مسبار قليل النوكليوتيد تيلومير. بدلا من نقل التيلوميرات فصل إلى غشاء، تقنيات ترف أخرى تستخدم في التهجين هلام تقنيات مع وبدون تمسخ الحمض النووي. إن إدراج التشوه مهم عند النظر في الكشف عن التيلوميرات الخلالية، التي تم الإبلاغ عنها في بعض الأنواع 19 . الإجراءات التي تفتقر إلى تغيير طبيعة الخطوات فقط كشف ثه واحد تقطعت بهم السبل الحمض النووي الذين تقطعت بهم السبل في تلوميرس الطرفية ولن ربط تسلسل تيلومير الخلالي 18 . إلى جانب تحليل ترف، وهناك العديد من التقنيات الأخرى لقياس طول تيلومير أن لكل منها مزاياها وعيوبها. تقنية تدفق فيش يمكن قياس متوسط ​​طول تيلومير من الخلايا الفردية من نوع خلية متميزة باستخدام التدفق الخلوي 16 ، 20 . في حين أنه يمكن أن علامة بدقة التيلوميرات مع تحقيقات محددة للغاية وتقليل الخطأ البشري من خلال الأتمتة، تدفق الأسماك هي مكلفة وأقل كفاءة ويتطلب عينات جديدة وفني ذو مهارات عالية، مما يحد من قدرتها على دراسات علم الأوبئة 16 . وبالإضافة إلى ذلك، هذه الطريقة لا تمثل التغيرات المحتملة في عدد الكروموسومات في عدد السكان الخلية. تقنية أخرى، قر، مقبولة على نطاق واسع كوسيلة لقياس طول تيلومير لدراسات علم الأوبئة <sup كلاس = &quot;كريف&quot;&gt; 16 بسبب إنتاجية عالية، منخفضة التكلفة ومتطلبات كميات صغيرة من الحمض النووي مقارنة مع أساليب أخرى. ومع ذلك، قر يمكن فقط قياس متوسط ​​محتوى الحمض النووي تيلوميريك نسبة إلى الجين نسخة واحدة، وبالتالي، تقدير غير مباشر لمتوسط ​​طول التيلومير. كما أنها تعطي معامل عال من التباين في دراسات المقارنة، مقارنة مع البقع الجنوبية، مما يؤدي إلى دقة مشكوك فيها 21 . الإجراء ترف له أوجه القصور الخاصة التي تحد من استخدامه لبعض الدراسات. تقنيات ترف تتطلب كمية كبيرة من الحمض النووي مقارنة مع أساليب أخرى (بين 2 و 3 ميكروغرام لكل عينة). وهذا يحد من تطبيقات التقنية لفحص طول تيلومير من العينات السريرية التي يمكن جمع الحمض النووي الجيني كافية، ولا يمكن استخدامها على عينات الحمض النووي المتدهورة. بالإضافة إلى ذلك، فإن تحليل ترف مكلف وكثيفة العمالة، والتي تتطلب 4-5 أيام لتحقيق نتائج. ومع ذلك، فإن ترف ينتج معامل انخفاض التباينمنح استنساخه. في حين أن هذا البروتوكول هو مختلف عن لطخة الجنوبية التقليدية (الاستفادة في الموقع التهجين هلام)، وتقنيات اثنين هي في الأساس نفسه. التقنية المعروضة هنا هي مزيج من لطخة الجنوبية وهجن في التهجين. ربط خطوة تغيير طبيعة الحمض النووي من البقع الجنوبية مع التهجين في هلام. هذا الجمع لديه فائدة إضافية من تحسين قوة إشارة التحقيق مقارنة مع لطخة الجنوبية، وقد أسفرت باستمرار نتائج قابلة للقياس داخل مختبرنا. بالإضافة إلى ذلك، فإن استخدام تحقيقات المشعة بدلا من تحقيقات تشيميلومينسنت يعطي كثافة إشارة أعلى ويسمح للتصور والتقدير الكمي مع فوسفهوريماجر، مما يجعل تحليلات ترف سهل الاستعمال.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Biologics&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rsa1, restriction enzyme</td><td>New England Biolabs, Inc</td><td>R0167S</td><td>10,000 U/mL, DNA digestion.