Name: advanced 3d liver models for in vitro genotoxicity testing following long-term nanomaterial exposure
Uploaded: 2020-06-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 25 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Advanced 3D Liver Models for In vitro Genotoxicity Testing Following Long-Term Nanomaterial Exposure at JoVE.com

ويود المؤلفون أن يعترفوا بأن هذا البحث قد تلقى تمويلا من برنامج الاتحاد الأوروبي للأبحاث والابتكار في أفق 2020 لمشروع PATROLS، بموجب اتفاق المنح رقم 760813

<ol>
	<li>Geiser, M., Kreyling, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deposition+and+biokinetics+of+inhaled+nanoparticles.">Deposition and biokinetics of inhaled nanoparticles.</a> Particle and Fibre Toxicology. 7, 2 (2010).</li><li>Modrzynska, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxicological+effects+of+nanoparticle+deposition+in+the+liver.">Toxicological effects of nanoparticle deposition in the liver.</a> Kgs. Lyngby, Denmark: Technical University of Denmark. , (2018).</li><li>Elje, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+comet+assay+applied+to+HepG2+liver+spheroids.">The comet assay applied to HepG2 liver spheroids.</a> Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 845, 403033 (2019).</li><li>Breslin, S., O'Driscoll, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+cell+culture:+the+missing+link+in+drug+discovery.">Three-dimensional cell culture: the missing link in drug discovery.</a> Drug Discovery Today. 18, 240-249 (2013).</li><li>Shah, U. -. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+three-dimensional+in+vitro+HepG2+cells+liver+spheroid+model+for+genotoxicity+studies.">A three-dimensional in vitro HepG2 cells liver spheroid model for genotoxicity studies.</a> Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 825, 51-58 (2018).</li><li>Lauschke, V. M., Hendriks, D. F. G., Bell, C. C., Andersson, T. B., Ingelman-Sundberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+3D+Culture+Systems+for+Studies+of+Human+Liver+Function+and+Assessments+of+the+Hepatotoxicity+of+Drugs+and+Drug+Candidates.">Novel 3D Culture Systems for Studies of Human Liver Function and Assessments of the Hepatotoxicity of Drugs and Drug Candidates.</a> Chemical Research in Toxicology. 29, 1936-1955 (2016).</li><li>van Grunsven, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+in+vitro+models+of+liver+fibrosis.">3D in vitro models of liver fibrosis.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 121, 133-146 (2017).</li><li>Corvi, R., Madia, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+genotoxicity+testing+-+can+the+performance+be+enhanced.">In vitro genotoxicity testing - can the performance be enhanced.</a> Food and Chemical Toxicology. 106, 600-608 (2017).</li><li>Doak, S. H., Manshian, B., Jenkins, G. J. S., Singh, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+genotoxicity+testing+strategy+for+nanomaterials+and+the+adaptation+of+current+OECD+guidelines.">In vitro genotoxicity testing strategy for nanomaterials and the adaptation of current OECD guidelines.</a> Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 745, 104-111 (2012).</li><li>Fenech, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytokinesis-block+micronucleus+cytome+assay.">Cytokinesis-block micronucleus cytome assay.</a> Nature Protocols. 2, 1084-1104 (2007).</li><li>OECD. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> OECD Guidelines. Test 489: In vivo Mammalian Alkaline Comet Assay. , (2016).</li><li>Gerets, H. H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+primary+human+hepatocytes,+HepG2+cells,+and+HepaRG+cells+at+the+mRNA+level+and+CYP+activity+in+response+to+inducers+and+their+predictivity+for+the+detection+of+human+hepatotoxins.">Characterization of primary human hepatocytes, HepG2 cells, and HepaRG cells at the mRNA level and CYP activity in response to inducers and their predictivity for the detection of human hepatotoxins.</a> Cell Biology and Toxicology. 28, 69-87 (2012).</li><li>Sison-Young, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multicenter+assessment+of+single-cell+models+aligned+to+standard+measures+of+cell+health+for+prediction+of+acute+hepatotoxicity.">A multicenter assessment of single-cell models aligned to standard measures of cell health for prediction of acute hepatotoxicity.</a> Archives of Toxicology. 91, 1385-1400 (2017).</li><li>European Guidelines 2019. European Agency for Safety and Health at Work Available from: <a target="_blank" href="https://osha.europa.eu/en/safety-and-health-legislation/european-guidelines">https://osha.europa.eu/en/safety-and-health-legislation/european-guidelines</a> (2019)</li><li>Jensen, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+NANOGENOTOX+Dispersion+Protocol+for+NANoREG.">The NANOGENOTOX Dispersion Protocol for NANoREG.</a> European Union Grant Agreement n&#176; 2009. 21, 01 (2014).</li><li>Marchese, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aflatoxin+B1+and+M1:+Biological+Properties+and+Their+Involvement+in+Cancer+Development.">Aflatoxin B1 and M1: Biological Properties and Their Involvement in Cancer Development.</a> Toxins. 10, 214 (2018).</li><li>Rushing, B. R., Selim, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aflatoxin+B1:+A+review+on+metabolism,+toxicity,+occurrence+in+food,+occupational+exposure,+and+detoxification+methods.">Aflatoxin B1: A review on metabolism, toxicity, occurrence in food, occupational exposure, and detoxification methods.</a> Food and Chemical Toxicology. 124, 81-100 (2019).</li><li>Kermanizadeh, A., Brown, D. M., Moritz, W., Stone, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+importance+of+inter-individual+Kupffer+cell+variability+in+the+governance+of+hepatic+toxicity+in+a+3D+primary+human+liver+microtissue+model.">The importance of inter-individual Kupffer cell variability in the governance of hepatic toxicity in a 3D primary human liver microtissue model.</a> Scientific Reports. 9, 7295 (2019).</li><li>Berger, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+Liver+Cell+Models+Using+the+Basel+Phenotyping+Cocktail.">Comparison of Liver Cell Models Using the Basel Phenotyping Cocktail.</a> Frontiers in Pharmacology. 7, 443 (2016).</li><li>Ramaiahgari, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+3D+in+vitro+model+of+differentiated+HepG2+cell+spheroids+with+improved+liver-like+properties+for+repeated+dose+high-throughput+toxicity+studies.">A 3D in vitro model of differentiated HepG2 cell spheroids with improved liver-like properties for repeated dose high-throughput toxicity studies.</a> Archives of Toxicology. , (2014).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+affecting+the+in+vitro+micronucleus+assay+for+evaluation+of+nanomaterials.">Factors affecting the in vitro micronucleus assay for evaluation of nanomaterials.</a> Mutagenesis. 32 (1), 151-159 (2016).</li><li>Kirkland, D., Reeve, L., Gatehouse, D., Vanparys, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+core+in+vitro+genotoxicity+battery+comprising+the+Ames+test+plus+the+in+vitro+micronucleus+test+is+sufficient+to+detect+rodent+carcinogens+and+in+vivo+genotoxins.">A core in vitro genotoxicity battery comprising the Ames test plus the in vitro micronucleus test is sufficient to detect rodent carcinogens and in vivo genotoxins.</a> Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 721 (1), 27-73 (2011).</li><li>Curcio, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+transfer+and+metabolic+reactions+in+hepatocyte+spheroids+cultured+in+rotating+wall+gas-permeable+membrane+system.">Mass transfer and metabolic reactions in hepatocyte spheroids cultured in rotating wall gas-permeable membrane system.</a> Biomaterials. 28, 5487-5497 (2007).</li><li>Glicklis, R., Merchuk, J. C., Cohen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+mass+transfer+in+hepatocyte+spheroids+via+cell+viability,+spheroid+size,+and+hepatocellular+functions.">Modeling mass transfer in hepatocyte spheroids via cell viability, spheroid size, and hepatocellular functions.</a> Biotechnology and Bioengineering. 86, 672-680 (2004).</li><li>Asthana, A., Kisaalita, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtissue+size+and+hypoxia+in+HTS+with+3D+cultures.">Microtissue size and hypoxia in HTS with 3D cultures.</a> Drug Discovery Today. 17, 810-817 (2012).</li><li>Gaskell, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+functional+C3A+liver+spheroid+model.">Characterization of a functional C3A liver spheroid model.</a> Toxicology Research. 5, 1053-1065 (2016).</li><li>Cho, E. C., Zhang, Q., Xia, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+sedimentation+and+diffusion+on+cellular+uptake+of+gold+nanoparticles.">The effect of sedimentation and diffusion on cellular uptake of gold nanoparticles.</a> Nature Nanotechnology. 6, 385-391 (2011).</li><li>Hinderliter, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ISDD:+A+computational+model+of+particle+sedimentation,+diffusion+and+target+cell+dosimetry+for+in+vitro+toxicity+studies.">ISDD: A computational model of particle sedimentation, diffusion and target cell dosimetry for in vitro toxicity studies.</a> Particle and Fiber Toxicology. 7, 36 (2010).</li><li>Kramer, N. I., di Consiglio, E., Blaauboer, B. J., Testai, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biokinetics+in+repeated-dosing+in+vitro+drug+toxicity+studies.">Biokinetics in repeated-dosing in vitro drug toxicity studies.</a> Toxicology in vitro. 30, 217-224 (2015).</li></ol>

وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.

