وقد دعم هذا العمل منحة المعاهد الوطنية للصحة GM118085، وجزؤا من مؤسسة روبرت ويلش (منحة F-1811 إلى R.M.H.).

1. عزل المسوخ القامع في سلالات نقص الحركة
ملاحظة: استخدم هذا الأسلوب ك "catch-all" واسعة لتحديد الطبيعة العامة للعيب الحركة.
<ol><li>إعداد لوحة لينة أجار ملاحظة: لينة أجار، ويشار إليها أيضا باسم الحركة- أو السباحة أجار، هو agar نسبة منخفضة (~0.2-0.35٪ ث /v)، وتستخدم منذ فترة طويلة لاحصاء chemotaxis31،32.<ol>
<li>إضافة 3 غرام من باكتو أغار (0.3٪ ث / v) و 20 غرام من LB إلى قارورة أسفل جولة 2 L. إضافة 1 لتر من DDH2O (الماء المقطر المزدوج) إلى القارورة وخلط بالتساوي تعليق باستخدام قضيب اثارة ولوحة التحريك المغناطيسي.</li>
		<li>أوتوكلاف لمدة 20 دقيقة عند 121 درجة مئوية.</li>
		<li>السماح لتبرد مع التحريض لطيف باستخدام قضيب / لوحة على النحو الوارد أعلاه. عندما تصل درجة الحرارة إلى حوالي 50 درجة مئوية، صب 25 مل في أطباق بيتري العقيمة (100 مم × 15 ملم)، والسماح للأجار المنصهر لضبط مع غطاء في مكان لمدة 1 ساعة على الأقل، للاستخدام في غضون 16 ساعة.</li>
	</ol></li>
	<li>إعداد الثقافة والتلقيح وعزل المسوخ القامعة ملاحظة: E. القولونية تلقيح في وسط وسائل الإعلام الغنية بالمغذيات تتوطد مع أجار لينة تستهلك المواد الغذائية محليا، وخلق التدرج المغذيات التي يتبعونها. كما أنها تتحرك إلى الخارج، تعريف 'حلقات' تظهر(الشكل 1A)،والتي ترتبط الكيميائي محددة التراكتات البكتيريا تستجيب ل. يمكن أن العيوب في نظام chemotaxis أو المكونات الهيكلية للمحرك flagella المساس بالأداء في هذا المقايسة. في كثير من الأحيان ، تنشأ المسوخ ذات ميزة الحركة أثناء الفحص ، ويمكن رؤيتها تخرج من نقطة واحدة أو من نقاط متعددة على طول محيط الحلبة ، من حيث "توهج"(الشكل 1C). وسوف يلاحظ المرء أن الحافة الخارجية من جبهة السباحة يتناقض بسهولة ضد أجار الناعمة العذراء غير المنقوطة.<ol>
<li>تنمو الثقافات بين عشية وضحاها من سلالة الحركة الناقصة المطلوبة في 5 مل من مرق لينوكس (LB; 10 غرام / لتر تريبتوني, 5 غرام / لتر استخراج الخميرة, و 5 غرام / لتر NaCl, جدول المواد) في 30 درجة مئوية مع اهتزاز أفقي (220 r.p.m.). في اليوم التالي، والثقافة الفرعية (1:100 التخفيف) في LB الطازجة، وتنمو في ظل نفس الظروف إلى مرحلة الأسي (OD600 من 0.6).</li>
		<li>تلقيح 6 ميكرولتر من الثقافة في وسط لوحة لينة أجار (1.1) باستخدام ماصة، ودفع طرف عقيم محملة في أجار لطرد بلطف محتويات. نقل إلى 30 درجة مئوية واحتضان (الشكل 1B)، حتى حركية 'مشاعل' واضحة، المنبثقة من نقطة التطعيم أو محيط حلقات الحركة، وعادة في 24-36 ح (الشكل 1C). ملاحظة: في المقايسات الحركة، تلقيح سلالة من النوع البري جنبا إلى جنب مع عزل متحولة للمقارنة. هذه السلالة البرية من نوع سوف تظهر حلقات chemotactic متحدة المركز مميزة (الشكل 1A) وملء لوحة في غضون 8-10 ساعة.</li>
		<li>استخدام حلقة سلكية معقمة لرفع الخلايا من منطقة "مضيئة" وشرائط لتنقية مستعمرات واحدة على لوحة أجار الصلب LB (LB أعدت على النحو الوارد أعلاه، توطدت مع 15 غرام / لتر bacto-أغار).</li>
		<li>اختيار مستعمرات واحدة من لوحة خط باستخدام حلقة سلك عقيم وإعادة تنقية عن طريق streaking لمستعمرات واحدة لضمان عزل مستعمرة "نقية".</li>
	</ol></li>
	<li>تأكيد وتوصيف المسوخ القامعة
	<ol>
<li>تأكد من أن متحولة القامع المعزولة (ق) قد استعادت الحركة. إعداد لوحات لينة أجار (1.1)، والثقافات لسلالات من الاهتمام (كما هو الحال في 1.2.1)، بما في ذلك البرية من نوع وبدء 'الحركة ناقصة' سلالة للمقارنة.</li>
		<li>تلقيح الصفائح (كما في 1.2.2) واحتضان في 30 درجة مئوية لمدة 8-10 ساعة.</li>
		<li>تسجيل قطر الحلقة الخارجية (حافة الدائرة) ومقارنة لتحديد أي من العزلات قد استعادت إلى حد كبير الحركة. ملاحظة: يوصى بتصوير اللوحات طوال الدورة الزمنية للتجربة. للحصول على أفضل النتائج، استخدم جهاز "دلو الضوء"30، حيث يتم تركيب كاميرا رقمية فوق مصدر ضوء لتحسين الإضاءة لقياس قطر مستعمرة السباحة وتمييزها عن أجار غير المكتونة.</li>
		<li>يتم التحقق من عزل الموضوع إلى WGS كما هو مطلوب ، مما يسمح ب "تغطية تسلسلية" كافية لتحديد الطفرات التي أعادت وظيفة النوع البري بشكل إيجابي.</li>
	</ol></li>
</ol>2. تحديد السلوك الحركي flagella عن طريق الربط الخلية
ملاحظة: استخدم هذا الأسلوب عندما يظهر سلوك التشغيل-tumble العادي (chemotaxis) للخطر.
