هذه البروتوكولات مهمة لأنها توفر خطوات مفصلة للتحقق من فاعلية وانتقائية مثبطات HAT الجديدة ، والتي هي أدوات بحثية مهمة وعلاجات محتملة. التقنيات التي أظهرت في هذا الفيديو هي سهلة لأداء وتوفير معلومات حول آثار مثبطات HAT على أستيل هينيستون العالمية والإقليمية. أنها تجعل من الممكن لفهم تنظيم اللاجينية للتعبير الجيني.
الاهتمام بالتفاصيل أمر بالغ الأهمية. من المهم اتباع البروتوكولات خطوة بخطوة. ابدأ بإعداد التفاعل الأنزيمي في حجم 10 ميكرولتر داخل أنبوب PCR 0.2 ملليلتر وفقًا لاتجاهات المخطوطة.
ثم احتضان خليط التفاعل الكامل في 30 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة في دورة حرارية PCR. وفي الوقت نفسه، إضافة اثنين mercaptoethanol بنسبة واحد إلى 10 إلى المخزن المؤقت عينة 6X SDS. إزالة عينات من دورة حرارية PCR وإضافة اثنين microliters من المخزن المؤقت عينة SDS المعدة إلى كل مزيج التفاعل.
سخني العينات إلى 95 درجة مئوية لمدة خمس دقائق على كتلة حرارية ثم تبرد على الجليد. تخزين العينات في ناقص 20 أو ناقص 80 درجة مئوية أو المضي قدما مع الكهرباء هلام ومناعة. البذور 100، 000 MCF-7 الخلايا في ملليلتر واحد من خلية ثقافة المتوسطة في كل بئر من لوحة 12-well والسماح للخلايا لتنمو إلى 80 إلى 90٪ التقاء.
عندما تصل الخلايا إلى الالتقاء المطلوب ، تتبخر متوسطة زراعة الخلية من الآبار أربعة وخمسة وستة ، وماصة ملليلتر واحد من ثلاثة ميكرومولار MS275 في المتوسط في كل بئر. ثم التعرق متوسطة ثقافة الخلية من الآبار واحد واثنين وثلاثة، وماصة ملليلتر واحد من DMSO المخفف في كل بئر. إعادة الخلايا إلى الحاضنة لمدة أربع ساعات للسماح لتراكم الهستونات الأسيتلات في الخلايا المعرضة لMS275.
في حين أن الخلايا هي احتضان، وإعداد التخفيف من A-485 في DMSO وفقا لتوجيهات المخطوطات. عند الانتهاء من الحضانة ، تعرق المتوسطة من الآبار وتضيف التخفيفات. إعادة الخلايا إلى الحاضنة وثقافتها لمدة 20 ساعة، ثم pirate الخلية ثقافة المتوسطة من الآبار وغسل الخلايا مع ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني.
التعرق في برنامج تلفزيوني وإضافة 100 ميكرولترات من العازلة التحلل السلبي. تخزين لوحة في ناقص 80 درجة مئوية بين عشية وضحاها. ماصة 100 ميكرولترات من كروماتين سونيكاتيد من الخلايا المعالجة مع DMSO إلى اثنين من أنابيب 1.5 ملليلتر، ثم ماص 400 ميكرولترات من 300 500 ميكرولترات من تخفيف هدحام ChIP إلى كل أنبوب لجعل حجم يصل إلى 500 ميكرولتر.
إزالة خمسة ميكرولترات من الحل من أحد الأنابيب وتخزينها في ناقص 20 درجة مئوية كمدخل DMSO. إعداد أنبوبين مع كروماتين سونيكاتيد من الخلايا المعالجة ب A-485 بنفس الطريقة. استخدم ماصة لإضافة الأجسام المضادة للأسيتيل IgG وH3K27 إلى عينات DMSO و A-485.
ثم إضافة 20 ميكرولترات من البروتين الخرز المغناطيسي لكل أنبوب، والتأكد من أن يتم resuspended الخرز بشكل جيد. تدوير العينات بين عشية وضحاها في أربع درجات مئوية. بيليه البروتين الخرز المغناطيسي باستخدام فاصل المغناطيسي وإزالة supernatant دون إزعاج الخرز.