تختلف تطبيقات النماذج الكبدية ثلاثية الأبعاد بشكل كبير اعتمادا على نقطة النهاية الكيميائية الحيوية الخاصة أو مسار النتائج السلبية المستهدف. كل نموذج له فوائده وحدوده، من الاختلاف بين الدونور في الخلايا الكبدية البشرية الأولية (PHH) نماذج لخفض نشاط السيتوكروم P450 في النماذج القائمة على خط الخلية، ولكن كلها قيمة في حد ذاتها6،12،18،19. عند تقييم السمية الجينية هناك قيود في النماذج التوافق مع نقاط النهاية المعتمدة التنظيمية مثل المقايسة النووية الدقيقة في المختبر، كما هو مطلوب الانتشار النشط. وهذا ضروري، حيث يتطلب تقييم السمية الجينية تقييم كمية تلف الحمض النووي الثابت بعد انقسام الخلايا عندما تكون هناك فرصة لإصلاح الحمض النووي لتصحيح الآفات العابرة. لسوء الحظ، خلايا الكبد المتباينة للغاية (أي هيبارج) القائمة على كرويدات أو الخلايا المجهرية PHH، والتي تعتبر لإظهار الخصائص الأكثر صلة من الناحية الفسيولوجية تشبه الكبد تشكل نماذج ثابتة (غير التكاثرية)12،19،20. ونتيجة لذلك، يوفر نموذج كروية HepG2 ثلاثي الأبعاد المعروض هنا نموذجا بديلا مناسبا قادرا على دعم اختبار السمية الجينية. HepG2 الخلية خط القائم على كرويدات لديها ما يكفي من الخلايا تقسيم بنشاط على السطح الخارجي للسفيرويدات مع الحفاظ على خصائص أساسية تشبه الكبد، مثل إنتاج الألبومين واليوريا وبعض النشاط CYP4505،12،19. أساسا هذا النموذج في الكبد المختبر وقد وضعت لاستكمال المقايسة micronucleus، وهذا هو واحد من اثنين في المختبر المقايسات الموصى بها في البطارية لاختبار السمية الجينية8،10،11،21. ومع ذلك، يمكن تطبيق النموذج بسهولة على تحليل تسلسل الحمض النووي وتقنيات التعبير الجيني (RNA)، في حين أن لديه القدرة على زيادة تكييفه واستخدامه لنقاط نهائية أخرى لتلف الحمض النووي، مثل فحص المذنب. ومع ذلك، من المهم النظر في الدور الذي يلعبه تدخل ENM في بعض تحليلات نقاط النهاية. على سبيل المثال، قد لا تكون التحليلات المستندة إلى قياس التدفق الخلوي مناسبة لتقييم السمية الجينية ENM على وجه التحديد بسبب تداخل الجسيمات22.
أحد العوامل المقيدة لنماذج كروية تخضع بنشاط لتقسيم الخلايا هو حجمها. تحسين كثافة البذر أمر بالغ الأهمية حيث يجب أن يكون هناك ما يكفي من الخلايا التي تسمح للنموذج بالاستمرار في الانتشار؛ ولكن ليس عدد الخلايا عالية جدا، مما يؤدي إلى كروية تصبح مدمجة بشكل مفرط، مما يؤدي إلى زيادة النواة النخرية. ويعتقد أن سبب هذا النخر هو تقييد الأكسجين ونشر المواد الغذائية ، حيث يعتقد أن الحد الأقصى لهذا الانتشار هو حوالي 100 - 150 ميكرومتر من الأنسجة23،24. ومع ذلك، هذا يعتمد على نوع الخلية، رقم الخلية، التفاعلات سقالة وظروف الثقافة25. منذ ذلك الحين ، فقد ثبت أن قطرها حوالي 700 ميكرومتر هو الحد الأقصى لتجنب ظهور مبكر للنخر في وسط كرويدات C3A ، البذر 4000 خلايا HepG2 لكل كروية يضمن قطر النموذج في وقت التعرض هو ≤500 ميكرومتر26. وعلاوة على ذلك، أثبت شاه وآخرون أن خلايا HepG2 المصنفة فوق 5000 خلية لكل كروية أظهرت انخفاضا بنسبة 25٪ في الجدوى بعد 7 أيام في الثقافة، والتي يمكن أن تتعلق بمتوسط قطر 680 ميكرومتر والتوافر المحدود للمغذيات في قطرة معلقة 20 ميكرولتر5. للتغلب على ذلك ، يخضع النموذج الذي تم وضعه في البروتوكول الحالي لخطوة حاسمة حيث يتم نقل قطرة الشنق إلى آبار مغلفة ب agarose بعد التكوين الأولي للسفيرويد. وهذا يضمن وجود حجم أكبر من وسيط الثقافة للحفاظ على العدد المتزايد من الخلايا داخل كرويدات. ونتيجة لذلك، فإن نموذج كروية HepG2 لا يزال أكثر من 70٪ قابلة للحياة بعد 10 أيام في الثقافة ويمكن استخدامها لتقييم المخاطر على المدى الطويل في المختبر. 
في حين أن نموذج كروية HepG2 يمكن أن يدعم أنظمة التعرض الحادة والطويلة الأجل ، فإن متوسط ثقافة الخلايا المنعشة خلال فترات الثقافة الممتدة مقيد لهذا النموذج حيث لا ينصح باستبدال الوسط بالكامل بسبب الخسارة المحتملة للشفرات. ومن المفترض أنه مع التعرض ل ENM، فإن الميل إلى تشتت ENM متجانس للتكتجمعات والرواسب مرتفع. ومع ذلك، فمن الجدير بالذكر أن المعدل الذي يمكن أن تختلف به رواسب ENM اعتمادا على معلمات الجسيمات (على سبيل المثال، الحجم والشكل والكثافة) ويمكن تحديده نظريا باستخدام نموذج الترسيب في المختبر ونشره وقياس الجرعات (ISDD)، أو مشتقاته الحديثة، والتي يشار إليها غالبا عند اقتراب التعرض ل ENM (التعليق)من 27و28. مع هذا هو العقل, ومن المفترض أنه إذا كان فقط 50٪ من الخلايا ثقافة المتوسطة تتم إزالتها بعناية من سطح ثقافة الخلية, وينبغي تعطيل وإزالة لاحقة من جرعة ENM يكون الحد الأدنى من الناحية النظرية. ومع ذلك ، مع الحركة براونيان في اللعب ، وهذا قد لا يكون هو الحال تماما ، وينبغي القيام بمزيد من العمل في ترسب وترسب كل ENM معينة لاختبارها لضمان الاحتفاظ قياس الجرعات الصحيح في جميع أنحاء أنظمة التعرض على المدى الطويل27. وهذا أساسا قيد محتمل ينبغي النظر فيه عند تنفيذ نظم الزم المتكررة لأن ذلك يمكن أن يكون حاسما بالنسبة للتركيز النهائي المتراكم. التعرض على أساس المواد الكيميائية من ناحية أخرى، في حين لا يخلو من القيود الخاصة بهم للنظر، وتقديم نهج أكثر تبسيطا في أن المواد الكيميائية تميل إلى البقاء في الحل، وبالتالي استبدال مباشر للتركيز الكيميائي الأصلي بالإضافة إلى تركيز المضافة حديثا يضمن أن يتم استبدال أي مادة كيميائية فقدت خلال المرطبات وسائل الإعلام وفقا لذلك29. وتشمل التطبيقات المستقبلية تقييم مدى ملاءمة النموذج لنظم التعرض المتكررة على مدى فترات الثقافة الطويلة الأجل، حيث أن استراتيجيات التعاطي المتكررة ذات أهمية حاسمة لتقييم قدرة نظام عضوي معين على تحسين أو التغلب على الآثار الضارة، إن وجدت، الناجمة عن التراكم البيولوجي لمادة زينوبيوتية.
وفي الختام، فإن هذا النموذج الكبدي ثلاثي الأبعاد في المختبر لديه القدرة على الاستفادة منه لتقييم مجموعة من سيناريوهات التعرض الواقعية، وبالتالي توفير نهج مستقبلي في المختبر لدعم أفضل لكل من ENM وتقييم المخاطر الكيميائية بطريقة روتينية وسهلة الوصول إليها.

