هذا العمل وأيده في الجزء المشروع "تطوير البحوث الابتكارية" في علاجات السرطان (فالمباشر) (15cm0106102h0002، ك. م.) والمشروع لأبحاث السرطان والتطور العلاجي (ف إنشاء) (16 سم 01061150001، ك. م.) من الوكالة اليابانية للبحوث الطبية والتنمية، AMED؛ مؤسسة العلوم وتاكيدا (Y.M.)؛ منحة صندوق أبحاث السرطان الأميرة تاكاماتسو (13-24520، Y.M.)؛ وعدد المنح JSPS كاكينهي JP16K07133 (Y.M.).

<ol><li>Martinez, P., Blasco, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomeric+and+extra-telomeric+roles+for+telomerase+and+the+telomere-binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Telomeric and extra-telomeric roles for telomerase and the telomere-binding proteins.</a> Nat Rev Cancer. 11 (3), 161-176 (2011).</li>
<li>Nakamura, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomerase+catalytic+subunit+homologs+from+fission+yeast+and+human%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Telomerase catalytic subunit homologs from fission yeast and human.</a> Science. 277 (5328), 955-959 (1997).</li>
<li>Gillis, A. J., Schuller, A. P., Skordalakes, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+Tribolium+castaneum+telomerase+catalytic+subunit+TERT%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structure of the Tribolium castaneum telomerase catalytic subunit TERT.</a> Nature. 455 (7213), 633-637 (2008).</li>
<li>Salgado, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structure+of+an+RNAi+polymerase+links+RNA+silencing+and+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">The structure of an RNAi polymerase links RNA silencing and transcription.</a> PLoS Biol. 4 (12), e434(2006).</li>
<li>Castel, S. E., Martienssen, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+interference+in+the+nucleus%3A+roles+for+small+RNAs+in+transcription%2C+epigenetics+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">RNA interference in the nucleus: roles for small RNAs in transcription, epigenetics and beyond.</a> Nat Rev Genet. 14 (2), 100-112 (2013).</li>
<li>Sugiyama, T., Cam, H., Verdel, A., Moazed, D., Grewal, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-dependent+RNA+polymerase+is+an+essential+component+of+a+self-enforcing+loop+coupling+heterochromatin+assembly+to+siRNA+production%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">RNA-dependent RNA polymerase is an essential component of a self-enforcing loop coupling heterochromatin assembly to siRNA production.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (1), 152-157 (2005).</li>
<li>Maida, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+RNA-dependent+RNA+polymerase+formed+by+TERT+and+the+RMRP+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">An RNA-dependent RNA polymerase formed by TERT and the RMRP RNA.</a> Nature. 461 (7261), 230-235 (2009).</li>
<li>Maida, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+telomerase+reverse+transcriptase+in+heterochromatin+maintenance%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Involvement of telomerase reverse transcriptase in heterochromatin maintenance.</a> Mol Cell Biol. 34 (9), 1576-1593 (2014).</li>
<li>Maida, Y., Yasukawa, M., Masutomi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((De+Novo+RNA+Synthesis+by+RNA-Dependent+RNA+Polymerase+Activity+of+Telomerase+Reverse+Transcriptase%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">De Novo RNA Synthesis by RNA-Dependent RNA Polymerase Activity of Telomerase Reverse Transcriptase.</a> Mol Cell Biol. 36 (8), 1248-1259 (2016).</li>
<li>Okamoto, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintenance+of+tumor+initiating+cells+of+defined+genetic+composition+by+nucleostemin%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Maintenance of tumor initiating cells of defined genetic composition by nucleostemin.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (51), 20388-20393 (2011).</li>
<li>van Dijk, A. A., Makeyev, E. V., Bamford, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initiation+of+viral+RNA-dependent+RNA+polymerization%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Virol%22%5BJournal%5D)">Initiation of viral RNA-dependent RNA polymerization.</a> J Gen Virol. 85 (Pt 5), 1077-1093 (2004).</li>
</ol>