&amp;nbsp; Comes with Cutsmart Buffer (digestion buffer)</td></tr><tr><td>Hinf1, restriction enzyme</td><td>New England Biolabs, Inc</td><td>R0155S</td><td>10,000 U/mL, DNA digestion.&amp;nbsp; Comes with Cutsmart Buffer (digestion buffer)</td></tr><tr><td>Seakem GTG Agarose</td><td>Lonza</td><td>50071</td><td>electrophoresis grade agarose</td></tr><tr><td>Optikinase&amp;nbsp;</td><td>affymetrix</td><td>78334X 500 UN</td><td>T4 Polynucleotide Kinase</td></tr><tr><td>SYBR Green Nucleic Acid Stain I</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>S7567</td><td>Syber Green</td></tr><tr><td>exactGene DNA Ladder 24- kB</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2580100</td><td></td></tr><tr><td>C-Strand Probe (3&#039;-(G3AT2)4-&#039;5)</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td></td><td>Custom ordered DNA oligonucleotide</td></tr><tr><td>Gamma-ATP-P32</td><td>Perkin Elmer</td><td>BLU502Z</td><td>Radioisotope</td></tr><tr><td>Qiagen Blood and Cell Culture DNA Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>13323</td><td>DNA extraction kit</td></tr><tr><td>GE Illustra Microspin G-25 column</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>27-5325-01</td><td>For purification of readioactive oligo probe</td></tr><tr><td>Ficoll 400</td><td></td><td></td><td>non-ionic synthetic polymer</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Equipment/Software&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Owl A5 Gel electrophoresis system (20 cm x 25 cm)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A5</td><td>Gel electrophoresis</td></tr><tr><td>Horizon 11.4 Gel electrophoresis system (11 cm x 14 cm)</td><td>Corel Life Sciences</td><td>11068020</td><td>Gel electrophoresis</td></tr><tr><td>Nylon mesh, 50, 12&quot; x 12&quot;</td><td>Ted Pellam, Inc</td><td>41-12105</td><td></td></tr><tr><td>GE Storage Phosphor Screens</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>28-9564-75</td><td></td></tr><tr><td>Phosphor Screen Exposure Cassette</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>63-0035-44</td><td></td></tr><tr><td>Isotemp Hybridzation Incubator</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-247-20Q</td><td></td></tr><tr><td>Cylindrical hybridization tubes</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-247-300</td><td></td></tr><tr><td>The Belly Dancer orbital shaker</td><td>Sigma-aldrich</td><td>Z768499-1EA</td><td>Orbital shaker</td></tr><tr><td>Typhoon 9400</td><td>ABI</td><td></td><td>For imaging of gels and phosphor screens</td></tr><tr><td>GraphPad Prism 6</td><td>GraphPad</td><td>Version 6.05</td><td>Graphing Program</td></tr><tr><td>Microsoft Excel</td><td>Microsoft</td><td>Office 365</td><td>Spreadsheet program</td></tr><tr><td>Nanodrop</td><td>Thermo Scientific</td><td>Nanodrp 2000</td><td>Spectrophotometer</td></tr></tbody></table>

