نحن وصف الاستراتيجيات وبروتوكولات خطوة بخطوة لإنشاء المسلسل 3D المريض المشتقة من الجهازية من سرطان البروستاتا النقيلي العظام. بروتوكولاتنا الأمثل هي عملية لإعداد الثقافات 3D للتجارب باستخدام مواد البداية محدودة مباشرة من المرضى أو أنسجة الورم xenograft المستمدة من المريض. يمكن استخدام الأعضاء ثلاثية الأبعاد من هذا البروتوكول كنماذج vivo السابق لفهم الآليات الأساسية لمرض سرطان البروستاتا النقيلي العظام واختبار العلاج.
وسائل الإعلام ثقافة الجهازية 3D في هذا البروتوكول هو محدد للخلايا المشتقة من البروستاتا. يمكن تطبيق أجزاء أخرى من بروتوكولاتنا على أنواع مختلفة من أنسجة الأورام ومواقع النقيلي. قد يثبت تقنية doming أن يكون الجزء الصعب في هذه العملية.
وسوف ممارسة تقنية doming ضمان حجم ثابت من خليط مقبب من organoids, وسائل الإعلام, وماتريجل, وتقليل تشكيل فقاعة أثناء تعليق عينة. بصريا مما يدل على هذه الطريقة يوفر فهم أفضل لكيفية التعامل مع Matrigel لزجة لاستزراع organoids أقل كثافة بنجاح من عدد منخفض من الخلايا. تبدأ من قبل resuspending بيليه الخلية في حجم مناسب من غشاء الطابق السفلي لإعداد لوحة 24-well.
الماصات صعودا وهبوطا بلطف لضمان أن الخلايا هي resuspended، ثم ماصة الحجم المناسب من تعليق الخلية في وسط لوحة ثقافة الأنسجة قبل الدافئة. عكس لوحة ووضعها رأسا على عقب على الفور في حاضنة ثقافة الخلية تعيين في 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 15 دقيقة. Pipette الحجم المناسب من المتوسطة قبل الدافئة التي تحتوي على 10 ميكرومولار Y-27632 ديهيدروكورايد في كل بئر.
لتشكيل قبة عائمة من القبة المستديرة المرفقة، افصل القبة عن اللوحة باستخدام مكشطة خلية. قطع اثنين في أربعة بوصة قطعة من فيلم البارافين ووضعها على رأس divots من طرف فارغ عقد رف من مربع طرف ماصات بلاستيكية ملليلتر واحد. استخدام إصبع السبابة قفاز للضغط بلطف إلى أسفل على فيلم البارافين لتتبع divots مع الحرص على عدم اختراق الفيلم.
رش فيلم البارافين مع 70٪ الإيثانول وتشغيل مصباح الأشعة فوق البنفسجية في خلية هود الثقافة لتعقيم الفيلم المعد لمدة 30 دقيقة على الأقل. وفي الوقت نفسه، resuspend الخلايا المعالجة مسبقا في 20 ميكرولترات من غشاء الطابق السفلي. ثم الماصات تعليق في divots شكلت في فيلم البارافين.
وضع حبات وparffin الفيلم في لوحة ستة بئر والماصات من ثلاثة إلى خمسة ملليلتر من المتوسطة قبل الدافئة التي تحتوي على 10 ميكرومولار Y-27632 ديهيدروكلوريد في كل بئر في حين بالفرشاة بلطف الخرز قبالة من فيلم البارافين. لمعالجة العضيات لعلم الأنسجة، وإزالة الوسائط الموجودة من البئر مع الحرص على عدم التبخر القباب غشاء الطابق السفلي. إضافة وحدة تخزين متساوية من حل استرداد الخلايا واحتضان لوحة لمدة 60 دقيقة في أربع درجات مئوية.
بعد الحضانة، ازاحة قبة غشاء الطابق السفلي باستخدام ماصة وسحقه مع طرف ماصة. جمع القبة المنفصلة وحل استعادة الخلية في أنبوب 1.5 ملليلتر. جهاز طرد مركزي الأنبوب في 300 مرة ز في أربع درجات مئوية لمدة خمس دقائق، ثم إزالة فائقة ووضعها جانبا.
حفظ جميع supernatants حتى الخطوة النهائية عندما يتم تأكيد وجود organoids في الحجم المطلوب من برنامج تلفزيوني الباردة والماصات بلطف صعودا وهبوطا إلى طرد ميكانيكيا بيليه دون تعطيل organoids. كرر الطرد المركزي وإزالة ازاحة. إصلاح بيليه في حجم مطابقة من 4٪ PFA لمدة 60 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
بعد التثبيت، كرر خطوة الطرد المركزي وغسل برنامج تلفزيوني. ثم إضافة ببطء 200 ميكرولترات من دافئة 2٪ agarose وعلى الفور ولكن بلطف فصل بيليه الخلية من جدار الأنبوب دون تعطيله باستخدام إبرة قياس 25 تعلق على حقنة ملليلتر واحد. لطريقة أغاروز تدور أسفل, فمن الأهمية بمكان لفصل بيليه الخلية من جدار الأنبوب الحق بعد إضافة agarose باستخدام إبرة قياس 25.
بمجرد أن تتوطد agarose تماما، وفصله عن الأنبوب مع إبرة قياس 25 تعلق على حقنة ملليلتر واحد ونقلها إلى أنبوب جديد 1.5 ملليلتر. ملء أنبوب مع 70٪ الإيثانول والمضي قدما في البروتوكول التقليدي لجفاف الأنسجة والparffin تضمين. تم استخدام هذا البروتوكول بنجاح لإنشاء 3D organoids من نماذج xenograft المستمدة من المريض من سرطان البروستاتا النقيلي العظام وكذلك مباشرة من أنسجة السرطان.
عرضت الأعضاء أنماطًا ظاهرية مختلفة تتجلى كخراجات وبشريات وعضويات عالية التعقيد. يمكن رؤية قبة كاملة من غشاء الطابق السفلي و organoids في صورة مخيط من 25 عالية الدقة، 10X صور التكبير. لمزيد من التحقيق في أنسجة الورم، تم إجراء الكيمياء الخلوية المناعية على خمسة ميكرومتر سميكة البارافين مقطع من organoids تستهدف علامة الخلايا الظهارية القاعدية cytokeratin-5، اللمعان الظهارية الخلية علامة cytokeratin-8 وDAPI.
يمكن تحسين هذا البروتوكول لتطبيقات أخرى مثل النشاف الغربي ، والثقافة المشتركة والتدفق الجُلّي لاستكشاف خصائص الأعضاء ثلاثية الأبعاد وآثار العلاجات الدوائية. ويمكن لهذه التجارب أن تعالج آليات مقاومة الأدوية وفعالية العلاجات الجديدة وحدها أو بالاشتراك مع العلاجات الحالية. organoids 3D من هذه التقنية الاحتفاظ بين المواضيع وداخل الموضوع التجانس وبالتالي هي نموذج أكثر دقة من المرض في المرضى.
هذه التقنية تمهد الطريق للباحثين لاستكشاف آليات مقاومة الأدوية، ورمريجنيسيس، الانبثاث والعلاجات التي قد تكون أكثر قابلية للتنبؤ تطور المرض في المرضى واستجابتهم للعلاج.
