يقدم هذا البروتوكول تبادل الأيونات MALs، وهو أسلوب جديد لمراقبة جودة البروتين وتوصيف، ومراقبة الجودة التي هي ضرورية لاتساق وسلامة النتائج في بحوث علوم الحياة وتطوير المنتجات الصيدلانية. يحدد نظام الـ ION-Exchange MALS نقاء البروتين، وحالة القلة، والتجانس، والهوية، والتشكل، والهيكل، وتعديلات ما بعد الترجمة، وغيرها من الخصائص. القياسات غير مدمرة ويتم إجراؤها في محلول في ظل ظروف عازلة شبه فسيولوجية.
هذه الطريقة تحدد بدقة الكتلة الولية من البروتينات أو الببتيدات ، وحالة القلة ، ودرجة الاقتران ، على سبيل المثال ، بروتين الجليكوبروتين. ويمكن أيضا أن تطبق على البروتينات الغشائية. IEX يفصل الجزيئات الصغيرة من قبل تهمة سطحها.
تبادل أنيون، AIEX، وتبادل الموجبة، CIEX، المصفوفة ربط المتغيرات سالبة و مشحونة بشكل إيجابي، على التوالي. مع فصل دقيق بين مجموعات البروتين التي تشترك في كتلة قريبة نسبيا أو شكل، IEX-MALS يحدد بنجاح الكتلة الضروس لكل حالة من حالات البروتين الفردية في عينة خليط. للبدء، استخدم فلتر 0.1 ميكرومتر لتصفية جميع الكواشف، بما في ذلك مخازن الغسيل والفرز.
تصفية أول 50 إلى 100 ملليلتر من العازلة في زجاجة نفايات من أجل القضاء على الجسيمات من المرشحات الجافة. في زجاجة نظيفة ومعقمة التي تم غسلها جيدا بالماء المصفى وتوج لمنع الغبار من الدخول، تصفية ما تبقى من العازلة. مع درجة السّمو-ثمانية تريس العازلة و50 ملليمولار صوديوم كلوريد كلوريد, تمييع A BSA عينة إلى ستة ملليغرام لكل ملليلتر لذلك سوف تسمح درجة الH وقوة الأيونية ملزمة إلى عمود تبادل أيون.
استخدام حقنة لحقن ما لا يقل عن 0.3 إلى 0.5 ملليغرام من BSA في عمود مليلتر واحد لتحقيق تحليل جيد من قبل شركة مالس. لبدء تجربة الصرف الأيوني، افتح جديد، تجربة من أسلوب في برنامج "نظام مكافحة المخالفات"، وحدد الأسلوب عبر إنترنت من مجلد أساليب نظام التشتت الضوئي. إذا كانت الوحدة النمطية DLS متوفرة والبيانات DLS الحصول عليها، حدد الأسلوب عبر الإنترنت من المجلد الفرعي "مبعثر الضوء" QELS.
لتعيين المعلمات، ضمن المقطع تكوين، أولاً تعيين معدل تدفق تشغيل في المقطع مضخة عام إلى معدل التدفق المستخدمة في FPLC كـ 1.5 ملليلتر في الدقيقة. تحت قسم المذيبات، أدخل أو تحقق من معلمات العازلة. تحت قسم حاقن، أدخل اسم البروتين كـ BSA، وزيادة مؤشر الانكسار 0.185 ملليلتر في الغرام، ومعامل انقراض الأشعة فوق البنفسجية في الطول الموجي من 280 نانومتر ك 0.66 لتر لكل غرام لكل سنتيمتر.
في علامة التبويب عينة، أدخل تركيز عينة البروتين كما ستة ملليغرام لكل ملليلتر، ومن ثم إدراج حجم العينة للحقن كما 170 ميكرولترات كذلك. ضمن المقطع إجراءات، في علامة التبويب مجموعة أساسية، حدد خانة الاختيار Trigger على الإدخال التلقائي، وقم بتعيين مدة التشغيل إلى 70 ملليلتر بحيث يتم متابعة جمع البيانات لمدة خمس دقائق على الأقل بعد أن يصل التدرج إلى قيمته النهائية. ثم، في برنامج FPLC إنشاء تجربة جديدة في التبويب محرر الأسلوب.
