يصف هذا البروتوكول طريقة التوصيف الجزيئي الشامل وغير المتحيز لعينة واحدة باستخدام كل من قياس الطيف الكتلي، باستخدام المستقلب، والبروتيوميات، وأنظمة التحليل الطيفي بالرنين المغناطيسي النووي. وتكمن أهمية هذا النهج في أنه يمكننا أن نميز نظامًا بيولوجيًا في اتجاه مجرى الجينوم، من خلال تحديد أنواع مختلفة من الجزيئات، مما يسمح لنا باستنتاج مسارات التمثيل الغذائي والتحلل. تقنية الاستخراج المتسلسلة، تسمح باستخراج المركبات القطبية القابلة للتوافر الحيوي باستخدام الماء، تليها MPLEx لالتقاط أي مركبات قطبية إضافية أو مستقلبات بالإضافة إلى البروتينات والدهون من عينة واحدة.
إن العرض التوضيحي البصري لهذه الطريقة أمر بالغ الأهمية لأنه يرشد العالم من خلال فصل الطبقات الثلاث خلال خطوة الاستخراج الثانية، وتقسيم المقتطفات بين أدوات تحليل مختلفة. إن التحليلات المتكاملة المتعددة الأطراف تمكن من إجراء تحقيقات أكثر فعالية وفهماً كاملاً للنظم البيولوجية المعقدة. هذه الطريقة القوية تستخرج تنوعاً واسعاً من الجزيئات وتنطبق على أنواع العينات المتنوعة.
ابدأ هذا الإجراء مع جمع وإعداد العينات كما هو موضح في بروتوكول النص. باستخدام الإيثانول غسلها، أواني الفولاذ المقاوم للصدأ، aliquot 50 ملليغرام من كل من العينات المجففة في أنابيب زجاجية ميليلتر الفردية. أضف ملليلتر واحد من الماء المقطر والمزيل الغاز إلى كل عينة.
ثم اِقم قارورة الزجاجة و هُزّت لمدة ساعتين على طاولة شاكر. جهاز طرد مركزي العينات في 15 ألف مرة الجاذبية لمدة 30 دقيقة. ثم تسمح للحلول بالوقوف في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة.
Decant وحفظ ناظر من كل عينة. إجراء استخراج MPLEx على المياه الآن استخراج المخلفات من خلال تكرار هذه الخطوات استخراج. باستثناء استبدال ناقص 20 درجة مئوية أربعة إلى ثلاثة كلوروفورم لخليط الميثانول للمياه المقطرة، دي الغاز.
فصل بعناية اثنين من طبقات المذيبات الناتجة، والتي سوف تكون مميزة بصريا من خلال إزالة الطبقة العليا عن طريق الأنابيب دقيق. جفف الطبقة السفلية غير القطبية في مجفف التجميد. بمجرد أن يجف، إضافة خمسة ميكرولترات من الكلوروفورم و 195 ميكرولترات من الميثانول إذا تحليل خلال اليومين المقبلين.
لتحسين كفاءة التأين الكهربائي لـ 4ier-transform Cyclotron الرنين الطيفي الكتلة الرنين، اختصار FTICR-MS عن طريق الحقن المباشر. تمييع استخراج الكلوروفورم واحد إلى واحد في الميثانول، واستخراج الماء اثنين إلى واحد في الميثانول. معايرة مطياف FTICR عن طريق حقن مباشرة 100 ميكرولترات من حل توليف، تمتد مجموعة كتلة من حوالي 100 إلى 1، 300 دالتون، في FTICR-MS.
حقن مباشر 100 ميكرولتردات من معيار Suwannee نهر فولفيك حمض إلى مصدر التأين الكهربائي. إلى جانب مطياف FTICR من خلال مضخة حقنة تعيين إلى معدل تدفق 3.0 ميكرولتررس في الدقيقة الواحدة. تعيين الجهد الإبرة إلى إيجابية 4.4 كيلوفولت.
قائمة الانتظار 1-100 كتلة إلى تهمة نسبة والشعيرات الدموية الزجاجية في 180 درجة مئوية. فحص الأطياف الناتجة باستخدام برنامج التحليل لتأكيد جودة البيانات. الآن، أدخل 100 ميكرولترات من كل استخراج عن طريق الحقن المباشر إلى مصدر التأين الكهربائي، إلى جانب مطياف FTICR من خلال مضخة حقنة تعيين إلى معدل تدفق 3.0 ميكرولترات في الدقيقة الواحدة.
تعيين المعلمات كما قبل. ضبط الوقت تراكم أيون لكل عينة أو مجموعة من العينات لحساب الاختلاف في تركيز الكربون. جمع 144 مسح لكل عينة، ومتوسط المسح الضوئي ومن ثم إجراء معايرة داخلية باستخدام سلسلة CH2 متماثل.