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

مقايسة RdRP الملكية الفكرية أسلوب حساسة للكشف عن النشاط RdRP من البشر ثالثي. وأعرب عن البروتين ثالثي هو الغاية في خلايا هيلا الانقسامية، التي تشكل مادة RdRP المعقدة8،،من910. وهذا يشير إلى أن خلايا هيلا الانقسامية مادة أمثل للكشف عن النشاط RdRP. في البروتوكول، المذكورة أعلاه، الانقسامية وغير متزامنة هيلا يتم تضمين الخلايا إيجابية، ومن الأمثلة سلبية، على التوالي. كما هو موضح في الشكل 1A، منتجات الإنزيم RdRP من قالب الحمض النووي الريبي الموصى بها في خلايا هيلا الانقسامية إظهار إشارات مشعة واسعة بين 20 إلى 30 nt. بالإضافة إلى خلايا هيلا، لدينا إجراء المقايسة مع أنواع مختلفة من خطوط الخلايا، ووجدت أنه لا يمكن تغيير نمط الإشارات في خلية مختلفة الأنواع9: تظهر بعض إشارة قوية فقط حوالي 30 nt، تظهر بعض نمط مماثل مع خلايا هيلا. ونحن أيضا بإجراء المقايسة مع قوالب الرنا خلاف 34 قالب nt8، قصيرة وطويلة (~ 300 nt) الكشف مع تسلسل مختلف، ونجاح الحصول على منتجات RdRP من تلك القوالب رغم أنه قد تكون هناك بعض التفضيل. في المحاكمة الأولى، ومع ذلك، نوصي باستخدام خلايا هيلا في المرحلة الانقسامية والقالب nt الحمض النووي الريبي 34. ردربس يمكن أن تولد الرنا المزدوج-الذين تقطعت بهم السبل في تعتمد على التمهيدي وفي طريقة مستقلة عن التمهيدي11. وقد أبلغنا أن ثالثي يحتفظ بهذه الخاصية البشرية RdRP7،9؛ يجمع ثالثي دسرنا من قالب الجيش الملكي النيبالي مع هيكل 3 '-foldback من خلال إليه فتيلة ظهر7. 34 قالب nt الجيش الملكي النيبالي، يجمع ثالثي خيوط التكميلية دون استخدام كبسولة تفجير9. على وجه التحديد الكشف عن منتجات RdRP توليفها بطريقة مستقلة عن التمهيدي، أي دي نوفو توليف الحمض النووي الريبي المنتجات، [α-32ف] NTP يمكن الاستعاضة عن [γ-32ف] NTP في رد فعل RdRP9.
علاج منسى ثالثي مجمعات محصنة في الخرز خطوة حاسمة لتحقيق النتائج المرجوة. إذا كان يتم تنفيذ معاملة مناسى طويل جداً أو بالهز مكثفة، منتجات RdRP ستقل ملحوظ. لتجنب هذه المتاعب، نوصي بشدة على التقيد البروتوكول بعناية. الحل HMD عامل حاسم آخر للنجاح. إذا كنت تجد أن الإشارات ضعيفة جداً، يحل محل حل HMD واحدة أعدت حديثا.
في جميع أنحاء البروتوكول، واحدة ينبغي إيلاء عناية كبيرة لتفادي التلوث رناسي. ينبغي أن تجري معاملة ribonuclease مع معدات مخصصة. بعد التلاعب في Ribonuclease، واحدة ينبغي تجاهل نصائح وأنابيب مع رناسي فورا، القضاء على رناسي مع الحل المتخصصة (مثل هادئة رناسي)، وتغيير بساتين.
ثالثي يتفاعل مع ترك ليس فقط ولكن أيضا العديد من أنواع الكشف الذاتية، وكنا قد ذكرت جزءا منها7. التعديل في مقايسة RdRP الملكية الفكرية، مثل المقايسة RdRP الملكية الفكرية دون علاج مناسى، ستوفر قائمة كاملة من قوالب الرنا الذاتية لدليل النشاط و bioinformatic RdRP المرتبطة بمادة على ملامحها التسلسل. ونحن قد طبقت بنجاح هذا البروتوكول للأنسجة ليستي. لأن هو أعرب ثالثي في مجموعة متنوعة من الأنسجة العادية والورم، هذا التحليل قد تكون مفيدة للتحقيق غير متعارف عليه وظيفة ثالثي الأنزيمي في الإنسان.