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61141/advanced-3d-liver-models-for-vitro-genotoxicity-testing-following">Advanced 3D Liver Models for In vitro Genotoxicity Testing Following Long-Term Nanomaterial Exposure</a>. The Representative Results section&#160;was updated.
Figure 6 in the Representative Results section was updated from:
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61141/61141fig6.jpg" />
to:
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61141/61141fig6v5.jpg" />
The fourth paragraph in the Representative Results section was updated from:
With the inevitable development of a necrotic core, a known limitation of 3D liver spheroid cultures, the viability of this HepG2 based model had to be established to demonstrate it was able to sustain long-term (5-10 day) exposure regimes whilst maintaining the proliferative capability required to support the micronucleus assay5. Indeed, this 3D liver spheroid model has been shown to retain &#62;70% viability over 10 days in culture. Based on this and in conjunction with the sustained liver-like functionality observed over the &#8805;14 day culture period, this 3D liver spheroid model can thus support long-term, repeated ENM exposure regimes up to 10 days long (i.e., before viability of the spheroids drop below 70%). For reference, it is advised that albumin levels for HepG2 spheroids seeded at 4000 cells/spheroid should be &#8805;0.06 mg/mL whilst urea production should be &#8805;0.4 ng/&#181;L before conducting an in vitro toxicological assessment with this model.
to:
With the inevitable development of a necrotic core, a known limitation of 3D liver spheroid cultures, the viability of this HepG2 based model had to be established to demonstrate it was able to sustain long-term (5-10 day) exposure regimes whilst maintaining the proliferative capability required to support the micronucleus assay5. Indeed, this 3D liver spheroid model has been shown to retain &#62;70% viability over 10 days in culture. Based on this and in conjunction with the sustained liver-like functionality observed over the &#8805;14 day culture period, this 3D liver spheroid model can thus support long-term, repeated ENM exposure regimes up to 10 days long (i.e., before viability of the spheroids drop below 70%). For reference, it is advised that albumin levels for HepG2 spheroids seeded at 4000 cells/spheroid should be &#8805;50.0&#160;ng/&#956;L whilst urea production should be &#8805;0.25&#160;ng/&#181;L before conducting an in vitro toxicological assessment with this model.

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61141/advanced-3d-liver-models-for-vitro-genotoxicity-testing-following">Advanced 3D Liver Models for In vitro Genotoxicity Testing Following Long-Term Nanomaterial Exposure</a>. The Representative Results section&#160;was updated.

Erratum: Advanced 3D Liver Models for In vitro Genotoxicity Testing Following Long-Term Nanomaterial Exposure

نظرا للتطور السريع والتنفيذ السريع لمجموعة متنوعة من المواد النانوية المهندسة (ENM) عبر عدد كبير من التطبيقات البشرية (مثل الطعام ومستحضرات التجميل والملابس والمعدات الرياضية والإلكترونيات والنقل والطب) ، فمن المحتم أن يتعرض البشر لENM على أساس منتظم. مع هذا، هناك مخاوف متزايدة من أن الرواية، وحجم الخصائص الفيزيائية الكيميائية المحددة التي تعتبر هذه المواد مفيدة في العديد من التطبيقات يمكن أن يسبب آثارا سلبية على صحة الإنسان والبيئة في الوقت المناسب. ويوجد حاليا العديد من الأنشطة الدولية التي تعكس بفعالية التعرض الأكثر أهمية من الناحية الفسيولوجية لهذه المعدات وتقييم السمية المحتملة لهذه المواد على سيناريوهات التعرض الحاد والطويل الأجل والمتكررة للجرعات المنخفضة.
السموم الكبدية هو المفتاح عند النظر في التعرض ENM، كما هو معروف على نطاق واسع أن الكبد هو موقع رئيسي لتراكم ENM بعد التعرض1،2. وعلاوة على ذلك، فإن الكبد هو الجهاز الأساسي لنظام التمثيل الغذائي وإزالة السموم من المواد التي تدخل الدورة الدموية الجهازية3. استنادا إلى الفهم المقبول بأن نماذج خلايا الكبد 2D لا تحاكي بدقة تعقيدات التفاعلات المعقدة متعددة الخلايا أو تمثل بشكل مناسب النشاط الأيضي الملاحظ في الجسم الحي ، فقد تم إنشاء تركيز أكبر على تطوير نماذج كبد 3D قوية و ذات صلة فسيولوجية في المختبر لتقنيات استبدال الجسم الحي4،5. إن استخدام تقنيات متطورة في مجال الثقافة ثلاثية الأبعاد يحسن من طول عمر النماذج الكبدية في المختبر مما يسمح بإجراء دراسة لأنظمة التعرض المتكررة على المدى الطويل. بالإضافة إلى ذلك، هذا الشكل ثقافة متقدمة يعزز تشكيل تعزيز الفسيولوجية، والميزات العضوية مثل canaliculi الصفراء، وعمليات النقل النشط وتحسين قدرات استقلاب المخدرات CYP450، وبالتالي تحسين التنبؤية للنماذج6. نماذج الكبد ثلاثية الأبعاد الحالية في المختبر التي تتكون من ثقافات أحادية (خلايا الكبد فقط) أو الثقافات المشتركة (خلايا الكبد مع الخلايا غير الحيوية) موجودة في عدة أشكال، بدءا من microtissues أو كرويات في لوحات التصاق فائقة التوهج، شنقا قطرة كرويدات، والخلايا جزءا لا يتجزأ من المصفوفات و / أو السقالات ومنصات ثقافة الخلايا microfluidic، وكلها تعتبر فعالة متقدمة في نماذج المختبر لتقييم السمية الكبدية6،7. ومع ذلك، فإن غالبية هذه النظم النموذجية هي صيانة عالية، وتتطلب معدات متخصصة ومكلفة. وعلاوة على ذلك، فإن هذه النماذج غالبا ما تكون ثابتة (أي نماذج الخلايا الناندية) التي تمنع استخدامها في تقييم نقاط نهاية الخطر، مثل اختبار السمية الجينية باستخدام أساليب تحدد حجم تلف الحمض النووي الثابت. السمية الجينية هي شرط أساسي في علم السموم التنظيمي ، وهو عنصر حيوي في تقييم المخاطر لأيمادة سامة 8. لا يوجد أي فحص واحد يمكن تطبيقه لتحديد جميع أشكال تلف الحمض النووي التي قد تنشأ بعد التعرض لعامل خارجي. ومع ذلك ، فإن المكون الأساسي لبطارية اختبار السمية الجينية في المختبر هو المقايسة النووية الدقيقة ، وهي تقنية موثوقة ومتعددة الأوجه تقيس الضرر الكروموسومي الإجمالي9. وهو تقنية معيار الذهب التي وصفها اختبار منظمة التعاون والتنمية في الميدان الاقتصادي المبدأ التوجيهي 487، لتقييم تلف الحمض النووي في المختبر والسمية الجينية وجزء من متطلبات بطارية الاختبار لتقييم المخاطر التنظيمية10،11.
يستخدم خط الخلية السرطانية الكبدية البشرية ، HepG2 ، على نطاق واسع لفحص تقييم المخاطر الأولي حيث أن الخلايا متاحة بسهولة ، وغير مكلفة نسبيا للمصدر ، وبسيطة للثقافة وقابلة لفحص الإنتاجية العالية12،13. عندما مثقف في الهياكل كروية 3D، وقد ثبت أن تلخيص البيئة الدقيقة الكبد بشكل جيد وتقديم نموذج كبدي مع قدرات الانتشار كافية لدعم المقايسة micronucleus3. 10- وقد أنشئ مزيد من التطوير لنماذج كروية HepG2 لتحسين طول العمر والأداء الوظيفي الشبيه بالكبد للنموذج من أجل دعم تقييم مخاطر السمية الجينية على مدى نظم التعرض المتكررة الطويلة الأجل (≤14 يوما). وهكذا، وتمشيا مع مبادئ 3Rs لاستبدال وتقليل وصقل التجارب على الحيوانات، تم وضع هذا البروتوكول لتوفير نموذج متقدم ثلاثي الأبعاد في المختبر الكبدي قادر على تقييم نقاط النهاية السمية المتعددة بشكل موثوق (على سبيل المثال، وظائف الكبد، (المؤيدة) علامات الالتهاب، السمية الخلوية والسمية الجينية) بعد التعرض الحاد والطويل الأجل والمتكرر للمواد الكيميائية وENM بطريقة روتينية وسهلة الوصول إليها.
هنا، نقدم طريقة لإنشاء خط خلايا كبدية ثلاثية الأبعاد ذات صلة من الناحية الفسيولوجية تستند إلى نظام نموذج المختبر لتقييم مخاطر السمية الجينية بعد التعرض الحاد أو الطويل الأجل ل ENM المتكرر. يمكن تقسيم البروتوكول إلى 6 مراحل رئيسية: زراعة خلايا HepG2 المبردة؛ وزراعة خلايا 10000000000000000000000000000000000000000000000000 إعداد كروية HepG2; نقل كروية HepG2 من إسقاط شنقا لتعليق agarose; حصاد كروية HepG2; المقايسة micronucleus والتهديف؛ وتحليل البيانات.

