وقد درس التفاعل البروتين البروتين في النسخ تقليديا باستخدام غسيل الكلى بور. ومع ذلك، غسيل الكلى بور هي كمية بحتة. نستخدم قياس التداخل الطبقات الحيوية، أو BLI، للتغلب على هذه المشكلة.
بالمقارنة مع Por dan ، تكتشف BLI ارتباطًا في الوقت الحقيقي والتفكك بين شركاء الترابط. كما أنه يولد بارامترات حركية كمية، والتي تدل على آليات التفاعل. قد تبدو تقنية BLI مخيفة ، ولكن ليس من الصعب تعلم استخدام هذه التكنولوجيا ، يجب أن يكون لدى المرء إمكانية الوصول إلى أداة BLI والبرامج المرتبطة بها.
هذا الفيديو سوف تمكنك من التكيف بسهولة مع تقنية BLI. حوالي 10 دقائق قبل بدء المقايسة، ماصة 200 ميكرولترات من العازلة BLI في أنبوب PCR. إزالة النيكل NTA biosensor من التعبئة والتغليف الأصلي عن طريق عقد جزء واسع من جهاز استشعار الحيوية باستخدام يد قفاز.
ضع جهاز استشعار الحساسية البيولوجية فوق أنبوب PCR بحيث يتم غمر طرف الزجاج فقط من جهاز استشعار الحيوية في المخزن المؤقت BLI. حافظ على غمر طرف جهاز استشعار حيوي لمدة 10 دقائق على الأقل لضمان الترطيب الكامل. قم بتشغيل آلة الغارة.
تأكد من توصيل الجهاز بالكمبيوتر من خلال منفذ إخراج بيانات USB في الجزء الخلفي من الجهاز. على الكمبيوتر، افتح البرنامج المرتبط وانقر على "الحركية المتقدمة" على الجانب الأيسر من الشاشة. في البرنامج، اكتب كل المعلومات المناسبة حول التجربة تحت كل عنوان من عناوينها.
انقر على نوع Biosensor واختر النيكل NTA من القائمة المنسدلة. يمكن تغيير مدة كل خطوة من الافتراضي حسب الحاجة. للحصول على أفضل النتائج استخدم الحد الأدنى من 30 ثانية لخط الأساس الأولي و خط الأساس و 120 ثانية للارتباط والتفكك.
إزالة النيكل رطوبة NTA biosensor من أنبوب PCR ولصقه على جبل جهاز استشعار حيوي على الجهاز عن طريق انزلاق جزء واسع من جهاز استشعار الحيوية على جبل. وضع 0.5 ملليلتر أنبوب microcentuge الأسود في حامل أنبوب من الجهاز والماصات 400 ميكرولترات من BLI العازلة في ذلك. إغلاق غطاء الجهاز بحيث يصبح رأس biosensor المغمورة في العازلة في أنبوب microcentrifuge.
انقر فوق التالي على البرنامج لبدء تسجيل الأساس الأولي. بعد الانتهاء من الخطوة الأساسية الأولية التسجيل، افتح غطاء الجهاز. حرك شريط التمرير إلى اليمين، بحيث يكون حامل القطرة أمام السهم الأسود.
Pipette أربعة microliters من يغاند له الموسومة على حامل قطرة وإغلاق غطاء الجهاز، والتي ستبدأ تلقائيا تسجيل خطوة التحميل. بعد الانتهاء من عملية التحميل، افتح غطاء الجهاز. حرك شريط التمرير إلى اليسار، بحيث يقع حامل الأنبوب مرة أخرى أمام السهم الأسود.
أغلق غطاء الجهاز وتأكد من أن طرف الجهاز الحيوي مغمور في مخزن BLI المؤقت للأنبوب في حامل الأنبوب. سيبدأ الجهاز والبرمجيات تلقائياً في تسجيل خطوة الأساس. بعد الانتهاء من الخطوة الأساسية التسجيل، افتح غطاء الجهاز.
إزالة حامل قطرة وتنظيفه عن طريق الأنابيب من أي بروتين وشطفه مع الماء المزدوج deionized ما مجموعه خمس مرات. استخدام مسح الأنسجة لتنظيف سطح حامل قطرة بعد غسل الماضي. استبدل حامل القطرة مرة أخرى على الجهاز.
حرك شريط التمرير على الجهاز إلى اليمين، بحيث يقع حامل القطرة مرة أخرى أمام السهم الأسود. Pipette أربعة microliters من التحليل dialyzed على حامل قطرة وإغلاق غطاء الجهاز، والتي ستبدأ تلقائيا تسجيل خطوة الجمعية. بعد انتهاء خطوة الاقتران من التسجيل، افتح غطاء الجهاز.
حرك المنزلق على الجهاز إلى اليمين، بحيث يقع حامل الأنبوب مرة أخرى أمام السهم الأسود ويغلق غطاء الجهاز، والذي سيبدأ تلقائيًا في تسجيل خطوة الانفصام. بعد الانتهاء من خطوة الانفصام التسجيل، افتح غطاء الجهاز وأزل حامل القطرة وحامل الأنبوب. شطف بدقة على حد سواء مع الماء المزدوج deionized لغسل أي بروتين.
إزالة جهاز استشعار الحيوية والتخلص منه بأمان. كرر هذه الخطوات لزوج الأندالات الليغاند نفسه باستخدام تركيزات تحليلية مختلفة. بمجرد الانتهاء من جميع تشغيل، وحفظ البيانات على البرنامج عن طريق النقر على ملف وحفظ التجربة كما على الجانب الأيسر من الشاشة.
ضمن عنوان تشغيل البيانات، حدد تصحيح الخطوة والملاءمة من واحد إلى واحد وانقر فوق تحليل لتوليد بيانات حركية. لاستخراج البيانات الكمية في ورقة عمل وإنشاء الرسوم البيانية، انقر على تصدير إلى CSV وحفظ البيانات المسجلة كملف CSV. افتح ملف CSV باستخدام برنامج جدول بيانات.
يتكون GrgA كامل الطول من 288 الأحماض الأمينية. كما هو مبين هنا، 28 منطقة متوسطة من الأحماض الأمينية يربط سيغما 28 مباشرة. هنا المنطقة الوسطى الموسومة مع محطة نهاية تم استخدام العلامة له كما ligand، الذي كان أول شل إلى غيض من النيكل NTA biosensor.
وتظهر تسجيلات للتجارب مع ثلاثة تركيزات تحليلية مختلفة تبدأ كل منها 30 ثانية قبل الربط الليغاني وتنتهي بعد دقيقتين من بداية الغسيل الأخير. يظهر التصور المحسن لرابطة التحليلات والتفكك بعد إزالة القيم في المرحلتين الأوليين وإعادة تعيين خط الأساس. بعد غسل غير منضم ومحطة له الموسومة GrgA 138 إلى 165 قبالة biosensor، وسجلت في الوقت الحقيقي مع الارتباط التحليل بعد إضافة سيغما 28.
وأخيرا، تم تسجيل تفكك الوقت الحقيقي بعد غسل. قبل BLI المقايسة، تتم إزالة الجلسرين من يغاندس وأنزال. نوصي بأن يتم إجراء BLI بعد غسيل الكلى مباشرة كما هو مناقش في النص.
بعد وصف التفاعلات البروتينية البروتينية في النسخ مع BLI، يمكن للمرء أن التحقيق في كيفية تأثير التفاعل على بدء النسخ، الاستطالة، أو الإنهاء.
