وغالبا ما يتم التركيب الحيوي للمنتجات الطبيعية كفئة من المركبات، وليس كمنتج واحد. تصفية التجزئة التشخيصية هي نهج بسيط للكشف عن جميع المركبات ذات الصلة هيكليا داخل خليط معقد. تصفية التجزئة التشخيصية، التي تنفذ في برنامج MZmine، يسمح المحلل لاستكشاف مجموعات بيانات قياس الطيف الشامل للمنتجات الطبيعية الجديدة التي من شأنها أن تفوت خلاف ذلك.
وهذا يشمل المنتجات الحيوية الجديدة، والسموم الجديدة أيضا. ويمكن أن يُسترشد في عمليات تقييم التعرض، وذلك من خلال تصفية التشظي التشخيصية، التي تُطبق على فئات السموم التي تلوث الغذاء والماء. عند تطبيقها على مستخلصات ميكروبية ونباتية ، يمكن أن يؤدي إلى اكتشاف مركبات جديدة.
يتطلب استخدام تصفية التجزئة التشخيصية فهمًا لخصائص قياس الطيف الكتلي المتناسقة الرئيسية التي تحدد فئة كيميائية. وهذا يعني أن المركبات المماثلة هيكليا سوف تولد أيونات مميزة. اسمي شون هوغسترا
أنا فني أبحاث ومطور برامج في مركزنا، وسوف أقوم بإظهار الإجراء. لإعداد عينة لتحليل ميكروستين، تلقيح 30 ملليلتر من قارورة البكتيريا الزرقاء العقيمة المتوسطة إلى ما يقرب من خمس مرات-10-إلى-الخمسة الخلايا لكل ملليلتر، في ظل ظروف اتعفن، في 250 ملليلتر قارورة إرلينماير، ورصد كثافة الخلية مع مقياس الهيموسيت. بعد 26 يوما من الثقافة photoautotrophic، مضيئة مع ضوء فلوري أبيض بارد باستخدام نظام 12 ساعة ضوء الظلام في 27 درجة مئوية، مع دوامة مرة واحدة يوميا، واستخدام 47 ملليلتر قطر GF / C الزجاج أوراق تصفية الليفية الدقيقة لفصل الخلايا من وسيلة الثقافة عن طريق الترشيح فراغ.
إضافة ثلاثة ملليلتر من 80٪ الميثانول إلى الخلايا المحصودة في أنابيب اختبار 14 ملليلتر، ودوامة و sonicate في وقت لاحق كل أنبوب لمدة 30 ثانية. بعد سونيكيشن، lyse العينات مع ثلاث ساعات متتالية، ناقص-20 درجة مئوية تجميد، و 15 دقيقة دورة ذوبان درجة حرارة الغرفة، وتصفية كل خلية البكتيريا الناتجة استخراج من خلال الفردية 0.22 ميكرومتر بوليتيترافلورو فلاتر الحقن. باستخدام تيار لطيف من غاز النيتروجين، وتجفيف مستخلصات مع المبخر في 30 درجة مئوية، وتخزين مستخلصات الجافة في ناقص 20 درجة مئوية.
لتحليل قياس الطيف الكتلي المترادف للكروماتوغرافيا السائلة، إعادة تكوين البقايا المجففة لتحليلها مع 500 ميكرولترات من 90٪ من الميثانول، ودوامة العينات لمدة 30 ثانية. نقل إلى قارورة الكروموغرافيا السائلة عالية الضغط الكهرمان. ثم تحليل استخراج البكتيريا الزرقاء باستخدام طريقة اكتساب تعتمد على البيانات على مطياف كتلة عالية الدقة وفقا للبروتوكولات القياسية.