<table><tbody><tr><td>Aflotoxin B1</td><td>Sigma Aldrich, UK</td><td>A6636-5MG</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma Aldrich, UK</td><td>A9539-50G</td><td></td></tr><tr><td>Autoclave Tape</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BCG Albumin Assay</td><td>Sigma Aldrich, UK</td><td>MAK124</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin Powder</td><td>Sigma Aldrich, UK</td><td>A9418</td><td></td></tr><tr><td>Cell Freezing Aid</td><td>Thermo Fisher Scientific, UK</td><td>5100-0001 - Mr Frosty</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5810 R</td><td></td></tr><tr><td>Cytochalasin B</td><td>Merck, UK</td><td>250233</td><td></td></tr><tr><td>Cytology Metal Clips</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cytospin 4 Centrifuge</td><td>ThermoFisher Scientific, UK</td><td>CM00730202</td><td></td></tr><tr><td>DMEM with 4.5g/L D-Glucose, L-Glutamine</td><td>GIBCO, Paisley, UK</td><td>41965-039</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, phenol-red free with 4.5g/L D-Glucose, L-Glutamine with Hepes</td><td>GIBCO, Paisley, UK</td><td>21063-029</td><td></td></tr><tr><td>DPX Mounting Medium</td><td>FisherScientific, UK</td><td>D/5330/05</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>FisherScientific, UK</td><td>10048291</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>GIBCO, Paisley, UK</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>Filter Cards for Shandon Cytospin</td><td>FisherScientific, UK</td><td>15995742</td><td></td></tr><tr><td>Frosted Glass Slides</td><td>ThermoFisher Scientific, UK</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Giemsa&#039;s Stain Improved R66 Solution, Gurr</td><td>VWR Chemicals, UK</td><td>MFCD00081642</td><td></td></tr><tr><td>Glass Coverslips (24 x 60)</td><td>Deckglaser, VWR</td><td>ECN631-1575</td><td></td></tr><tr><td>Haemocytometer and Coverslip</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Immersion Oil for Microscope</td><td>Zeiss, UK</td><td>518F, ISO8034</td><td></td></tr><tr><td>Laminar Class II Tissue Culture Hood</td><td>Scanlaf Mars</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Light Microscope</td><td>Zeiss, UK</td><td>Axiovert 40C</td><td></td></tr><tr><td>Liquid Nitrogen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>FisherScientific, UK</td><td>10284580</td><td></td></tr><tr><td>Microwave</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Non-Filtered, Sterile 200&amp;micro;l and 1000&amp;micro;l Pipette tips</td><td>Greiner-Bio-One, UK</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NuncMicroWell 96-Well Microplates</td><td>ThermoFisher Scientific, Denmark</td><td>167008</td><td></td></tr><tr><td>P1000 and P200 micropipettes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>P300 and P50 multi-channel pipettes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS pH 7.4 1X, MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; and CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; Free</td><td>GIBCO, Paisley, UK</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>Pen/Strep</td><td>GIBCO, Paisley, UK</td><td>15140-122, Penicillin/Strepmyocin 100X or 10,000U/ml</td><td></td></tr><tr><td>Phosphatase Buffer Tablets</td><td>GIBCO, Paisley, UK</td><td>10582-013</td><td></td></tr><tr><td>Pipette Boy</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Simport Scientific CytoSep Funnels for Shandon Cytospin 4 Centrifuges</td><td>FisherScientific, UK</td><td>11690581</td><td></td></tr><tr><td>Sonifier SFX 550 240V CE 1/2&quot; - Probe</td><td>Branson, USA</td><td>101-063-971R</td><td></td></tr><tr><td>T-25 and T-75 Tissue Culture Flask</td><td>Greiner-Bio-One, UK</td><td>T-25 (690175) and T-75 (660175)</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue Solution</td><td>Sigma Aldrich, UK</td><td>T8154-100mL</td><td></td></tr><tr><td>Urea Assay Kit</td><td>Sigma Aldrich, UK</td><td>MAK006</td><td></td></tr><tr><td>Virkon Disinfectant</td><td>DuPont, UK</td><td>Rely+On Virkon</td><td></td></tr><tr><td>Water Bath (37?C)</td><td>Grant JBNova 18</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Weighing Balance</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Xylene</td><td>FisherScientific, UK</td><td>10588070</td><td></td></tr><tr><td>0.05% Trypsin-EDTA</td><td>GIBCO, Paisley, UK</td><td>5300-054</td><td></td></tr><tr><td>0.2mL and 1.0mL Eppendorf Tubes</td><td>Greiner-Bio-One, UK</td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.45&amp;micro;m Filter Unit</td><td>Millex HA, MF-Millipore, UK</td><td>SLHA033SS</td><td></td></tr><tr><td>1.0mL Syringe</td><td>BD Plastipak, FisherScientific, UK</td><td>300185</td><td></td></tr><tr><td>20mL LS Scintillation Glass Vials, 22-400 Foil Lined PP Caps</td><td>DWK Life Sciences GmbH, Germany</td><td>WHEA986581</td><td></td></tr><tr><td>37?C and 5% CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; ISO Class 5 Hepa Filter Incubator</td><td>NUAIRE DHD Autoflow</td><td></td><td></td></tr><tr><td>3mL Pasteur Pipette</td><td>Greiner-Bio-One, UK</td><td></td><td></td></tr><tr><td>50mL Conical Falcon Tubes</td><td>Greiner-Bio-One, UK</td><td></td><td></td></tr><tr><td>50mL or 100mL Glass Bottles</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50mL Skirted Falcon Tubes</td><td>Greiner-Bio-One, UK</td><td></td><td></td></tr><tr><td>5mL, 10mL and 25mL Pipettes</td><td>Greiner-Bio-One, UK</td><td></td><td></td></tr><tr><td>9.4cm Square, Petri Dish</td><td>Greiner-Bio-One, UK</td><td>688161</td><td></td></tr></tbody></table>

advanced 3d liver models for in vitro genotoxicity testing following long-term nanomaterial exposure