modified terminal restriction fragment analysis for quantifying telomere length using in-gel hybridization

هناك العديد من التقنيات المختلفة لقياس طول التيلومير، ولكل منها مزاياها وعيوبها. يستخدم النهج التقليدي، تحليل تيلومير تقييد جزء (ترف)، تقنية التهجين الحمض النووي حيث يتم هضم عينات الحمض النووي الجيني مع الانزيمات تقييد، وترك وراءها تيلومير الحمض النووي يكرر وبعض الحمض النووي تيلوميري الفرعية. يتم فصل هذه عن طريق الكهربائي الاغاروز هلام، ونقلها إلى غشاء فلتر وهجين إلى تحقيقات قليل النوكليوتيد الموسومة مع إما التوهج أو النشاط الإشعاعي لتصور شظايا تقييد تيلومير. هذا النهج، في حين تتطلب كمية أكبر من الحمض النووي من التقنيات الأخرى مثل ير، يمكن قياس توزيع طول تيلومير من السكان من الخلايا ويسمح قياس أعرب في كيلوباسس المطلقة. توضح هذه المخطوطة إجراء تهجين الحمض النووي المعدل لتحديد طول تيلومير. يتم هضم الحمض النووي الجيني لأول مرة مع الانزيمات تقييد (التي لا قطعالتيلوميرات) وفصلها الكهربائي الاغاروز هلام. ثم يتم تجفيف الجل والحمض النووي هو التشويه والتحريف في الموقع إلى التحقيق أوليغونكلأوتيد راديولبلد. هذا التهجين في الموقع يتجنب فقدان الحمض النووي تيلومير ويحسن كثافة الإشارة. بعد التهجين، يتم تصوير المواد الهلامية باستخدام شاشات الفوسفور ويتم قياس طول تيلومير باستخدام برنامج الرسوم البيانية. وقد تم تطوير هذا الإجراء من قبل مختبرات الدكاترة. وودرينغ رايت وجيري شي في جامعة تكساس جنوب غرب 1 ، 2 . هنا، نقدم وصفا مفصلا لهذا الإجراء، مع بعض التعديلات.

تم تحليل ثلاثة تركيزات من الحمض النووي (1، 2 و 3 ميكروغرام) معزولة عن خط الخلية بج-هتير (تيلوميراز خلد الخلايا الليفية القلفة البشرية) 22 والبشري خلايا الدم وحيدات النوى البشرية (بمكس) لطول تيلومير. ويبين الجدول 1 تخصيصات حارة لكل ع...

Watch this Scientific Journal Video about Modified Terminal Restriction Fragment Analysis for Quantifying Telomere Length Using In-gel Hybridization at JoVE.com

Modified Terminal Restriction Fragment Analysis for Quantifying Telomere Length Using In-gel Hybridization

في هذه المقالة، ويناقش بروتوكول مفصل لقياس طول تيلومير باستخدام تعديل جزء طرفية تحليل جزء الذي يوفر قياسا سريعا وفعالا مباشرة من طول تيلومير. ويمكن تطبيق هذه التقنية على مجموعة متنوعة من مصادر الخلايا من الحمض النووي لقياس طول تيلومير.

تعديل محطة الطرفية تقييد جزء تحليل لقياس طول تيلومير باستخدام التهجين في هلام

There are several different techniques for measuring telomere length, each with their own advantages and disadvantages. The traditional approach, Telomere ...

modified-terminal-restriction-fragment-analysis-for-quantifying

Research

JoVE Journal

Cancer Research

12.8K Views.  University of Pittsburgh.  في هذه المقالة، ويناقش بروتوكول مفصل لقياس طول تيلومير باستخدام تعديل جزء طرفية تحليل جزء الذي يوفر قياسا سريعا وفعالا مباشرة من طول تيلومير. ويمكن تطبيق هذه التقنية على مجموعة متنوعة من مصادر الخلايا من الحمض النووي لقياس طول تيلومير. 

Video: Modified Terminal Restriction Fragment Analysis for Quantifying Telomere Length Using In-gel Hybridization

Examination of the Telomere G-overhang Structure in Trypanosoma brucei

The telomere G-overhang structure has been identified in many eukaryotes including yeast, vertebrates, and Trypanosoma brucei. It serves as the substrate for telomerase for de novo telomere DNA synthesis and is therefore important for telomere maintenance. T. brucei is a protozoan parasite that causes sleeping sickness in humans and nagana in cattle. Once infected mammalian host, T. brucei cell regularly switches its surface antigen to evade the host's immune attack. We have recently demonstrated that the T. brucei telomere structure plays an essential role in regulation of surface antigen gene expression, which is critical for T. brucei pathogenesis. However, T. brucei telomere structure has not been extensively studied due to the limitation of methods for analysis of this specialized structure. We have now successfully adopted the native in-gel hybridization and ligation-mediated primer extension methods for examination of the telomere G-overhang structure and an adaptor ligation method for determination of the telomere terminal nucleotide in T. brucei cells. Here, we will describe the protocols in detail and compare their different advantages and limitations.