Telomerase البشرية عكس المنتسخة (ثالثي) المعروف جيدا كوحدة فرعية الحفاز من تيلوميراسي، وأنها الغضروفي telomere استخدام قالب الحمض النووي الريبي محددة1telomerase الجيش الملكي النيبالي المكون (ترك)،. على الرغم من أن مادة بوليميريزيس تيلوميريك الحمض النووي كعنصر من عناصر تيلوميراسي، التحليل الهيكلي والنشوء والتطور تشير إلى أن ثالثي ارتباطاً وثيقا مع الفيروسية تعتمد على الحمض النووي الريبي رنا بولمرس (ردربس)، فضلا عن المنتسخة العكسية الفيروسية، وتشاطر المجالات مع هذه بولمرس2،،من34. RdRP هو الإنزيم الذي يولد حبلا الحمض النووي الريبي مكملة لقالب الجيش الملكي النيبالي. يتم ترميز الإنزيم ليس فقط في الفيروسات ولكن أيضا في نموذج الكائنات، مثل النباتات والخميرة والدودة، وتوليف الحمض النووي الريبي مزدوج-الذين تقطعت بهم السبل التي RdRP يساهم في إسكات الجينات النسخي وبوستترانسكريبشونال في هذه الكائنات الحية5،6 . على الرغم من أن RdRP البشرية كانت مفقودة منذ فترة طويلة، نحن وجدنا نشاط RdRP ثالثي البشرية في 20097.
أولاً أكد RdRP نشاط ثالثي مع البروتين المؤتلف7، ثم أنشأت مقايسة حساسة في المختبر للكشف عن النشاط RdRP الذاتية ثالثي8. هنا، علينا أن نظهر في المختبر RdRP المقايسة (مقايسة الملكية الفكرية-RdRP) لمادة الذاتية. هذا الأسلوب يبدأ مع إيمونوبريسيبيتيشن (IP) من مادة الذاتية، وتبعتها في المختبر رد RdRP، التي تدمج ribonucleotides المشعة خيوط الحمض النووي الريبي الوليدة.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s modified Eagle&amp;rsquo;s medium (DMEM)</td><td>Wako</td><td>044-29765</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum (FBS)</td><td>CORNING</td><td>35-010-CV</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin mixed solution</td><td>nacalai tesque</td><td>26253-84</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-Ethylenediamenetetraacetic acid (EDTA) solution</td><td>nacalai tesque</td><td>32777-44</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate buffered saline (PBS(-))</td><td>Wako</td><td>166-23555</td><td></td></tr><tr><td>Thymidine</td><td>nacalai tesque</td><td>07147-61</td><td></td></tr><tr><td>Nocodazole</td><td>Sigma</td><td>M1404</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td><td>nacalai tesque</td><td>08904-85</td><td></td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td>nacalai tesque</td><td>31333-45</td><td></td></tr><tr><td>Tris(hydroxymethyl)aminomethane</td><td>nacalai tesque</td><td>35434-21</td><td></td></tr><tr><td>Hydrochloric acid</td><td>nacalai tesque</td><td>18321-05</td><td></td></tr><tr><td>Nonidet P-40 (NP-40)</td><td>nacalai tesque</td><td>25223-04</td><td></td></tr><tr><td>Pierce Protein A Plus Agarose</td><td>Thermo scientific</td><td>22812</td><td></td></tr><tr><td>2-[4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl]ethanesulfonic acid (HEPES)</td><td>nacalai tesque</td><td>17514-15</td><td></td></tr><tr><td>Potassium hydroxide</td><td>Wako</td><td>168-21815</td><td></td></tr><tr><td>Potassium acetate</td><td>nacalai tesque</td><td>28405-05</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2&amp;bull;6H2O)</td><td>Wako</td><td>135-00165</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>nacalai tesque</td><td>17045-65</td><td></td></tr><tr><td>Polyoxyethylene(10) octylphenyl ether (Triton X-100)</td><td>Wako</td><td>169-21105</td><td></td></tr><tr><td>cOmplete, EDTA-free</td><td>Roche Applied Science</td><td>11 873 580 001</td><td></td></tr><tr><td>Calcium chloride dihydrate (CaCl2&amp;bull;2H2O)</td><td>nacalai tesque</td><td>06731-05</td><td></td></tr><tr><td>Micrococcal nuclease (MNase)</td><td>Takara Bio</td><td>2910A</td><td></td></tr><tr><td>Ethylene glycol bis (b-aminoethylether)-N,N,N&#039;,N&#039;-tetraacetic acid (EGTA)</td><td>nacalai tesque</td><td>15214-92</td><td></td></tr><tr><td>3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonat (CHAPS)</td><td>nacalai tesque</td><td>07957-64</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td><td>nacalai tesque</td><td>14128-91</td><td></td></tr><tr><td>rCTP, rATP, rUTP, rGTP, 100mM each</td><td>Promega</td><td>E6000</td><td></td></tr><tr><td>[a-&lt;sup&gt;32&lt;/sup&gt;P]UTP (3,000 Ci/mmol)</td><td>PerkinElmer</td><td>NEG507H</td><td>Use fresh RI for the assay</td></tr><tr><td>RNase inhibitor</td><td>TOYOBO</td><td>SIN-201</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Takara</td><td>9033</td><td></td></tr><tr><td>Acid-Phenol:Chloroform, pH 4.5 (with IAA, 125:24:1)</td><td>Life Technologies</td><td>AM9720</td><td></td></tr><tr><td>3 M Sodium acetate</td><td>NIPPON GENE</td><td>316-90081</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol (99.5)</td><td>nacalai tesque</td><td>14713-95</td><td></td></tr><tr><td>Dr. GenTLE Precipitation Carrier</td><td>Takara Bio</td><td>9094</td><td></td></tr><tr><td>RNase One Ribonuclease</td><td>Promega</td><td>M4265</td><td></td></tr><tr><td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td><td>nacalai tesque</td><td>02873-75</td><td></td></tr><tr><td>Formamide, deionized</td><td>nacalai tesque</td><td>16345-65</td><td></td></tr><tr><td>Ethylenediaminetetraacetic Acid Disodium Salt Dihydrate (EDTA)</td><td>nacalai tesque</td><td>15130-95</td><td></td></tr><tr><td>Orange G</td><td>nacalai tesque</td><td>25401-22</td><td></td></tr><tr><td>CO2 incubator</td><td>e.g., ASTEC</td><td>SCA-325DRS</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>e.g., TOMY</td><td>EX-135</td><td>For step B)</td></tr><tr><td>Micro refrigerated centrifuge</td><td>e.g., KUBOTA</td><td>3740</td><td>For step 6.2</td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Qsonica</td><td>Q125</td><td>Set a microtip (#4422) on the sonicator, for step 6.4</td></tr><tr><td>Micro refrigerated centrifuge</td><td>e.g., TOMY</td><td>MX-305</td><td>For step 6.5</td></tr><tr><td>Cooled incubator</td><td>e.g., Panasonic</td><td>MIR-154-PJ</td><td>Set a rotary shaker inside</td></tr><tr><td>Rotary shaker</td><td>e.g., TAITEC</td><td>RT-5</td><td></td></tr><tr><td>Cooled incubator&amp;nbsp;</td><td>e.g., TAITEC</td><td>BR-43FL</td><td>Set a shaker &amp;ldquo;MINI WAVE&amp;rdquo; inside, for step 7.7</td></tr><tr><td>MINI WAVE</td><td>AS ONE</td><td>WEV-03</td><td>A shaker for steps 7.7, 8.5 and 8.6</td></tr><tr><td>Incubator</td><td>e.g., TAITEC</td><td>HB-80</td><td>Set a shaker &amp;ldquo;MINI WAVE&amp;rdquo; inside, for step 8.5 and 8.6</td></tr><tr><td>Block incubator</td><td>e.g., ASTEC</td><td>BI-516S</td><td></td></tr></tbody></table>