نظرا للتطور السريع والتنفيذ لمجموعة متنوعة من المواد النانوية المهندسة (ENM) ، فإن التعرض ل ENM أمر لا مفر منه وتطوير أنظمة اختبار قوية وتنبئية في المختبر أمر ضروري. علم السموم الكبدي هو المفتاح عند النظر في التعرض ENM، كما الكبد يخدم دورا حيويا في التوازن الأيضي وإزالة السموم، فضلا عن كونها موقعا رئيسيا لتراكم ENM بعد التعرض. وبناء على هذا والفهم المقبول بأن نماذج خلايا الكبد 2D لا تحاكي بدقة تعقيدات التفاعلات المعقدة متعددة الخلايا والنشاط الأيضي الملاحظ في الجسم الحي ، هناك تركيز أكبر على تطوير نماذج الكبد ثلاثية الأبعاد ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية المصممة لأغراض تقييم مخاطر ENM في المختبر. وتمشيا مع مبادئ 3Rs لاستبدال وتقليل وصقل التجارب على الحيوانات ، وقد تم تطوير نموذج الكبد 3D HepG2 خط الخلية القائمة ، وهو نظام سهل الاستخدام وفعالة من حيث التكلفة التي يمكن أن تدعم كل من نظم التعرض الموسعة والمتكررة ENM (≤14 يوما). تحتفظ هذه النماذج الكروية (قطرها ≥500 ميكرومتر) بقدرتها التكاثرية (أي تقسيم نماذج الخلايا) مما يسمح لها بالاقترن بمسيح النوى الدقيق "القياسي الذهبي" لتقييم السمية الجينية في المختبر بشكل فعال. وقد تميزت قدرتها على الإبلاغ عن مجموعة من نقاط النهاية السمية (مثل وظائف الكبد والاستجابة الالتهابية (المؤيدة) والسمية الخلوية والسمية الجينية باستخدام عدة تدابير تحديد النمس عبر كل من نظم التعرض الحادة (24 ساعة) وطويلة الأجل (120 ساعة). هذا النموذج الكبدي ثلاثي الأبعاد في المختبر لديه القدرة على الاستفادة منه لتقييم التعرض ل ENM أكثر واقعية ، وبالتالي توفير نهج مستقبلي في المختبر لدعم تقييم مخاطر ENM بشكل أفضل بطريقة روتينية وسهلة الوصول إليها.

تم تقييم مدى ملاءمة نموذج كروية الكبد ثلاثي الأبعاد القائم على خط الخلية للثقافة طويلة الأجل وتقييم المخاطر الجينية من خلال إجراء توصيف أساسي لتحديد صلاحية النموذج ووظائفه الشبيهة بالكبد على مدى 14 يوما في الثقافة بالإضافة إلى إمكانية تطبيقه على فحص الميكرونوكليوس.
التوصيف الأساسي لنموذج كرويد الكبد ثلاثي الأبعاد HepG2 قبل أي تقييم سمية في المختبر، من المهم التحقق من أن كرويدات HepG2 ثلاثية الأبعاد قد تشكلت بشكل صحيح قبل إجراء نقل الآغاروز أو العلاج الكيميائي/ENM. عادة ما تستغرق كرويات HepG2 المنتجة باستخدام طريقة الإسقاط المعلق 2 - 3 أيام بعد البذر (4000 خلية / كروية) لتشكيل كرويات صغيرة كروية الشكل يبلغ متوسط قطرها 495.52 ميكرومتر W × 482.69 ميكرومتر H كما هو موضح في الشكل 5A-5C. يجب أن يكون للشفرات HepG2 التي تشكلت بشكل صحيح ومقبولة لاستخدامها في التقييم السمية المختبرية هيكل صغير على شكل كروي مع سطح أملس ولا توجد إسقاطات بصرية. الشكل 5 يقدم أمثلة من نوعية جيدة (الشكل 5D -F) ونوعية رديئة (الشكل 5G-I) كرويدات. وينبغي التخلص من هذه الأخيرة. عادة، 90-95٪ من كرويات شكلت لكل لوحة سوف تشكل بشكل صحيح وتكون قابلة للحياة لمزيد من التجارب.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61141/61141fig5.jpg"> الشكل 5: صور المجهر الخفيفة التي تعرض مورفولوجيا الطبيعية للكرويدات HepG2 شكلت عن طريق طريقة إسقاط شنقا. (A-C) تظهر اليوم 2 و (D-I) اليوم 4 كرويدات الكبد HepG2 بعد البذر. (D-F) هي أمثلة على نوعية جيدة من كرويدات HepG2 بينما (G-I) يظهر كرويات سيئة التشكيل. تم التقاط جميع الصور على هدف X20 باستخدام المجهر. يمثل شريط المقياس 20 ميكرومتر. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61141/61141fig5large.jpg" target="_blank">الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
لمزيد من تأكيد قدرة هيب جي 2 على البقاء، يمكن إجراء فحص بروموبريسول الأخضر للألبومين (BCG) أو تقييم اليوريا لتقييم وظائفها الشبيهة بالكبد. تم تقييم وظائف تشبه الكبد بما يتماشى مع الجدوى باستخدام المقايسة استبعاد الأزرق تريبان على مدى فترة الثقافة 14 يوما لتحديد طول عمر نموذج كروية الكبد وتحديد ما إذا كان يمكن أن تدعم على المدى الطويل أو المتكرر ENM / تقييم المخاطر الكيميائية القائمة (الشكل 6). وظل تركيز الألبومين ثابتا طوال فترة الثقافة. إنتاج اليوريا يعرض زيادة في تركيز اليوريا المنتجة لكل كروية على مدى أسبوع في الثقافة قبل الوصول إلى هضبة بحلول اليوم 7. من المهم ملاحظة أن مستويات الألبومين واليوريا المنتجة في كرويات HepG2 ثلاثية الأبعاد أعلى بكثير من تلك التي لوحظت في نفس خط الخلية المستزرع في شكل 2D. في الواقع، كانت الثقافات 2D من خلايا HepG2، ذروة مستويات الألبومين واليوريا 0.001 ملغم / مل و 0.010 نانوغرام / ميكرولتر على التوالي. وعلاوة على ذلك، في العمل السابق الذي نشرته شاه وآخرون باستخدام نظام كروي HepG2 متطابقة تقريبا، والكتاب تسليط الضوء على تحسن ملحوظ في النشاط الأيضي (CYP1A1 و CYP1A2) في 3D HepG2 في أنظمة نموذج المختبر بالمقارنة مع خلايا 2D مثقف HepG25.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61141/61141fig6v5.jpg"> الشكل 6: بيانات توصيف خط الأساس لمدة 14 يوما ل كرويات الكبد HepG2. بعد نقل من قطرة شنقا،(أ)يسلط الضوء على جدوى نموذج كروية HepG2 على مدى فترة 14 يوما في حين (ب) و (ج) تسليط الضوء على وظائف الزلال واليوريا تشبه الكبد على التوالي. متوسط البيانات ± SEM المقدمة، n = 4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61141/61141fig6v5large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
مع التطور الحتمي لنواة نخرية ، وهو قيد معروف من ثقافات كروية الكبد ثلاثية الأبعاد ، كان لا بد من تأسيس صلاحية هذا النموذج القائم على HepG2 لإثبات أنه قادر على الحفاظ على أنظمة التعرض طويلة الأجل (5-10 أيام) مع الحفاظ على القدرة التكاثرية المطلوبة لدعم المقايسة الدقيقة5. في الواقع، وقد ثبت هذا النموذج كروية الكبد 3D للاحتفاظ > 70٪ الجدوى على مدى 10 أيام في الثقافة. وبناء على ذلك وبالتزامن مع الأداء الوظيفي المستمر الشبيه بالكبد الذي لوحظ خلال فترة الثقافة ≥14 يوما، يمكن لهذا النموذج الكروي للكبد ثلاثي الأبعاد أن يدعم أنظمة التعرض المتكررة ل ENM على المدى الطويل لمدة تصل إلى 10 أيام (أي قبل أن تنخفض صلاحية الكرويات إلى أقل من 70٪). كمرجع، ينصح بأن تكون مستويات الألبومين ل كرويدات HepG2 المصنفة في 4000 خلية /كروية ≥20.0 نانوغرام/ميكرولتر بينما يجب أن يكون إنتاج اليوريا ≥0.25 نانوغرام/ميكرولتر قبل إجراء تقييم سمية في المختبر مع هذا النموذج.
تقييم السمية الجينية للمواد النانوية المهندسة 10- وفيما يتعلق بتقييم السمية الجينية، استخدم المقايسة النووية الدقيقة لتحديد وجود النوى الدقيقة في أعقاب التعرض الحاد (24 ساعة) والتعرض الطويل الأجل (120 ساعة) للنواقص النمومية. أفلاتوشين B1 هو مادة مسرطنة معروفة للكبد16،17 وهو عنصر تحكم إيجابي موصى به لإجراء فحص النوى الدقيقة. وقد أظهرت تجارب التحسين أن 0.1 ميكرومتر من الفاتوشين B1 يحفز إيجابية كبيرة (≥2.0 أضعاف زيادة) استجابة جنوة في كرويدات الكبد 3D HepG2 وبالتالي يستخدم في كل المقايسة النويدات الدقيقة التي أجريت مع هذا النموذج. لضمان صحة نتائج فحص النويدات الدقيقة باستخدام نموذج كروية HepG2 ، يجب أن يقع تردد النوى الدقيق الخلفي لخلايا HepG2 المستخدمة في هذا النموذج ثلاثي الأبعاد في المختبر ضمن نطاق 0.6٪ - 1.2٪. ونتيجة لذلك، ينبغي أن يؤدي الفاتوكسيين B1 إلى استجابة سمية جينية أعلى مرتين على الأقل من تلك التي شوهدت مع السيطرة السلبية؛ وبالتالي، فإن 0.1 ميكرومتر من الفاتوكسيين B1 يجب أن تحفز تردد النوكل الدقيق بين 1.5٪ - 3.0٪. وباستخدام معلمات التحكم هذه، يمكن بعد ذلك تقييم السمية الجينية المرتبطة ب ENM في المختبر تقييما موثوقا به. استنادا إلى المبدأ التوجيهي 487 اختبار منظمة التعاون والتنمية في الميدان الاقتصادي، من المهم أن نلاحظ أنه عند اختبار ENM أو مادة كيميائية، والتركيزات المختارة لا ينبغي أن تحفز أكثر من 55٪ ± 5٪ السمية الخلوية (المشار إليها من خلال انخفاض في القيم CPBI أو RVCC فيما يتعلق بالسيطرة السلبية)11. ويوضح الشكل 7 البيانات التي تم توليدها عندما تم تقييم الأفلاتوكسيين B1 واثنين من ENMs (ثاني أكسيد التيتانيوم (TiO2)والشظية (Ag)) بعد التعرض الحاد والطويل الأجل في كرويدات HepG2 ، وتم تحليل إمكانات السمية الجينية اللاحقة باستخدام اختبار النوكلية الدقيقة. وقد تم اختبار كل من ENMs تقييمها في غير السموم، جرعة منخفضة من 5.00 ميكروغرام / مل على التعرض الحاد (24 ساعة) وطويلة الأجل (120 ساعة) نظام التعرض. ويمكن ملاحظة اتجاه مماثل للسمية الجينية عبر كل من TiO2 وAg ENMs ، حيث لم تكن الاستجابة المرتفعة للسمية الجينية التي نتجت عن التعرض لمدة 24 ساعة واضحة بعد التعرض لمدة 5 أيام على المدى الطويل. وكان هذا على الرغم من السمية الجينية المستمرة الناجمة عن السيطرة الإيجابية Aflatoxin B1 في كلتا النقطتين الزمنيتين.
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61141/61141fig7.jpg"> الشكل 7: تقييم السمية الجينية بعد التعرض TiO2 وAG ENM على كرويدات الكبد HepG2. تقييم السمية الجينية (تردد النويدات الدقيقة) باستخدام وظيفة المقايسة النووية الدقيقة(A)الحادة (24 ساعة) و(ب)التعرض طويل الأجل (120 ساعة) إلى 5.00 ميكروغرام / مل من TiO2 وAg ENM. السيطرة السلبية هي وسائل الإعلام فقط، في حين أن السيطرة الإيجابية هي 0.1 ميكرومتر من أفلاتوشين B1. متوسط البيانات (n=2) المقدمة ± SD. الأهمية المشار إليها فيما يتعلق بالتحكم السلبي: * = p≤ 0.05. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61141/61141fig7large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Advanced 3D Liver Models for In vitro Genotoxicity Testing Following Long-Term Nanomaterial Exposure at JoVE.com