Examination of the Telomere G-overhang Structure in Trypanosoma brucei

Telomeres are essential for chromosome stability and the telomere G-overhang structure is essential for telomerase-mediated telomere maintenance. We have recently adopted two methods for detecting the telomere G-overhang structure in Trypanosoma brucei, which are native in-gel hybridization and ligation-mediated primer extension, which will be described.

النظر في هيكل G - المتراكمة في التيلومير المثقبية البروسية</em

The telomere G-overhang structure has been identified in many eukaryotes including yeast, vertebrates, and Trypanosoma brucei. It serves as the substrate ...

Immunology and Infection

Laparoscopic Pancreatoduodenectomy With Modified Blumgart Pancreaticojejunostomy

Minimally invasive pancreatic resections are technically demanding but rapidly increasing in popularity. In contrast to laparoscopic distal pancreatectomy, laparoscopic pancreatoduodenectomy (LPD) has not yet obtained wide acceptance, probably due to technical challenges, especially regarding the pancreatic anastomosis.
The study describes and demonstrates all steps of LPD, including the modified Blumgart pancreaticojejunostomy. Indications for LPD are all pancreatic and peri-ampullary tumors without vascular involvement. Relative contra-indications are body mass index &#62;35 kg/m2, chronic pancreatitis, mid-cholangiocarcinomas and large duodenal cancers.
The patient is in French position, 6 trocars are placed, and dissection is performed using an (articulating) sealing device. A modified Blumgart end-to-side pancreaticojejunostomy is performed with 4 large needles (3/0) barbed trans-pancreatic sutures and 4 to 6 duct-to-mucosa sutures using 5/0 absorbable multifilament combined with a 12 cm, 6 or 8 Fr internal stent using 3D laparoscopy. Two surgical drains are placed alongside the pancreaticojejunostomy.
The described technique for LPD including a modified Blumgart pancreatico-jejunostomy is well standardized, and its merits are currently studied in the randomized controlled multicenter trial. This complex operation should be performed at high-volume centers where surgeons have extensive experience in both open pancreatic surgery and advanced laparoscopic gastro-intestinal surgery.

Laparoscopic pancreatoduodenctomy (LPD) may offer advantages over open pancreatoduodenectomy, including early postoperative mobilization, less delayed gastric emptying and a shorter hospital stay. However, LPD is technically challenging and not well-standardized, especially regarding the pancreatic anastomosis. We describe a standardized technique for the pancreatic anastomosis during LPD: modified Blumgart pancreaticojejunostomy.

بانكرياتودودينكتومي المنظار مع تعديل بلومجارت بانكريتيكوجيجونوستومي

Minimally invasive pancreatic resections are technically demanding but rapidly increasing in popularity. In contrast to laparoscopic distal ...

Simple and Rapid Method to Obtain High-quality Tumor DNA from Clinical-pathological Specimens Using Touch Imprint Cytology

It is critical to determine the mutational status in cancer before administration and treatment of specific molecular targeted drugs for cancer patients. In the clinical setting, formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissues are widely used for genetic testing. However, FFPE DNA is generally damaged and fragmented during the fixation process with formalin. Therefore, FFPE DNA is sometimes not adequate for genetic testing because of low quality and quantity of DNA. Here we present a method of touch imprint cytology (TIC) to obtain genomic DNA from cancer cells, which can be observed under a microscope. Cell morphology and cancer cell numbers can be evaluated using TIC specimens. Furthermore, the extraction of genomic DNA from TIC samples can be completed within two days. The total amount and quality of TIC DNA obtained using this method was higher than that of FFPE DNA. This rapid and simple method allows researchers to obtain high-quality DNA for genetic testing (e.g., next generation sequencing analysis, digital PCR, and quantitative real time PCR) and to shorten the turnaround time for reporting results.

