البروتوكول الموصوف هنا يسمح لنا بالتحقيق في وظيفة chemokine وسلوك الضامة في الجسم الحي. وتستند معظم النماذج التجريبية الموجودة من chemotaxis الخلية على تجارب الخلايا في المختبر. ولكن التجارب في المختبر في بعض الأحيان بسيطة جداً لنميث البيئة المعقدة في الجسم الحي.
أيضا، فإنها قد لا تمثل القدرة على العلاج الكيميائي في الجسم الحي. هذه الأساليب تستخدم ميزة محددة من الأسماك حمار وحشي لمراقبة سلوك الخلية مباشرة، وهو أمر صعب بالنسبة للفئران. ابدأ بتوليد 10A interleukin-34 الانشاءات المعدلة وراثيا.
حقن FABP-10A إنترلوكين-34 يبني في مرحلة واحدة خلية Tg (mpeg1:GFP) المعدلة وراثيا وأجنة الأسماك من نوع البرية جنبا إلى جنب مع MRNA transposase. رفع وجمع الأجنة وفقا لتعليمات المخطوطات. ثم، إصلاح لهم مع 4٪ شبهformaldehyde بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية أو لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة.
بعد التثبيت، وغسل الأجنة مع PBST ثلاث مرات لمدة خمس دقائق لكل غسل. يجفف الأجنة بشكل منفصل مع 50٪ من الميثانول في PBST ، يليه 100٪ من الميثانول ، ثم يتغير إلى ميثانول جديد بنسبة 100٪، ويخزنها عند درجة حرارة سالبة 20 درجة مئوية لمدة ساعتين على الأقل. عندما تكون جاهزة للتهجين التحقيق، إعادة هيدرات الأجنة بشكل منفصل في 50٪ الميثانول في PBST.
ثم، وغسلها مع PBST ثلاث مرات لمدة خمس دقائق لكل غسل. اهضم الأجنة بالبروتينات K في PBST في درجة حرارة الغرفة. ثم، والتخلص من حل الهضم، وتكرار التثبيت مع 4٪ شبهformaldehyde لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
بعد التثبيت، وغسل الأجنة مرتين مع PBST لمدة 10 دقيقة لكل غسل. تنفيذ prehybridization مع العازلة التهجين ساخنة في 65 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة على الأقل. ثم، سخني مسبار إنترلوكين-34 إلى 65 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
إعادة تدوير العازلة التهجين في أنبوب الأصلي وتنفيذ التهجين مع مسبار مسخن في 65 درجة مئوية بين عشية وضحاها. في اليوم التالي، قم بغسل الأجنة بنسبة 50٪ و2X SSCT متبوعة بـ 2X SSCT ثم 0.2x SSCT عند 65 درجة مئوية. كرر كل غسل ثلاث مرات مع 20 دقيقة لكل غسل.
ثم، غسل الأجنة ثلاث مرات مع PBST لمدة خمس دقائق لكل غسل. منع العينات مع 600 ملليلتر من العازلة حظر لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. ثم، إضافة 400 ميكرولترات من المضادة للأجسام المضادة للحفر digoxigenin حل واحتضان الأجنة في أربع درجات مئوية بين عشية وضحاها.
في اليوم التالي، قم بإزالة الجسم المضاد وغسل الأجنة ست مرات مع PBST لمدة 20 دقيقة لكل غسل. بعد الغسيل الأخير، شطف كل عينة مع 30 ميكرولترات من 1X بالإضافة إلى diluent التضخيم لمدة خمس دقائق. احتضان العينات في محلول الثيامين الفلوروفور لمدة خمس إلى 15 دقيقة في الظلام.
تمديد فترة الحضانة إلى 30 دقيقة إذا كانت الإشارات ضعيفة. ثم، غسل الأجنة مع PBST ثلاث مرات لمدة 10 دقائق لكل غسل. واحتضانهم مع الأجسام المضادة الأولية في أربع درجات مئوية بين عشية وضحاها.