Advanced 3D Liver Models for In vitro Genotoxicity Testing Following Long-Term Nanomaterial Exposure

وقد ثبت أن هذا الإجراء يستخدم لتطوير ثقافات كبدية ثلاثية الأبعاد متقدمة في المختبر، والتي يمكن أن توفر تقييما أكثر ملاءمة من الناحية الفسيولوجية للمخاطر الجينية المرتبطة بالتعرض للمواد النانوية على حد سواء على المدى الحاد أو الطويل، نظم الجرعة المتكررة.

نماذج متقدمة الكبد 3D لاختبار السمية الجينية في المختبر بعد التعرض للمواد النانوية على المدى الطويل

Due to the rapid development and implementation of a diverse array of engineered nanomaterials (ENM), exposure to ENM is inevitable and the development of ...

advanced-3d-liver-models-for-vitro-genotoxicity-testing-following

Research

JoVE Journal

Bioengineering

6.6K Views.  Swansea University Medical School. وقد ثبت أن هذا الإجراء يستخدم لتطوير ثقافات كبدية ثلاثية الأبعاد متقدمة في المختبر، والتي يمكن أن توفر تقييما أكثر ملاءمة من الناحية الفسيولوجية للمخاطر الجينية المرتبطة بالتعرض للمواد النانوية على حد سواء على المدى الحاد أو الطويل، نظم الجرعة المتكررة.

Video: Advanced 3D Liver Models for In vitro Genotoxicity Testing Following Long-Term Nanomaterial Exposure

Study of Viral Vectors in a Three-dimensional Liver Model Repopulated with the Human Hepatocellular Carcinoma Cell Line HepG2

This protocol describes the generation of a three-dimensional (3D) ex vivo liver model and its application to the study and development of viral vector systems. The model is obtained by repopulating the extracellular matrix of a decellularized rat liver with a human hepatocyte cell line. The model permits studies in a vascularized 3D cell system, replacing potentially harmful experiments with living animals. Another advantage is the humanized nature of the model, which is closer to human physiology than animal models.
In this study, we demonstrate the transduction of this liver model with a viral vector derived from adeno-associated viruses (AAV vector). The perfusion circuit that supplies the 3D liver model with media provides an easy means to apply the vector. The system permits monitoring of the major metabolic parameters of the liver. For final analysis, tissue samples can be taken to determine the extent of recellularization by histological techniques. Distribution of the virus vector and expression of the delivered transgene can be analyzed by quantitative PCR (qPCR), Western blotting and immunohistochemistry. Numerous applications of the vector model in basic research and in the development of gene therapeutic applications can be envisioned, including the development of novel antiviral therapeutics, cancer research, and the study of viral vectors and their potential side effects.

The recellularized extracellular matrix of a decellularized rat liver can be used as a humanized, three-dimensional ex vivo model to study the distribution and transgene expression of a virus or viral vector.

دراسة ناقلات فيروسية في الكبد نموذج إسكانها ثلاثي الأبعاد مع الخط خلية الإنسان سرطان الكبد HepG2

This protocol describes the generation of a three-dimensional (3D) ex vivo liver model and its application to the study and development of viral vector ...

Cancer Research

A Biomimetic Model for Liver Cancer to Study Tumor-Stroma Interactions in a 3D Environment with Tunable Bio-Physical Properties

Hepatocellular carcinoma (HCC) is a primary liver tumor developing in the wake of chronic liver disease. Chronic liver disease and inflammation leads to a fibrotic environment actively supporting and driving hepatocarcinogenesis. Insight into hepatocarcinogenesis in terms of the interplay between the tumor stroma micro-environment and tumor cells is thus of considerable importance. Three-dimensional (3D) cell culture models are proposed as the missing link between current in vitro 2D cell culture models and in vivo animal models. Our aim was to design a novel 3D biomimetic HCC model with accompanying fibrotic stromal compartment and vasculature. Physiologically relevant hydrogels such as collagen and fibrinogen were incorporated to mimic the bio-physical properties of the tumor ECM. In this model LX2 and HepG2 cells embedded in a hydrogel matrix were seeded onto the inverted transmembrane insert. HUVEC cells were then seeded onto the opposite side of the membrane. Three formulations consisting of ECM-hydrogels embedded with cells were prepared and the bio-physical properties were determined by rheology. Cell viability was determined by a cell viability assay over 21 days. The effect of the chemotherapeutic drug doxorubicin was evaluated in both 2D co-culture and our 3D model for a period of 72h. Rheology results show that bio-physical properties of a fibrotic, cirrhotic and HCC liver can be successfully mimicked. Overall, results indicate that this 3D model is more representative of the&#160;in vivo&#160;situation compared to traditional 2D cultures.&#160;Our 3D tumor model showed a decreased response to chemotherapeutics, mimicking drug resistance typically seen in HCC patients.&#160;

This protocol presents a 3D biomimetic model with accompanying fibrotic stromal compartment. Prepared with physiologically relevant hydrogels in ratios mimicking the bio-physical properties of the stromal extracellular matrix, an active mediator of cellular interactions, tumor growth and metastasis.