semi-quantitative detection of rna-dependent rna polymerase activity of human telomerase reverse transcriptase protein

Telomerase البشرية عكس المنتسخة (ثالثي) هو وحدة فرعية الحفاز من تيلوميراسي، وأنها الغضروفي telomere من خلال نشاط تعتمد على الحمض النووي الريبي بوليميراز الدنا. على الرغم من أن يدعى ثالثي المنتسخة العكسية، يثبت تحليلات الهيكلية والنشوء والتطور لمادة ثالثي عضو اليد اليمنى [بولمرس]، وتتصل الفيروسية تعتمد على الحمض النووي الريبي رنا بولمرس (ردربس) فضلا عن الفيروسية عكس المنتسخة. وقد حددنا أولاً RdRP نشاط ثالثي البشرية التي تولد رنا مكملة الوقوف إلى قالب غير الترميز الجيش الملكي النيبالي ويسهم في الجيش الملكي النيبالي إسكات في الخلايا السرطانية. لتحليل هذا النشاط الأنزيمي غير متعارف عليه، نحن نمواً الإنزيم RdRP مع ثالثي المؤتلف في عام 2009، وبعد ذلك أنشأت في المختبر بالانزيم RdRP ثالثي الذاتية. في هذه المخطوطة، يصف لنا طريقة الأخيرة. بإيجاز، مجمعات محصنة ثالثي المعزولة من الخلايا، والمحتضنة مع قالب الجيش الملكي النيبالي، ورنتبس بما في ذلك رنتب المشعة لرد فعل RdRP. للقضاء على الجيش الملكي النيبالي واحد-الذين تقطعت بهم السبل، تعامل نواتج التفاعل مع رناسي الأول، والمنتجات النهائية ويتم تحليل مع جل polyacrylamide التفريد. ويمكن الكشف عن راديولابيليد RdRP المنتجات التي أوتوراديوجرافي بعد التعرض بين عشية وضحاها.