بالنسبة للتجربة الأولية، قم بإنشاء تدرج خطي من الملح أو للدرجة الـ PH، بينما للأسلوب الأمثل قم بإنشاء تدرج أكثر تحديدًا أو برنامجًا متدرجًا وفقًا للمخطوطة. قم بتضمين إشارة نبض في الطريقة التي من شأنها أن تؤدي إلى جمع البيانات في برنامج إدارة خدمات السوفت. ثم، افتح صمام المضخة، واغسلها بـ 0.5-0.5 من هيدروكسيد الصوديوم المولر لإزالة الشوائب المقيدة بقوة، متبوعة بغسل عازلة تحييد.
ثم، وغسل العمود مع تريس العازلة رقم 8، صمام A مع العازلة الغسيل، وصمام B مع عازلة elution. استخدام العازلة مع انخفاض تركيز الملح كغسل النهائي لشطف العمود، لتمكين ربط البروتين إلى مصفوفة العمود. قبل حقن العينة، بعد الغسيل، وفي نهاية elution، يجب أن يكون استقر خط الأساس تناثر الضوء لضمان انخفاض مستوى الضجيج وتخفيف نقي تماما.
باستخدام حقنة، ضع عينة البروتين في الحلقة. بدء التجربة أولاً في برنامج "نظام إدارة مكافحة المخالفات" عن طريق النقر على زر تشغيل ثم في برنامج FPLC. وسيتم جمع البيانات بعد تلقي إشارة النبض من جهاز FPLC عبر كاشف نظام مكافحة المخالفات.
إذا تم تنفيذ ION-تبادلات MALS يدوياً مع وضع تدفق مستمر بدلاً من أسلوب مستقل، تطبيق نفس المعلمات تشغيل والإرشادات كما هو موضح سابقاً. بمجرد التحقق من الأسلوب النهائي وتشغيله، نفذ نفس الأسلوب بالضبط باستخدام حقن فارغ عن طريق تحميل المخزن المؤقت بدلاً من العينة. من المهم أن يكون التوقيت بين نبض الحقن التلقائي وتدرج المدى الفارغ مطابقًا لذلك الذي تم تشغيله في العينة.
لبدء التحليل، ضمن قسم الإجراءات في برنامج "إدارة مكافحة المخالفات" (MALS) ، استخدم علامة التبويب ديسبيكينغ والمستوى العادي لتسهيل الكروماتوجرامات. إذا كانت يحمل الكثير من الضوضاء، تعيين المستوى إلى الثقيلة. في عرض خط الأساس، حدد خط الأساس لجميع الإشارات، بما في ذلك كاشفات LS و UV و RI.
في عرض القمم، حدد القمم للتحليل. تحقق من القيم الصحيحة لقيمة زيادة الـ DN/dc و معامل انقراض الأشعة فوق البنفسجية للبروتين تحت كل ذروة. تحت كتلة المولر ونصف قطرها من ضوء عرض التشتت، وتحليل الكتلة العثة ونصف قطرها باستخدام نموذج زيم ودرجة تناسب الصفر.
إذا كان QELS متاحًا، تحت عرض Rh من QUELS، لاحظ قيم Rh وجودة ملاءمة وظيفة الارتباط. وتتغير إشارة الـ (RI) تغيراً كبيراً أثناء تشغيل النظام العام للصرف الطبي في البورصة الأيونية بسبب الزيادة في تركيز الملح. لطرح إشارة خط الأساس من الحقنة الفارغة، افتح تجارب تحويل البروتين والأيونات الفارغة.