نموذج حيوي لسرطان الكبد لدراسة التفاعلات الورم ستروما في بيئة 3D مع خصائص بيو فيزيائية قابلة للتوابل

Hepatocellular carcinoma (HCC) is a primary liver tumor developing in the wake of chronic liver disease. Chronic liver disease and inflammation leads to a ...

Exploring Mitochondrial Energy Metabolism of Single 3D Microtissue Spheroids Using Extracellular Flux Analysis

Three-dimensional (3D) cellular aggregates, termed spheroids, have become the forefront of in vitro cell culture in recent years. In contrast to culturing cells as two-dimensional, single-cell monolayers (2D culture), spheroid cell culture promotes, regulates, and supports physiological cellular architecture and characteristics that exist in vivo, including the expression of extracellular matrix proteins, cell signaling, gene expression, protein production, differentiation, and proliferation. The importance of 3D culture has been recognized in many research fields, including oncology, diabetes, stem cell biology, and tissue engineering. Over the last decade, improved methods have been developed to produce spheroids and assess their metabolic function and fate.
Extracellular flux (XF) analyzers have been used to explore mitochondrial function in 3D microtissues such as spheroids using either an XF24 islet capture plate or an XFe96 spheroid microplate. However, distinct protocols and the optimization of probing mitochondrial energy metabolism in spheroids using XF technology have not been described in detail. This paper provides detailed protocols for probing mitochondrial energy metabolism in single 3D spheroids using spheroid microplates with the XFe96 XF analyzer. Using different cancer cell lines, XF technology is demonstrated to be capable of distinguishing between cellular respiration in 3D spheroids of not only different sizes but also different volumes, cell numbers,&#160;DNA content and type.
The optimal mitochondrial effector compound concentrations of oligomycin, BAM15, rotenone, and antimycin A are used to probe specific parameters of mitochondrial energy metabolism in 3D spheroids. This paper also discusses methods to normalize data obtained from spheroids and addresses many considerations that should be considered when exploring spheroid metabolism using XF technology. This protocol will help drive research in advanced in vitro spheroid models.

These protocols will help users probe mitochondrial energy metabolism in 3D cancer cell-line-derived spheroids using Seahorse extracellular flux analysis.

استكشاف استقلاب طاقة الميتوكوندريا من كرويات الأنسجة الدقيقة 3D واحدة باستخدام تحليل التدفق خارج الخلية

Three-dimensional (3D) cellular aggregates, termed spheroids, have become the forefront of in vitro cell culture in recent years. In contrast to culturing ...

A Combined 3D Tissue Engineered In Vitro/In Silico Lung Tumor Model for Predicting Drug Effectiveness in Specific Mutational Backgrounds

In the present study, we combined an in vitro 3D lung tumor model with an in silico model to optimize predictions of drug response based on a specific mutational background. The model is generated on a decellularized porcine scaffold that reproduces tissue-specific characteristics regarding extracellular matrix composition and architecture including the basement membrane. We standardized a protocol that allows artificial tumor tissue generation within 14 days including three days of drug treatment. Our article provides several detailed descriptions of 3D read-out screening techniques like the determination of the proliferation index Ki67 staining&#39;s, apoptosis from supernatants by M30-ELISA and assessment of epithelial to mesenchymal transition (EMT), which are helpful tools for evaluating the effectiveness of therapeutic compounds. We could show compared to 2D culture a reduction of proliferation in our 3D tumor model that is related to the clinical situation. Despite of this lower proliferation, the model predicted EGFR-targeted drug responses correctly according to the biomarker status as shown by comparison of the lung carcinoma cell lines HCC827 (EGFR -mutated, KRAS wild-type) and A549 (EGFR wild-type, KRAS-mutated) treated with the tyrosine-kinase inhibitor (TKI) gefitinib. To investigate drug responses of more advanced tumor cells, we induced EMT by long-term treatment with TGF-beta-1 as assessed by vimentin/pan-cytokeratin immunofluorescence staining. A flow-bioreactor was employed to adjust culture to physiological conditions, which improved tissue generation. Furthermore, we show the integration of drug responses upon gefitinib treatment or TGF-beta-1 stimulation - apoptosis, proliferation index and EMT - into a Boolean in silico model. Additionally, we explain how drug responses of tumor cells with a specific mutational background and counterstrategies against resistance can be predicted. We are confident that our 3D in vitro approach especially with its in silico expansion provides an additional value for preclinical drug testing in more realistic conditions than in 2D cell culture.

A Combined 3D Tissue Engineered In Vitro/In Silico Lung Tumor Model for Predicting Drug Effectiveness in Specific Mutational Backgrounds

We present a three-dimensional (3D) lung cancer model based on a biological collagen scaffold to study sensitivity towards non-small-cell-lung-cancer-(NSCLC)-targeted therapies. We demonstrate different read-out techniques to determine the proliferation index, apoptosis and epithelial-mesenchymal transition (EMT) status. Collected data are integrated into an in silico model for prediction of drug sensitivity.

والأنسجة المشتركة 3D هندسيا<em&gt; في المختبر</em&gt; /<em&gt; في السيليكو</em&gt; الرئة نموذج الورم للتنبؤ فعالية الدواء في خلفيات الطفرات محددة

In the present study, we combined an in vitro 3D lung tumor model with an in silico model to optimize predictions of drug response based on a specific ...

3D Microtissues for Injectable Regenerative Therapy and High-throughput Drug Screening

To upgrade traditional 2D cell culture to 3D cell culture, we have integrated microfabrication with cryogelation technology to produce macroporous microscale cryogels (microcryogels), which can be loaded with a variety of cell types to form 3D microtissues. Herein, we present the protocol to fabricate versatile 3D microtissues and their applications in regenerative therapy and drug screening. Size and shape-controllable microcryogels can be fabricated on an array chip, which can be harvested off-chip as individual cell-loaded carriers for injectable regenerative therapy or be further assembled on-chip into 3D microtissue arrays for high-throughput drug screening. Due to the high elastic nature of these microscale cryogels, the 3D microtissues exhibit great injectability for minimally invasive cell therapy by protecting cells from mechanical shear force during injection. This ensures enhanced cell survival and therapeutic effect in the mouse limb ischemia model. Meanwhile, assembly of 3D microtissue arrays in a standard 384-multi-well format facilitates the use of common laboratory facilities and equipment, enabling high-throughput drug screening on this versatile 3D cell culture platform.

This protocol describes the fabrication of elastic 3D macroporous microcryogels by integrating microfabrication with cryogelation technology. Upon loading with cells, 3D microtissues are generated, which can be readily injected in vivo to facilitate regenerative therapy or assembled into arrays for in vitro high-throughput drug screening.

ميكروتيسويس 3D للعلاج عن طريق الحقن بالتجدد وفحص المخدرات الفائق

To upgrade traditional 2D cell culture to 3D cell culture, we have integrated microfabrication with cryogelation technology to produce macroporous ...

The Dimethylnitrosamine Induced Liver Fibrosis Model in the Rat

Four to six week old, male Wistar rats were used to produce animal models of liver fibrosis. The process requires four weeks of administration of 10 mg/kg dimethylnitrosamine (DMN), given intraperitoneally for three consecutive days per week. Intraperitoneal injections were performed in the fume hood as DMN is a known hepatoxin and carcinogen. The model has several advantages. Firstly, liver changes can be studied sequentially or at particular stages of interest. Secondly, the stage of liver disease can be monitored by measurement of serum alanine aminotransferase (ALT) and aspartate aminotransferase (AST) enzymes. Thirdly, the severity of liver damage at different stages can be confirmed by sacrifice of animals at designated time points, followed by histological examination of Masson&#39;s Trichome stained liver tissues. After four weeks of DMN dosing, the typical fibrosis score is 5 to 6 on the Ishak scale. The model can be reproduced consistently and has been widely used to assess the efficacy of potential anti-fibrotic agents.