Obtaining high-quality genomic DNA from tumor tissues is an essential first step for analyzing genetic alterations using next generation sequencing. In this article, we present a simple and rapid method to enrich tumor cells and obtain intact DNA from touch imprint cytology specimens.

طريقة بسيطة وسريعة للحصول على جودة عالية الورم الحمض النووي من العينات السريرية المرضية باستخدام جهائز بصمة اللمس

It is critical to determine the mutational status in cancer before administration and treatment of specific molecular targeted drugs for cancer patients. ...

Generation of Cancer Cell Clones to Visualize Telomeric Repeat-containing RNA TERRA Expressed from a Single Telomere in Living Cells

Telomeres are transcribed, giving rise to telomeric repeat-containing long noncoding RNAs (TERRA), which have been proposed to play important roles in telomere biology, including heterochromatin formation and telomere length homeostasis. Recent findings revealed that TERRA molecules also interact with internal chromosomal regions to regulate gene expression in mouse embryonic stem (ES) cells. In line with this evidence, RNA fluorescence in situ hybridization (RNA-FISH) analyses have shown that only a subset of TERRA transcripts localize at chromosome ends. A better understanding of the dynamics of TERRA molecules will help define their function and mechanisms of action. Here, we describe a method to label and visualize single-telomere TERRA transcripts in cancer cells using the MS2-GFP system. To this aim, we present a protocol to generate stable clones, using the AGS human stomach cancer cell line, containing MS2 sequences integrated at a single subtelomere. Transcription of TERRA from the MS2-tagged telomere results in the expression of MS2-tagged TERRA molecules that are visualized by live-cell fluorescence microscopy upon co-expression of a MS2 RNA-binding protein fused to GFP (MS2-GFP). This approach enables researchers to study the dynamics of single-telomere TERRA molecules in cancer cells, and it can be applied to other cell lines.

Here, we present a protocol to generate cancer cell clones containing a MS2 sequence tag at a single subtelomere. This approach, relying on the MS2-GFP system, enables visualization of the endogenous transcripts of telomeric repeat-containing RNA (TERRA) expressed from a single telomere in living cells.

جيل من سرطان الخلية استنساخ لتصور تيلوميريك التي تحتوي على تكرار الحمض النووي الريبي تيرا أعرب من Telomere واحدة في الخلايا الحية

Telomeres are transcribed, giving rise to telomeric repeat-containing long noncoding RNAs (TERRA), which have been proposed to play important roles in ...

Genetics

Droplet Digital TRAP (ddTRAP): Adaptation of the Telomere Repeat Amplification Protocol to Droplet Digital Polymerase Chain Reaction

The telomere repeat amplification protocol (TRAP) is the most widely used assay to detect telomerase activity within a given a sample. The polymerase chain reaction (PCR)-based method allows for robust measurements of enzyme activity from most cell lysates. The gel-based TRAP with fluorescently labeled primers limits sample throughput, and the ability to detect differences in samples is restricted to two fold or greater changes in enzyme activity. The droplet digital TRAP, ddTRAP, is a highly sensitive approach that has been modified from the traditional TRAP assay, enabling the user to perform a robust analysis on 96 samples per run and obtain absolute quantification of the DNA (telomerase extension products) input within each PCR. Therefore, the newly developed ddTRAP assay overcomes the limitations of the traditional gel-based TRAP assay and provides a more efficient, accurate, and quantitative approach to measuring telomerase activity within laboratory and clinical settings.

Droplet Digital TRAP ddTRAP: Adaptation of the Telomere Repeat Amplification Protocol to Droplet Digital Polymerase Chain Reaction

We successfully converted the standard telomere repeat amplification protocol (TRAP) assay to be employed in droplet digital polymerase chain reactions. This new assay, called ddTRAP, is more sensitive and quantitative, allowing for better detection and statistical analysis of telomerase activity within various human cells.