مع قالب الحمض النووي الريبي الموصى بها، لوحظت المنتجات RdRP المشعة بين 20 إلى 30 النيوكليوتيدات (nt) على وجه التحديد في خلايا هيلا في المرحلة الانقسامية بعد التعرض بين عشية وضحاها (الشكل 1A). نموذجياً، يوضح كثافة إشارة من المنتجات RdRP اثنين من قمم المتوضعة حوالي 25 nt و 30 nt بما يتفق مع حجم توزيع المنتجات التي أكدتها تسلسل الجيل القادم9. على النقيض من الخلايا الانقسامية، إظهار خلايا هيلا دون التزامن تقريبا غياب المنتجات المشعة nt 20 – 30. إشارات البيضاوي، التي توضع تحت 20 nt في جميع العينات هي الانجرافات غير محدد.
في حالة أن هناك فقط منتج nt ~ 30 مع إشارة ضعيفة في خلايا هيلا الانقسامية، فإنه يشير إلى أن رد فعل RdRP لم يذهب جيدا. على سبيل المثال، إذا كان يتم تنفيذ المعاملة منسى تقريبا وغير لائق، كثافة إشارة في هيلا الانقسامية الخلايا يقلل إلى حد كبير (الشكل 1B). رد فعل RdRP يؤديها مع الحل HMD القديم يقلل أيضا من المنتجات (الشكل 1).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57021/57021fig1.jpg"> الشكل 1 : منتجات RdRP ممثل ثالثي الذاتية في الانقسامية هيلا الخلايا. معالجة نتائج المقايسة RdRP الملكية الفكرية في خلايا هيلا الممثل ثلاثة (A) مع نوكودازولي (التلاعب) أو [دمس] (unmanipulated). 34 مركباً كيميائيا nt الرنا كقالب. (ب) الملكية الفكرية-RdRP الإنزيم في خلايا هيلا الانقسامية يؤديها مع منسى معاملة غير لائقة. (ج) الملكية الفكرية-RdRP الإنزيم في خلايا هيلا الانقسامية يؤديها مع الحل HMD أما جديدة أو قديمة. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57021/57021fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>الكواشف</td>
			<td>وحدة التخزين</td>
		</tr>
<tr>
<td>ميكروكوككال نوكلاس، 20 ش/ميليلتر</td>
			<td>1 ميليلتر</td>
		</tr>
<tr>
<td>المخزن المؤقت نوكلاس ميكروكوككال، 10 x</td>
			<td>ميليلتر 8</td>
		</tr>
<tr>
<td>المياه خالية من رناسي</td>
			<td>ميليلتر 51</td>
		</tr>
</tbody></table>الجدول 1: منسى رد فعل المزيج المكون.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>الكواشف</td>
			<td>وحدة التخزين</td>
		</tr>
<tr>
<td>الفصول، 0.07% (wt/المجلد)</td>
			<td>ميليلتر 6</td>
		</tr>
<tr>
<td>الحل HMD</td>
			<td>2 ميليلتر</td>
		</tr>
<tr>
<td>rATP، 80 مم</td>
			<td>0.5 ميليلتر</td>
		</tr>
<tr>
<td>رجتب، 8 مم</td>
			<td>1 ميليلتر</td>
		</tr>
<tr>
<td>راتب، 0.4 مم</td>
			<td>1 ميليلتر</td>
		</tr>
<tr>
<td>ركتب، 8 مم</td>
			<td>1 ميليلتر</td>
		</tr>
<tr>
<td>رناسي المانع، 40 ش/ميليلتر</td>
			<td>0.5 ميليلتر</td>
		</tr>
<tr>
<td>المياه خالية من رناسي</td>
			<td>1 ميليلتر</td>
		</tr>
</tbody></table>الجدول 2: RdRP رد فعل المزيج المكون.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>الكواشف</td>
			<td>وحدة التخزين</td>
		</tr>
<tr>
<td>Ribonuclease رناسي واحد، يو 10/ميليلتر</td>
			<td>ميليلتر 0.2</td>
		</tr>
<tr>
<td>رد فعل المخزن المؤقت, 10 x</td>
			<td>20 ميليلتر</td>
		</tr>
<tr>
<td>المياه خالية من رناسي</td>
			<td>159.8 ميليلتر</td>
		</tr>
</tbody></table>الجدول 3: Ribonuclease رد فعل المزيج المكون.