في اليوم التالي، يغسل الأجنة خمس مرات مع PBST لمدة 30 دقيقة لكل غسل، واحتضان لهم مع الأجسام المضادة الثانوية في أربع درجات مئوية بين عشية وضحاها. في اليوم التالي، وغسل الأجنة ثلاث مرات في PBST لمدة 10 دقائق لكل غسل، وتخزينها في 70٪ الجلسرين في الظلام في أربع درجات مئوية أو سلبية 20 درجة مئوية لفترة أطول. قبل التصوير، استخدم مجهر الفلوريسين لتحديد الأجنة الإيجابية المزدوجة الحمراء وGFP.
لتركيب الأسماك، واستخدام حمام معدني لتسخين ملليلتر واحد من 1٪ ذوبان agarose منخفضة إلى أكثر من 90 درجة مئوية. ثم، تبريده لدرجة حرارة الجسم ومزيج في 50 ميكرولترات من 0.2٪ tricaine. نقل الأجنة تخدير إلى طبق صغير مثبت مع شريحة غطاء على الجزء السفلي.
إزالة المياه المحيطة بها وإسقاط ببطء agarose ذوبان منخفضة على الأجنة. تعيين بعناية موقف الأسماك قبل أن تتوطد agarose، والحفاظ على منطقة الكبد قريبة من الشريحة الغطاء. بمجرد أن تتوطد agarose ، وتغطي بعناية مع طبقة أخرى من agarose لتعزيز ذلك.
ضع الطبق على طاولة الناقل المجهر confocal، وتغطية الأسماك مع حل E2 مع tricaine، وبدء التصوير. لتشغيل المجهر confocal، افتح برنامج Zen Black 2.3 وانقر فوق تحديد موقع، ثم الحضانة، ثم قم بتعيين درجة الحرارة إلى 29 درجة مئوية. انقر على قائمة الامتلاك وحدد وضع المسح الضوئي المطلوب وأشعة الليزر في قائمة الإعداد الذكية.
ثم حدد Z-المكدس والموضع. انقر على قائمة المصمم التجريبية وحدد تمكين تجربة كتلة متعددة في الكتلة الأولى للعثور على العينة تحت التكبير منخفضة. ثم قم بالتبديل إلى التكبير العالي والسماح للمنطقة الملاحظة في وسط المجال المرئي.
تعيين الموقع وZ-المكدس المعلومات. ثم حدد كثافة الليزر المناسبة، وطبقات المسح الضوئي، وسرعة التصوير. مرة واحدة يتم إعداد كافة الكتل، تعيين العدد المناسب من الحلقات وبدء التسجيل.
تم استخدام هذا البروتوكول لحقن إنترلوكين-34 الكبد محددة على التعبير plasmid في أجنة الأسماك المعدلة وراثيا، الذي تم تصنيف الضامة مع GFP. واستخدمت الفلورية الكاملة في التهجين الموضعي والمناعة لتحليل التعبير عن interleukin-34 وطبقة الضامة المسماة على GFP. تم تحليل أرقام خلايا الضامة كمياً في منطقة الأجنة التي تم حقنها وبناءها.
تم استخدام التصوير الحي لمراقبة الضامة مباشرة ، وصفت الخضراء ، وتمرير الكبد من الأسماك التحكم والهجرة إلى كبد interleukin - 34 على التعبير عن الأسماك. وتشمل الخطوات الهامة لهذا البروتوكول اختيار خط تحويلي مناسب لتسمية خلية الاهتمام. والأنسجة المناسبة لتصوير التعبير عن الجين المعدلة وراثيا وكذلك نافذة زمنية الملاحظة المناسبة.
يمكن تطبيق هذه التقنية لدراسة وظيفة العلاج الكيميائي الأخرى على سلوك الخلايا الأخرى ، مثل الخلايا التائية والعدلات في الجسم الحي.