المصيدة الرقمية الحبريه (ddTRAP): تكييف بروتوكول تضخيم التيتيمير المكرر إلى التفاعل المتسلسل الرقمي لسلسله البلمره

The telomere repeat amplification protocol (TRAP) is the most widely used assay to detect telomerase activity within a given a sample. The polymerase ...

<meta charset="utf8"></head><body>تقييم دقيق لطول التيلومير في الدراسات السكانية البشرية

Monochrome Multiplex Quantitative PCR Telomere Length Measurement

Telomeres are ribonucleoprotein structures at the end of all eukaryotic chromosomes that protect DNA from damage and preserve chromosome stability. Telomere length (TL) has been associated with various exposures, biological processes, and health outcomes. This article describes the monochrome multiplex quantitative polymerase chain reaction (MMqPCR) assay protocol routinely conducted in our laboratory for measuring relative mean TL from human DNA. There are several different PCR-based TL measurement methods, but the specific protocol for the MMqPCR method presented in this publication is repeatable, efficient, cost-effective, and suitable&#160;for population-based studies. This detailed protocol outlines all information necessary for investigators to establish this assay in their laboratory. In addition, this protocol provides specific steps to increase the reproducibility of TL measurement by this assay, defined by the intraclass correlation coefficient (ICC) across repeated measurements of the same sample. The ICC is a critical factor in evaluating expected power for a specific study population; as such, reporting cohort-specific ICCs for any TL assay is a necessary step to enhance the overall rigor of population-based studies of TL. Example results utilizing DNA samples extracted from peripheral blood mononuclear cells demonstrate the feasibility of generating highly repeatable TL data using this MMqPCR protocol.

<meta charset="utf8"></head><body>تسليط الضوء على المؤلف: استكشاف تأثير الصدمة على الشيخوخة الخلوية

Here we present a protocol for the measurement of relative telomere length (TL) using the monochrome multiplex quantitative polymerase chain reaction (MMqPCR) assay. The MMqPCR assay is a repeatable, efficient, and cost-effective method for measuring TL from human DNA in population-based studies.

أحادي اللون متعدد الإرسال الكمي PCR قياس طول التيلومير 

Telomeres are ribonucleoprotein structures at the end of all eukaryotic chromosomes that protect DNA from damage and preserve chromosome stability. ...

قياس طول التيلومير باستخدام الكشف عن التلألؤ الكيميائي غير المشع

Optimization of Performance Parameters of the TAGGG Telomere Length Assay

Telomeres are repetitive sequences which are present at chromosomal ends; their shortening is a characteristic feature of human somatic cells. Shortening occurs due to a problem with end replication and the absence of the telomerase enzyme, which is responsible for maintaining telomere length. Interestingly, telomeres also shorten in response to various internal physiological processes, like oxidative stress and inflammation, which may be impacted due to extracellular agents like pollutants, infectious agents, nutrients, or radiation. Thus, telomere length serves as an excellent biomarker of aging and various physiological health parameters. The TAGGG telomere length assay kit is used to quantify average telomere lengths using the telomere restriction fragment (TRF) assay and is highly reproducible. However, it is an expensive method, and because of this, it is not employed routinely for large sample numbers. Here, we describe a detailed protocol for an optimized and cost-effective measurement of telomere length using Southern blots or TRF analysis and non-radioactive chemiluminescence-based detection.

تسليط الضوء على المؤلف: تحسين معلمات الأداء لمقايسة طول التيلومير TAGGG  

Here, we describe in detail the protocol for quantifying telomere length using non-radioactive chemiluminescent detection, with a focus on the optimization of various performance parameters of the TAGGG telomere length assay kit, such as buffer quantities and probe concentrations.

تحسين معلمات الأداء لمقايسة طول التيلومير TAGGG

Telomeres are repetitive sequences which are present at chromosomal ends; their shortening is a characteristic feature of human somatic cells. Shortening ...

تعديل محطة الطرفية تقييد جزء تحليل لقياس طول تيلومير باستخدام التهجين في هلام

Summary

Explore More Videos

PLAYLIST