Watch this Scientific Journal Video about Semi-quantitative Detection of RNA-dependent RNA Polymerase Activity of Human Telomerase Reverse Transcriptase Protein at JoVE.com

Semi-quantitative Detection of RNA-dependent RNA Polymerase Activity of Human Telomerase Reverse Transcriptase Protein

كشف شبه كمي النشاط المعتمدة على الحمض النووي الريبي بوليميراز الحمض النووي الريبي للبروتين البشري Telomerase المنتسخة العكسية

Telomerase البشرية عكس المنتسخة (ثالثي) توليف الحمض النووي تيلوميريك ليس فقط، بل أيضا الحمض النووي الريبي مزدوج-الذين تقطعت بهم السبل من خلال نشاط تعتمد على الحمض النووي الريبي بوليميراز الرنا. وهنا يصف لنا مقايسة المنشأة حديثا للكشف عن نشاط تعتمد على الحمض النووي الريبي بوليميراز الرنا ثالثي الذاتية.

Human telomerase reverse transcriptase (TERT) is the catalytic subunit of telomerase, and it elongates telomere through RNA-dependent DNA polymerase ...

semi-quantitative-detection-rna-dependent-rna-polymerase-activity

Research

JoVE Journal

Genetics

9.8K Views.  National Cancer Center Research Institute. Telomerase البشرية عكس المنتسخة (ثالثي) توليف الحمض النووي تيلوميريك ليس فقط، بل أيضا الحمض النووي الريبي مزدوج-الذين تقطعت بهم السبل من خلال نشاط تعتمد على الحمض النووي الريبي بوليميراز الرنا. وهنا يصف لنا مقايسة المنشأة حديثا للكشف عن نشاط تعتمد على الحمض النووي ا?...

Video: Semi-quantitative Detection of RNA-dependent RNA Polymerase Activity of Human Telomerase Reverse Transcriptase Protein

An In Vitro Assay to Detect tRNA-Isopentenyl Transferase Activity

N6-isopentenyladenosine RNA modifications are functionally diverse and highly conserved among prokaryotes and eukaryotes. One of the most highly conserved N6-isopentenyladenosine modifications occurs at the A37 position in a subset of tRNAs. This modification improves translation efficiency and fidelity by increasing the affinity of the tRNA for the ribosome. Mutation of enzymes responsible for this modification in eukaryotes are associated with several disease states, including mitochondrial dysfunction and cancer. Therefore, understanding the substrate specificity and biochemical activities of these enzymes is important for understanding of normal and pathologic eukaryotic biology. A diverse array of methods has been employed to characterize i6A modifications. Herein is described a direct approach for the detection of isopentenylation by Mod5. This method utilizes incubation of RNAs with a recombinant isopentenyl transferase, followed by RNase T1 digestion, and 1-dimensional gel electrophoresis analysis to detect i6A modifications. In addition, the potential adaptability of this protocol to characterize other RNA-modifying enzymes is discussed.

An In Vitro Assay to Detect tRNA-Isopentenyl Transferase Activity

Here, we describe a protocol for the biochemical characterization of the yeast RNA-modifying enzyme, Mod5, and discuss how this protocol could be applied to other RNA-modifying enzymes.

تحليل في المختبر للكشف عن النشاط ترانسفيراز إيسوبينتينيل الحمض الريبي النووي النقال

N6-isopentenyladenosine RNA modifications are functionally diverse and highly conserved among prokaryotes and eukaryotes. One of the most highly conserved ...