جفف المستخلصات باستخدام المكثف وحفظ ما تبقى من المستخلصات لقياس الطيف الكتلي الكتلي الكروماتوغرافيا الغازية اللاحقة، وقياس الطيف الكتلي اللوني السائل وتحليل الطيف بالرنين المغناطيسي النووي. للتحضير لـ GC-MS، قم أولاً بإعداد نماذج تحكم فارغة كما هو مفصل في بروتوكول النص. لحماية مجموعات كاربينول إضافة 20 ميكرولترات من 30 ملليغرام لكل ملليلتر ميثوكسيميني هيدروكلوريد في Paradyne إلى كل من العينات، بما في ذلك مستخلصات الميثانول، ومستخلصات المياه، والفراغات وعينات المعايرة FAME.
ختم قوارير مع قبعات. دوامة مقتطفات لمدة 20 ثانية، ثم سونيكات مقتطفات لمدة 60 ثانية. الطرد المركزي مقتطفات في 37 درجة مئوية لمدة 90 دقيقة في 100 مرة الجاذبية.
إضافة 80 ميكرولترات من MSTFA مع 1٪ ثلاثي يثيل كلوروسيلين لكل عينة. بعد دوامة و sonicating مقتطفات كما كان من قبل، الطرد المركزي مقتطفات مرة أخرى في 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة في 100 مرة الجاذبية. بعد استخراج التبريد إلى درجة حرارة الغرفة، ونقل إلى قوارير االampler GC-MS.
انتقل إلى تحليل GC-MS ومعالجة البيانات كما هو موضح في بروتوكول النص. للتحضير لتحليل NMR الحالة السائلة، تمييع ما تبقى من مستخلصات المياه بنسبة 10٪ مع معيار DSS DSS 5 ملليمتر. نقل الخليط إلى جودة عالية، ثلاثة ملليمتر الخارجي قطر بوروزيليكات زجاج أنابيب NMR.
انتقل إلى تحليل NMR ومعالجة البيانات كما هو موضح في بروتوكول النص. لإجراء تحليل الدهون LC-MS، حقن 10 ميكرولترات من كل استخراج في نظام كروماتوغرافيا سائل فائق الأداء، إلى جانب مطياف كتلة Orbitrap باستخدام عمود هجين سطحي مشحون للمرحلة المعكوسة. تعيين تدرج 34 دقيقة كما هو موضح في بروتوكول النص بمعدل تدفق 250 ميكرولترات في الدقيقة.
استخدام كل من وسائط التأين السلبية والإيجابية مع ارتفاع الطاقة تصادم انفصام والتفكيكي الناجم عن الاصطدام. لإجراء تحليل البروتيوميكس، استخراج البروتينات أولا وفقا لبروتوكول MPLEx لبقية مرحلة الميثانول كما هو مبين في بروتوكول النص. تمت مقارنة الخث مع العمق في مستنقع S1 في استجابة شجرة التنوب والأراضي الخث تحت بيئات متغيرة أو موقع SPRUCE في مينيسوتا ، الولايات المتحدة الأمريكية.
3, 312 تم تحديد الإنزيمات في تحليل البروتيوميكس. تحليل لأنشطة الانزيم مع العمق يكشف عن أن عدد الإنزيمات ينخفض بشكل حاد بين 15 سم و 45 سم في مستنقع SPRUCE. لإظهار كيف يمكن أن تختلف المواقع في أنشطة المستقلب والانزيم، يتم مقارنة نتائج SPRUCE لتلك التي من مستنقع و Fen في شمال السويد.
تم تحديد إجمالي 67, 040 مستقلبات في جميع عينات الخث SPRUCE من مزيج من تحليلات FTICR-MS و NMR و GC-MS و LC-MS. يظهر هنا هو الكسر النسبي للفئات الكيميائية المختلفة التي تم تحديدها عبر تقنيات مختلفة في أعماق مختلفة. بينما الأحماض الأمينية والسكريات تنخفض مع العمق, هذا لا يلاحظ بالنسبة للدهون.
عن طريق التحقق من صحة عبر الأيض التي تم تحديدها في جميع التحليلات ضد قاعدة بيانات KEGG تم تحديد أن المركبات المحددة تشارك في مسارات التمثيل الغذائي المشتركة مثل دورة حمض التراكربوكسيلي، تحلل السكر والتمثيل الغذائي للسكر. ومن الأهمية بمكان أن يكون على علم، طوال هذا الإجراء، بمصادر التلوث المحتملة. بدءا من جمع العينات من خلال التحليل، لا ينبغي أن تأتي العينات في اتصال مع البلاستيك مربوطة التي يمكن أن تؤثر سلبا على التأين.
العديد من المذيبات المستخدمة أثناء عملية الاستخراج خطرة أو قابلة للاشتعال. ارتدي معدات الوقاية الشخصية المناسبة دائماً لتجنب ملامسة الجلد والعينين، وكذلك لتجنب تلويث العينات.
