تسيطر الأجسام المضادة أحادية النسيلة على سوق الأدوية الحيوية ويتم تنقيتها عادة من قبل البروتينات اللونية. الراتنج وفقا هو سائق تكلفة رئيسية أثناء الإنتاج التي تؤثر على سعر العلاجات المضادة القائمة. هنا نحن وصف رابطة تقارب جديدة على أساس البروتين الفلورسنت التي تقرأ على أنها الناقل لeptope خطي من فيروس نقص المناعة البشرية تحييد الأجسام المضادة 2F5.
بشكل عام يسمح أسلوبنا جيل سريع من راتنجات اللونية تقارب التي يمكن استخدامها لالتقاط الأجسام المضادة أحادية النسيلة. وقد أثبتنا هذه القدرة من خلال التقاط الأجسام المضادة 2F5 من استخراج مصنع الخام. نحن الأمثل ظروف التقاط ومخزن الحل من أجل تحسين القدرة على ربط دينامية وإعادة الاستخدام الراتنج.
يسمح راتنجنا عموماً بظروف أكثر مرونة من البروتين A ولديه القدرة على تقليل تكاليف تنقية الأجسام المضادة أحادية النسيلة. وعلاوة على ذلك، يمكن بسهولة أن تكيف الراتنج للأجسام المضادة الأخرى التي ترتبط epitopes الخطية. لبدء هذا الإجراء، ضبط تركيز حل رابطة التقارب المعدة بحيث يكون في نطاق 5 إلى 15 غراما للتر الواحد كما هو محدد من قبل تصميم التجارب.
تخزين الحل على الجليد حتى رد فعل اقتران جاهز. بعد ذلك، قم بتعبئة حقنة واحدة ذات ملليلتر بمحلول DFE. وإعداد محول لتركيب الحقن على أعمدة agarose عبر الارتباطات عبر NHS بحجم سرير واحد ملليلتر.
لكل 10 أعمدة تستخدم في اقتران، إعداد 30 ملليلتر من حل التعطيل، 30 ملليلتر من محلول منخفض pH، و ملليلتر واحد من حل التخزين. ثم أعد 20 ملليلتر من حمض الهيدروكلوريك المليمولر الواحد في أنبوب. و احتضنه على الثلج لمدة 20 دقيقة على الأقل
إعداد مقياس دقيق لمراقبة تدفق من خلال الكسور لجميع الخطوات خلال التفاعل اقتران. بعد هذا، فتح عمود أغاروز مختومة تنشيط NHS عبر الاتّصال. تطبيق قطرة من المخزن المؤقت على مدخل المحول، لمنع الهواء من دخول العمود.
قم بتركيب محول الحقنة في مدخل العمود. غسل العمود مع ستة ملليلتر من الجليد بارد حمض الهيدروكلوريك ملليمولار واحد، بمعدل تدفق أقل من ملليلتر واحد في الدقيقة. باستخدام حقنة مليلترتين، قم على الفور بحقن 1.5 ملليلتر من محلول DFE بمعدل تدفق أقل من ملليلتر واحد في الدقيقة.
وجمع تدفق من خلال كسر على مقياس دقيق لتحليل لاحق. ختم العمود في كلا الطرفين واحتضان لمدة 15 إلى 45 دقيقة، في 22 درجة مئوية. حقن المقبل ستة ملليلتر من حل التنشيط، تليها ستة ملليلتر من محلول pH منخفضة، بمعدل تدفق أقل من ملليلتر واحد في الدقيقة الواحدة، وإزالة غير التكافؤ ملزمة يغاندس من الراتنج.
قم بإدخال ستة ملليلترات من حل التنشيط، واحتضان العمود لمدة 15 دقيقة. بعد ذلك، حقن ستة ملليلتر من محلول pH منخفض في العمود. متبوعة بستة ملليلترات من حل التنشيط.