انقر بزر الماوس الأيمن فوق اسم تجربة البروتين، وحدد تطبيق الأسلوب، واختر مجلد الطرح الأساسي من مربع الحوار الملف. حدد الطريقة عبر الإنترنت للتحليل الشامل الضروس القياسي. ضمن طريقة العرض طرح الأساس، انقر فوق استيراد فارغ لاستيراد إشارات تشغيل فارغ.
تحت أدوات، تحقق من جميع أجهزة الكشف عن طرح. لمعايرة نظام تحويل الأيونات مع monomer BSA، تحت الإجراءات وعرض التكوين، محاذاة القمم. ضمن طريقة العرض "التهيئة"، أدخل نانومتر 3.0 كقيمة Rg لتنفيذ التهيئة.
ثم، ضمن توسيع النطاق في نفس علامة التبويب تكوين، اختر الذروة واستخدم الزر أداء صالح لمطابقة إشارات الأشعة فوق البنفسجية و LS إلى إشارة RI. يتم عرض الرسم البياني للنتائج في طريقة العرض "ملائمة النتائج". تغيير موازين المحور ومعلمات الرسم البياني الأخرى بالنقر بزر الماوس الأيمن على الرسم البياني، وتحديد تحرير، ثم النقر فوق الزر خيارات متقدمة.
للحصول على مزيد من خيارات العرض، حدد علامة التبويب رسم الرسم البياني EASI، وفي أعلى النافذة في القائمة المنسدلة عرض، حدد الكتلة المولية أو Rh Q.All النتائج، بما في ذلك الكتلة العثة، ونصف القطر، ومستوى النقاء، وغيرها متوفرة في طريقة عرض التقرير تحت المقطع النتائج. استخدم الزر "مصمم التقرير" لإضافة المزيد من النتائج أو المعلمات، بالإضافة إلى الأرقام، إلى التقرير. في هذه التجربة، تم تحليل BSA على تحويل الأيونات MALS باستخدام عمود تحليلي لتبادل أنيون.
وعرض الكروماتوغرام الأشعة فوق البنفسجية في 280 نانومتر، وتناثر الضوء في زاوية 90 درجة، ومؤشر الانكسار، ومنحنيات الموصلية جنبا إلى جنب مع كتلة المول من كل قمة. فصل تدرج خطي واسع يتكون من 30 مجلد عمود من 75 ملليمولار إلى كلوريد الصوديوم 350 ملليمولار مونومرات BSA من الخافتات والأوليجوم العليا. وأسفر تحليل المصب المالي عن كتلة مولية محسوبة من مونومر 66.8 كيلودالون وكتلة مولية محسوبة من 130 كيلودالون.
واستنادا إلى الموصلية العازلة في القمم المائلة، تم تغيير التدرج إلى برنامج مختلف، وهو خطوة طويلة من كلوريد الصوديوم 175 ملليمولار، تليها تدرج خطي من 175 ملليمولار إلى كلوريد الصوديوم 500 ملليمولار. وقد حسن التدرج الجديد إلى حد كبير من الدقة وأسفر عن فصل ممتاز بين الأنواع أحادية اللون والأنواع القلايغُمية الأعلى. تم تطبيق برنامج متدرج من كلوريد الصوديوم 200 ملليمولار و 250 ميليمولار للتركيز أيضا على الأنواع القلوغيمية العالية.
وأدى ذلك إلى فصل ممتاز بين مونومر BSA، خافتر، وتقليم. وبعد هذا الإجراء، يمكن تنفيذ أساليب مثل قياس الطيف الكتلي ونشاط SDS-PAGE واختبارات الاستقرار على كل متغير يفصله تبادل أيون لتحديد كل واحد وتمييزه. وجدنا أن نظام الصرف الأيوني يُوسّع قوة تحليل نظام الـ MALS ليشمل العينات التي لا يمكن تحليلها بالكامل من قبل SEC-MALS.
الفصل عن طريق الشحن حل الأنواع المتميزة التي coelute في لجنة الأوراق المالية والبورصة.