Biochemistry

Droplet Digital TRAP (ddTRAP): Adaptation of the Telomere Repeat Amplification Protocol to Droplet Digital Polymerase Chain Reaction

The telomere repeat amplification protocol (TRAP) is the most widely used assay to detect telomerase activity within a given a sample. The polymerase chain reaction (PCR)-based method allows for robust measurements of enzyme activity from most cell lysates. The gel-based TRAP with fluorescently labeled primers limits sample throughput, and the ability to detect differences in samples is restricted to two fold or greater changes in enzyme activity. The droplet digital TRAP, ddTRAP, is a highly sensitive approach that has been modified from the traditional TRAP assay, enabling the user to perform a robust analysis on 96 samples per run and obtain absolute quantification of the DNA (telomerase extension products) input within each PCR. Therefore, the newly developed ddTRAP assay overcomes the limitations of the traditional gel-based TRAP assay and provides a more efficient, accurate, and quantitative approach to measuring telomerase activity within laboratory and clinical settings.

Droplet Digital TRAP ddTRAP: Adaptation of the Telomere Repeat Amplification Protocol to Droplet Digital Polymerase Chain Reaction

We successfully converted the standard telomere repeat amplification protocol (TRAP) assay to be employed in droplet digital polymerase chain reactions. This new assay, called ddTRAP, is more sensitive and quantitative, allowing for better detection and statistical analysis of telomerase activity within various human cells.

المصيدة الرقمية الحبريه (ddTRAP): تكييف بروتوكول تضخيم التيتيمير المكرر إلى التفاعل المتسلسل الرقمي لسلسله البلمره

The telomere repeat amplification protocol (TRAP) is the most widely used assay to detect telomerase activity within a given a sample. The polymerase ...

Cancer Research

Detection of Tilapia Lake Virus Using Conventional RT-PCR and SYBR Green RT-qPCR

The aim of this method is to facilitate the fast, sensitive and specific detection of Tilapia Lake Virus (TiLV) in tilapia tissues. This protocol can be used as part of surveillance programs, biosecurity measures and in TiLV basic research laboratories. The gold standard of virus diagnostics typically involves virus isolation followed by complementary techniques such as reverse-transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) for further verification. This can be cumbersome, time-consuming and typically requires tissue samples heavily infected with virus. The use of RT-quantitative (q)PCR in the detection of viruses is advantageous because of its quantitative nature, high sensitivity, specificity, scalability and its rapid time to result. Here, the entire method of PCR based approaches for TiLV detection is described, from tilapia organ sectioning, total ribonucleic acid (RNA) extraction using a guanidium thiocyanate-phenol-chloroform solution, RNA quantification, followed by a two-step PCR protocol entailing, complementary deoxyribonucleic acid (cDNA) synthesis and detection of TiLV by either conventional PCR or quantitative identification via qPCR using SYBR green I dye. Conventional PCR requires post-PCR steps and will simply inform about the presence of the virus. The latter approach will allow for absolute quantification of TiLV down to as little as 2 copies and thus is exceptionally useful for TiLV diagnosis in sub-clinical cases. A detailed description of the two PCR approaches, representative results from two laboratories and a thorough discussion of the critical parameters of both have been included to ensure that researchers and diagnosticians find their most suitable and applicable method of TiLV detection.

This protocol diagnoses Tilapia Lake Virus (TiLV) in tilapia tissues using RT-PCR methodologies. The entire method is described from tissue dissection to total RNA extraction, followed by cDNA synthesis and detection of TiLV by either conventional PCR or quantitative PCR using dsDNA binding a fluorescent binding dye.

كشف البلطي بحيرة الفيروسات باستخدام التقليدية RT-PCR وسيبر الأخضر RT-قبكر

The aim of this method is to facilitate the fast, sensitive and specific detection of Tilapia Lake Virus (TiLV) in tilapia tissues. This protocol can be ...

Environment

Antibody-Free Assay for RNA Methyltransferase Activity Analysis

There are more than 100 chemically distinct modifications of RNA, two thirds of which consist of methylations. Interest in RNA modifications, and especially methylations, has re-emerged due to the important roles played by the enzymes that write and erase them in biological processes relevant to disease and cancer. Here, a sensitive in vitro assay for accurate analysis of RNA methylation writer activity on synthetic or in vitro transcribed RNAs is provided. This assay uses a tritiated form of S-adenosyl-methionine, resulting in direct labeling of methylated RNA with tritium. The low energy of tritium radiation makes the method safe, and pre-existing methods of tritium signal amplification, make it possible to quantify and to visualize the methylated RNA without the use of antibodies, which are commonly prone to artifacts. While this method is written for RNA methylation, few tweaks make it applicable to the study of other RNA modifications that can be radioactively labeled, such as RNA acetylation with 14C acetyl coenzyme A. Overall, this assay allows to quickly assess RNA methylation conditions, inhibition with small molecule inhibitors, or the effect of RNA or enzyme mutants, and provides a powerful tool to validate and expand results obtained in cells.