ثم حقن آخر ستة ملليلتر من محلول منخفض pH في العمود. حقن مليلترين من محلول التخزين في العمود، وتخزينه عند أربع درجات مئوية. أولاً إعداد 100 ملليلتر من استخراج النبات أوضح تحتوي على 2F5، أو عظمى لنظام التعبير المفضل على أساس الخلية، والذي يحتوي أيضا 2F5.
المقبل إعداد العازلة التوازن، والحديد العالي X قوة الوهم العازلة، كما هو مبين في بروتوكول النص. قم بمسح نظام الكروماتوغرافيا بالمخازن المؤقتة. قم بتحميل عمود تقارب DFE على نظام الكروماتوغرافيا.
وتككيل مع خمسة السيرة الذاتية من العازلة التوازن، بمعدل تدفق ملليلتر واحد في الدقيقة. مراقبة امتصاص الأشعة فوق البنفسجية في 280 نانومتر. ثم تحميل 80 ملليلتر من استخراج النبات أوضح، أو عظمى على العمود بمعدل تدفق 5 ملليلتر في الدقيقة الواحدة.
لضمان وقت الاتصال دقيقتين. جمع تدفق من خلال عينات في 2 ملليلتر الكسور أو إعادة بناء منحنى اختراق. تخزين تدفق من خلال العينات في أربع درجات مئوية، إذا كان تحليل العينة الفورية غير ممكن.
بعد هذا غسل العمود مع 6CV من العازلة التوازن. جمع عينة في بداية، منتصف ونهاية الغسيل. تمييع MAB2F5 مع خمسة مجلدات من قوة عالية من قوة الوهم العازلة.
جمع كسر DFE عندما زادت إشارة الأشعة فوق البنفسجية في 280 نانومتر إلى خمسة وحدات امتصاص ملي فوق خط الأساس. تحسين العازلة الوهم لكل زوج epitope-الأجسام المضادة، كما هو موضح في بروتوكول النص. يتم التعبير عن البروتين الانصهار DFE في نباتات التبغ المعدلة وراثيا، التي تزرع في الدفيئة.
الانتعاش العام للDFE هو 23.5 ملليغرام لكل كيلوغرام. مع نقاء أكثر من 90٪ المبلغ المطلق من DFE شل على الراتنج يزيد مع كتلة DFE حقن في العمود، والهضاب في حوالي 15 غراما للتر الواحد، في حين أن العائد اقتران ينخفض باستمرار كما يتم حقن أكثر DFE. وينظر إلى جزيئات DFE للاحتفاظ فلوركينس الأحمر، حتى بعد اقتران.
كثافة اللون يتوافق مع المبلغ الإجمالي للDFE شل. لذلك يمكن استخدام لون العمود كمعلمة بسيطة لمراقبة الجودة لتقدير كفاءة اقتران، ونوعية العمود. يتم إنتاج الأجسام المضادة المؤتلفة 2F5 بشكل عابر في نباتات نيكوتيانا بنثاميانا التي تزرع في النبات.
يتم اختبار التقاط 2F5 من استخراج مصنع الخام، باستخدام أعمدة تقارب، إلى جانب ما يقرب من سبعة ملليغرام من DFE المنقاة. تركيز كلوريد المغنيسيوم من 1.25 الضرس كافية ل2F5 elute من الراتنج تقارب DFE مع الانتعاش ما يقرب من 100٪ ونقاء ما يقرب من 97٪ وهو مماثل للراتنجات البروتين A. DBC من الراتنج تقارب DFE في 10٪ 2F5 اختراق، ينخفض خطيا على مدى الدورات 25، إلى حوالي 15٪ من القيمة الأولية.
استخدمنا تصميم نهج التجارب لتحسين القدرة على الاقتران لدينا رابطة تقارب. هذه الشروط يمكن ضبطها بدقة ليغاند أخرى في المستقبل. يستخدم أسلوبنا البروتين الفلورسنت لخيط بروتين الناقل الفرعية للمنتج يغاند محددة.
في الوقت نفسه فقط إضافة وظائف كمؤشر جودة بصرية من إجراءات التعبئة، وتوفير تغذية مرتدة فورية وبديهية للمشغل.