We describe a method to produce an animal model of liver fibrosis in the rat, and assess the degree of fibrosis by histological examination of the liver. The model can be used to study the development of liver disease as well as to test the efficacy of potential anti-fibrotic agents.

وDimethylnitrosamine المستحثة الكبد تليف النموذجي في الجرذ

Four to six week old, male Wistar rats were used to produce animal models of liver fibrosis. The process requires four weeks of administration of 10 mg/kg ...

Medicine

Human Liver Spheroids from Peripheral Blood for Liver Disease Studies

Human liver cells can form a three-dimensional (3D) structure capable of growing in culture for some weeks, preserving their functional capacity. Due to their nature to cluster in the culture dishes with low or no adhesive characteristics, they form aggregates of multiple liver cells that are called human liver spheroids. The forming of 3D liver spheroids relies on the natural tendency of hepatic cells to aggregate in the absence of an adhesive substrate. These 3D structures possess better physiological responses than cells, which are closer to an in vivo environment. Using 3D hepatocyte cultures has numerous advantages when compared with classical two-dimensional (2D) cultures, including a more biologically relevant microenvironment, architectural morphology that reassembles natural organs as well as a better prediction regarding disease state and in vivo-like responses to drugs. Various sources can be used to generate spheroids, like primary liver tissue or immortalized cell lines. The 3D liver tissue can also be engineered by using human embryonic stem cells (hESCs) or induced pluripotent stem cells (hiPSCs) to derive hepatocytes. We have obtained human liver spheroids using blood-derived pluripotent stem cells (BD-PSCs) generated from unmanipulated peripheral blood by activation of human membrane-bound GPI-linked protein and differentiated to human hepatocytes. The BD-PSCs-derived human liver cells and human liver spheroids were analyzed by light microscopy and immunophenotyping using human hepatocyte markers.

Here we present a non-genetic method to generate human autologous liver spheroids using mononuclear cells isolated from steady-state peripheral blood.

كرويات الكبد البشري من الدم المحيطي لدراسات أمراض الكبد

Human liver cells can form a three-dimensional (3D) structure capable of growing in culture for some weeks, preserving their functional capacity. Due to ...

Assembloid Technology: Pioneering Liver Development Research

In Vitro Cultivation Techniques for Modeling Liver Organogenesis, Building Assembloids, and Designing Synthetic Tissues using Human Cell Lines

Chronic liver disease has reached epidemic proportions, affecting over 800 million people globally. The current treatment, orthotopic liver transplantation, has several limitations. Promising solutions have emerged in the field of liver regenerative medicine, with liver organogenesis holding significant potential. Early liver organogenesis, occurring between E8.5 and 11.5, involves the formation of epithelial-mesenchymal interactions leading to morphogenesis, hepatic cord formation, and collective migration. However, there is a lack of methods for in vitro modeling of this process. In this study, a detailed series of methods is presented, enabling the modeling of various stages and aspects of liver organogenesis with human cell lines. In one method series, assembloid technology with hepatic (HEP) and mesenchymal (MES) spheroids are utilized, replicating early structures found in liver organogenesis, modeling early morphogenesis, and demonstrating interstitial cell migration as seen in vivo. These innovative assembloid systems help identify factors influencing assembloid formation and migration. HEP spheroid cultivation systems were also employed to model collective migration and branching morphogenesis. Mesenchymal-conditioned media (M-CM) plays a significant role in initiating dose-dependent branching migration. All presented methods were shown to be highly reproducible with a high success rate. By linking these events together, our work will enable recreating sequential, morphogenetic events to reverse engineer organogenesis in vitro and in vivo.

Organoids revolutionize personalized tissue modeling for organ development, drug discovery, and disease research. Organoid engineering advances into creating intricate synthetic tissues. The aim is to integrate morphogenesis, assembloid technology, and biomatrices to advance tissue engineering. This protocol aids in modeling liver organogenesis and establishing guidelines for synthetic tissue construction.

Chronic liver disease has reached epidemic proportions, affecting over 800 million people globally. The current treatment, orthotopic liver ...

DUCT: Double Resin Casting followed by Micro-Computed Tomography for 3D Liver Analysis

The liver is the biggest internal organ in humans and mice, and high auto-fluorescence presents a significant challenge for assessing the three-dimensional (3D) architecture of the organ at the whole-organ level. Liver architecture is characterized by multiple branching lumenized structures, which can be filled with resin, including vascular and biliary trees, establishing a highly stereotyped pattern in the otherwise hepatocyte-rich parenchyma. This protocol describes the pipeline for performing double resin casting micro-computed tomography, or &#34;DUCT&#34;. DUCT entails injecting the portal vein and common bile duct with two different radiopaque synthetic resins, followed by tissue fixation. Quality control by clearing one lobe, or the entire liver, with an optical clearing agent, allows for pre-screening of suitably injected samples. In the second part of the DUCT pipeline, a lobe or the whole liver can be used for micro-computed tomography (microCT) scanning, (semi-)automated segmentation, and 3D rendering of the portal venous and biliary networks. MicroCT results in 3D coordinate data for the two resins allowing for qualitative as well as quantitative analysis of the two systems and their spatial relationship. DUCT can be applied to postnatal and adult mouse liver and can be further extended to other tubular networks, for example, vascular networks and airways in the lungs.

Double resin casting micro-computed tomography, or DUCT, enables visualization, digitalization, and segmentation of two tubular systems simultaneously to facilitate 3D analysis of organ architecture. DUCT combines ex vivo injection of two radiopaque resins followed by micro-computed tomography scanning and segmentation of the tomographic data.

DUCT: الصب الراتنج المزدوج تليها التصوير المقطعي المحوسبة الدقيقة لتحليل الكبد 3D

The liver is the biggest internal organ in humans and mice, and high auto-fluorescence presents a significant challenge for assessing the ...

3D Imaging of the Liver Extracellular Matrix in a Mouse Model of Non-Alcoholic Steatohepatitis

Non-alcoholic steatohepatitis (NASH) is the most common chronic liver disease in the United States, affecting more than 70 million Americans. NASH can progress to fibrosis and eventually to cirrhosis, a significant risk factor for hepatocellular carcinoma. The extracellular matrix (ECM) provides structural support and maintains liver homeostasis via matricellular signals. Liver fibrosis results from an imbalance in the dynamic ECM remodeling process and is characterized by excessive accumulation of structural elements and associated changes in glycosaminoglycans. The typical fibrosis pattern of NASH is called &#34;chicken wire,&#34; which usually consists of zone 3 perisinusoidal/pericellular fibrosis, based on features observed by Masson&#39;s trichrome stain and Picrosirius Red stains. However, these traditional thin two-dimensional (2D) tissue slide-based imaging techniques cannot demonstrate the detailed three-dimensional (3D) ECM structural changes, limiting the understanding of the dynamic ECM remodeling in liver fibrosis.
The current work optimized a fast and efficient protocol to image the native ECM structure in the liver via decellularization to address the above challenges. Mice were fed either with chow or fast-food diet for 14 weeks. Decellularization was performed after in situ portal vein perfusion, and the two-photon microscopy techniques were applied to image and analyze changes in the native ECM. The 3D images of the normal and NASH livers were reconstituted and analyzed. Performing in situ perfusion decellularization and analyzing the scaffold by two-photon microscopy provided a practical and reliable platform to visualize the dynamic ECM remodeling in the liver.

The present protocol optimizes the liver in situ perfusion/decellularization and two-photon microscopy methods to establish a reliable platform to visualize the dynamics of extracellular matrix (ECM) remodeling during non-alcoholic steatohepatitis (NASH).

تصوير 3D لمصفوفة الكبد خارج الخلية في نموذج فأر لالتهاب الكبد الدهني غير الكحولي

Non-alcoholic steatohepatitis (NASH) is the most common chronic liver disease in the United States, affecting more than 70 million Americans. NASH can ...

نماذج متقدمة الكبد 3D لاختبار السمية الجينية في المختبر بعد التعرض للمواد النانوية على المدى الطويل

Summary

Explore More Videos

PLAYLIST