تحتوي معظم الميكروستينات على بقايا ATA تنتج أيونات من المنتجات التشخيصية في قياس الطيف الكتلي جنباً إلى جنب، M through Z 135.0803، و 163.1114. بالنسبة لإعداد مجموعة بيانات قياس الطيف الكتلي غير المستهدفة، افتح MZmine 2، وحدد استيراد البيانات الخام"تحت أساليب البيانات الخام" القائمة المنسدلة. ثم حدد ملفات البيانات من تحليل ميكروستين، وحدد عامل تصفية الانتقاء الذروة لتطبيق خوارزمية المركزية الموردة.
لتصفية تجزئة التشخيص أو DFF، من ملفات الاكتساب المستندة إلى البيانات المستوردة، استخدم المؤشر لتمييز ملفات البيانات، وفتح القائمة المنسدلة مرئيات "لتحديد الخيار DFF. في مربع الحوار DFF الذي يظهر، أدخل نطاق أوقات الاستبقاء والدقائق عندما يتملّل الفئة المستهدفة من التحليلات، والعثور على نطاق نسبة الشامل إلى الشحنة للفئة المستهدفة من التحليلات، بما في ذلك إمكانية المركبات المشحونة المتعددة عند الاقتضاء. إدخال دقة الكتلة الطيفية الكتلية القابلة للتحقيق من أداة قياس الطيف الكتلي، وإدخال أيونات المنتجات الخاصة بالفئة من نسبة الكتلة إلى الشحنة.
أدخل الخسائر المحايدة الخاصة بالفئة، وحدد الحد الأدنى من كثافة أيونات المنتجات التشخيصية و/أو الخسائر المحايدة التي يجب اعتبارها كنسبة مئوية من ذروة قاعدة أطياف الطيف الطيفي الكتلي المرادف. ثم حدد مسار واسم الملف لإخراج النتائج ثم انقر فوق موافق "لبدء تشغيل DFF. سوف تظهر مؤامرة DFF عند الانتهاء بنجاح من الإعداد.
يجب على المحلل تفسير الأطياف الكتلية جنبا إلى جنب من المركبات المعروفة داخل فئة المركب لتحديد أيونات المنتج و / أو الخسائر المحايدة التي هي تشخيص لفئة كاملة من المركبات. تم إنشاء هذه المؤامرة DFF بعد تحليل M.aeruginosa CPCC 300. ويمثل المحور س هذه النسبة من الكتلة إلى الشحنة للأيونات السليفة التي تفي بمعايير DFF المحددة، بينما يُظهر المحور ص نسبة الكتلة إلى الشحنة لجميع أيونات المنتج داخل أطياف الطيف الكتلي المترادفة للميكروسينتس.
ولهذا التحليل، شملت معايير الكشف عن الميكروستين أيونات السلائف في نسبة الكتلة إلى الشحنة التي تتراوح بين 400 و 200، وأوقات الاستبقاء بين دقيقتين إلى ست دقائق. والأهم من ذلك، احتوت هذه الطيف الطيفي الكتلي المترافق كلا من نسب الكتلة إلى الشحنة فوق عتبة كثافة الذروة الأساسية المحددة البالغة 15٪. ومن بين 4، 116 من أطياف الطيف الكتلي التي تم الحصول عليها أثناء التحليل، استوفت 26 أطيافاً معايير DFF وتم اكتشافها في مستخلص M.aeruginosa CPCC 300.
يمكن تعيين microcystins الرئيسية التي تم الكشف عنها بثقة كما ارجينين الميكروستين microcystin وdemethylated حمض الأسبارتيك microcystin لوسيين أرجينين. كما يتم اكتشاف مركبات جديدة باستخدام تصفية التجزئة التشخيصية، يمكن أن تزرع الكائنات الحية على نطاق واسع لعزل وتوصيف المركبات بواسطة NMR. عند تطبيقها على microcystins، تصفية التجزئة التشخيص يسمح لنا لتحديد ما إذا كانت أساليب الفحص التقليدية المستهدفة الكشف عن السموم الرئيسية الموجودة داخل عينة.