Here, an antibody-free in vitro assay for direct analysis of methyltransferase activity on synthetic or in vitro transcribed RNA is described.

فحص الأجسام المضادة الحرة لتحليل نشاط الحمض النووي الريبي ميثيل ترانسفيراز

There are more than 100 chemically distinct modifications of RNA, two thirds of which consist of methylations. Interest in RNA modifications, and ...

<meta charset="utf8"></head><body>تقييم دقيق لطول التيلومير في الدراسات السكانية البشرية

Monochrome Multiplex Quantitative PCR Telomere Length Measurement

Telomeres are ribonucleoprotein structures at the end of all eukaryotic chromosomes that protect DNA from damage and preserve chromosome stability. Telomere length (TL) has been associated with various exposures, biological processes, and health outcomes. This article describes the monochrome multiplex quantitative polymerase chain reaction (MMqPCR) assay protocol routinely conducted in our laboratory for measuring relative mean TL from human DNA. There are several different PCR-based TL measurement methods, but the specific protocol for the MMqPCR method presented in this publication is repeatable, efficient, cost-effective, and suitable&#160;for population-based studies. This detailed protocol outlines all information necessary for investigators to establish this assay in their laboratory. In addition, this protocol provides specific steps to increase the reproducibility of TL measurement by this assay, defined by the intraclass correlation coefficient (ICC) across repeated measurements of the same sample. The ICC is a critical factor in evaluating expected power for a specific study population; as such, reporting cohort-specific ICCs for any TL assay is a necessary step to enhance the overall rigor of population-based studies of TL. Example results utilizing DNA samples extracted from peripheral blood mononuclear cells demonstrate the feasibility of generating highly repeatable TL data using this MMqPCR protocol.

<meta charset="utf8"></head><body>تسليط الضوء على المؤلف: استكشاف تأثير الصدمة على الشيخوخة الخلوية

Here we present a protocol for the measurement of relative telomere length (TL) using the monochrome multiplex quantitative polymerase chain reaction (MMqPCR) assay. The MMqPCR assay is a repeatable, efficient, and cost-effective method for measuring TL from human DNA in population-based studies.

أحادي اللون متعدد الإرسال الكمي PCR قياس طول التيلومير 

Telomeres are ribonucleoprotein structures at the end of all eukaryotic chromosomes that protect DNA from damage and preserve chromosome stability. ...

قياس طول التيلومير باستخدام الكشف عن التلألؤ الكيميائي غير المشع

Optimization of Performance Parameters of the TAGGG Telomere Length Assay

Telomeres are repetitive sequences which are present at chromosomal ends; their shortening is a characteristic feature of human somatic cells. Shortening occurs due to a problem with end replication and the absence of the telomerase enzyme, which is responsible for maintaining telomere length. Interestingly, telomeres also shorten in response to various internal physiological processes, like oxidative stress and inflammation, which may be impacted due to extracellular agents like pollutants, infectious agents, nutrients, or radiation. Thus, telomere length serves as an excellent biomarker of aging and various physiological health parameters. The TAGGG telomere length assay kit is used to quantify average telomere lengths using the telomere restriction fragment (TRF) assay and is highly reproducible. However, it is an expensive method, and because of this, it is not employed routinely for large sample numbers. Here, we describe a detailed protocol for an optimized and cost-effective measurement of telomere length using Southern blots or TRF analysis and non-radioactive chemiluminescence-based detection.

تسليط الضوء على المؤلف: تحسين معلمات الأداء لمقايسة طول التيلومير TAGGG  

Here, we describe in detail the protocol for quantifying telomere length using non-radioactive chemiluminescent detection, with a focus on the optimization of various performance parameters of the TAGGG telomere length assay kit, such as buffer quantities and probe concentrations.

تحسين معلمات الأداء لمقايسة طول التيلومير TAGGG

Telomeres are repetitive sequences which are present at chromosomal ends; their shortening is a characteristic feature of human somatic cells. Shortening ...

كشف شبه كمي النشاط المعتمدة على الحمض النووي الريبي بوليميراز الحمض النووي الريبي للبروتين البشري Telomerase المنتسخة العكسية

Summary

Explore More Videos

PLAYLIST