غسل الخرز مع 500 ميكرولتر إلى ملليلتر واحد من انخفاض الملح غسل العازلة وتدويرها لمدة خمس دقائق في أربع درجات مئوية. أداء تدور سريعة إلى أسفل، بيليه الخرز مع فاصل المغناطيسي وإزالة supernatant. كرر إجراء الغسيل مع ارتفاع العازلة غسل الملح، كلوريد الليثيوم غسل العازلة، وتي العازلة.
بعد الغسيل مع المخزن المؤقت TE، وإزالة عينات المدخلات من الثلاجة ووضعها على الجليد. ذوبان aliquot من البروتينات K، ثم بيليه الخرز باستخدام فاصل المغناطيسي وإزالة العازلة TE من الخرز. إضافة 100 ميكرولترات من الحاجز chIP elution وميكروتير واحد من البروتينات K إلى كل عينة بما في ذلك عينات المدخلات واحتضان لهم مع اهتزاز في 62 درجة مئوية لمدة ساعتين باستخدام ثيركلوسير.
بعد الحضانة ، قم بتسخين العينات إلى 95 درجة مئوية لمدة 10 دقائق ، ثم تبريدها إلى درجة حرارة الغرفة. بيليه الخرز المغناطيسي مع فاصل المغناطيسي ونقل ناظر الحمض النووي التي تحتوي على أنبوب جديد 1.5 ملليلتر. تنقية الحمض النووي باستخدام مجموعة تنظيف PCR القياسية وتشغيل qPCR.
في المختبر استيتيل ترانسفيراز استيناس تم استخدام التحقيق في تأثير حمض الأناكارديك على نشاط p300 HAT نحو الركيزة حجر. تم اختبار نطاق تركيز ولم يتم إضافة أسيتيل-CoA إلى رد فعل التحكم السلبي. تم تحديد نتائج الناع بالمناعة مع ImageJ ، مما يظهر انخفاضًا واضحًا في الأسيتيل H3K18 و Acetyl H3K9 في 100 حمض anacardlar micromolar مقارنة بعنص تحكم DMSO.
في chromatin فرط acetylation اختبار تثبيط, علاج الخلايا MCF-7 مع HDACi MS275 بقوة أعلى من الأسيتيل من هيستون 3 على العديد من بقايا اللين. كانت المستويات القاعدية من الأسيتيل H3K18 وH3K27 الأسيتيل منخفضة، مما يدل على فوائد إضافة HDACi في مقايسة تشاي. إن إضافة A-485 في الخلايا المعالجة مسبقًا باستخدام MS275 يخفف من زيادة أستيل حجر الهيستون في H3K18 و H3K27، ولكن ليس H3K9.
كما تم تحديد نتائج مناعية كميا مع ImageJ. تم استخدام ChIP qPCR للتحقيق في آثار مثبطات HAT في العناصر التنظيمية الجينية التي تتحكم في التعبير عن الأوكوجيني. في عينة DMSO، أنتجت الحمض النووي التي عجلت بها الأجسام المضادة IgG التحكم قيمة أعلى Ct من الأجسام المضادة أسيتيل H3K27 في تفاعل qPCR لمروج Cyclin D1، مما يشير إلى أن التحكم غير محددة IgG عجلت أقل مجمعات هيوستون الحمض النووي من الأجسام المضادة H3K27 أسيتيل محددة في المروج.
مقارنة مع التحكم DMSO، A-485 خفض إثراء أسيتيل H3K27 في المروج D1 cyclin. الأهم من ذلك، A-485 هو معروف للحد بشكل كبير من أسيتيل H3K27 في الخلية. عند محاولة هذا البروتوكول، نضع في اعتبارنا أن الخطوات قبل الحضانة من في المختبر هات ومجايسات ChHAI ضرورية ويجب ألا تنسى.
من المهم أيضا أن نتذكر لحفظ عينات المدخلات وتجنب فقدان الخرز أثناء برنامج ChIP. بعد تنفيذ هذه الإجراءات، ChIP-seq هو طريقة إضافية التي يمكن تنفيذها للحصول على معلومات عالمية حول acetylation هيستون في العناصر التنظيمية للجينوم بأكمله. هذه البروتوكولات مفيدة للعلماء للتحقق بعناية من صحة مثبطات HAT الجديدة وتجنب نشر مسابير كيميائية منخفضة الجودة في الأدب.
يمكن أن تخضع مثبطات HAT التي تم التحقق من صحتها لمزيد من التطوير كعواد علاجية محتملة.