<ol><li>
إعداد الثقافة والقص flagella
	<ol>
<li>إعداد ثقافة المرحلة الأسية لسلالة الاهتمام كما هو موضح في الخطوة 1.2.1.</li>
		<li>بيليه 10 مل من الخلايا عن طريق الطرد المركزي في 2000 × ز لمدة 3 دقائق قبل إعادة تعليق في 10 مل من العازلة حركية مرشح معقمة (MB; 10 م ص البوتاسيوم الفوسفات العازلة [0.0935 M K2HPO4، 0.0065 M KH2PO4، درجة الحموضة 7.0] ، 0.1 mM EDTA [درجة الحموضة 7.0] ، 10 MM NaCl ، 75 mM KCl). ملاحظة: MB يدعم الحركة، ولكن لا يدعم النمو البكتيري</li>
		<li>كرر الخطوة 2.1.2 مرتين أخريين قبل إعادة تعليق بيليه النهائي في 1 مل من ميغابايت.</li>
		<li>نقل تعليق الخلية إلى حقنة 1 مل وإرفاق إبرة 23G حتى النهاية. تجميع جهاز حقنة / إبرة متطابقة وإرفاق اثنين معا عن طريق 6 بوصات من أنابيب البولي ايثيلين (القطر الداخلي من 0.58 ملم) مغمد بإحكام على كل طرف إبرة.</li>
		<li>القص flagella (فهي هشة وكسر بسهولة) عن طريق تمرير بلطف تعليق الخلية ذهابا وإيابا من حقنة واحدة إلى أخرى 50x، مع توقف 1 دقيقة بين كل 10 يمر.</li>
		<li>الطرد المركزي الخلايا المقص في 2000 س ز لمدة 3 دقائق وإعادة الإنفاق في حجم نهائي قدره 500 ميكرولتر من ميغابايت.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
إعداد الشرائح وربط الخلايا
	<ol>
<li>إعداد غرفة تثبيت الخلية عن طريق التراص 18 ملم × 18 مم coverslip على 3 بوصة × 1 بوصة × 1 مم الزجاج مجهر الشريحة، مفصولة شريط على الوجهين(الشكل S1).</li>
		<li>اغسل الغرفة بحل بولي ليسين بنسبة 0.01٪ (ث/v) من خلال تطبيقها على الجزء العلوي من الغرفة. إمالة الحافة السفلية (تدفق الأغطية مع شريحة المجهر) على ممسحة مهمة (ورقة الأنسجة) للمساعدة في رسم الحل من خلال الغرفة(الشكل S1). ثم احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقيقة.</li>
		<li>غسل الغرفة ثلاث مرات مع 40 ميكرولتر من ميغابايت باستخدام كما هو موضح في الخطوة 2.2.2</li>
		<li>أضف 40 ميكرولتر من تعليق الخلية المقص (المعد أعلاه) إلى أعلى الغرفة واحتضنه في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق للسماح للخلايا بالتعلق بالزلاقة.</li>
		<li>قم بتدفق الغرفة برفق مع 40 ميكرولتر من ميغابايت كما هو الحال في 2.2.3 لإزالة الخلايا غير المرتبطة.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
تسجيل دوران الخلية وتحديد كميتها
	<ol>
<li>نقل الشريحة المجهر محملة الخلايا المربوطة إلى مرحلة المجهر.</li>
		<li>باستخدام المجهر على النقيض من المرحلة وهدف 100x ، مسح السكان للخلايا التي يتم إصلاحها في مكانها ، وتناوب على محور واحد ، أي تناوب سلس على نقطة ثابتة بدلا من تقديم في زاوية حيث تتحرك الخلية داخل وخارج التركيز(فيديو 1).</li>
		<li>استخدام المجهر التجاري والكاميرا المرتبطة بها. افتح البرنامج المرتبط، وتأكد من أن الخلايا ذات الاهتمام هي في التركيز وانقر فوق الحصول على الفيديو لتسجيل دوران الخلية لمدة دقيقة واحدة (بمعدل 10 إطارات في الثانية أو أعلى).</li>
		<li>من تشغيل الفيديو، قم بتحديد عدد الدورانات الكاملة في الدقيقة وعدد المرات التي تغير الخلية اتجاهها (تبديل التردد). ملاحظة: قد تكون سرعات الدوران وتردد التبديل سريعين جدا لقياسها بالعين لذلك يوصى باستخدام برامج الفيديو التي توفر تشغيلا بطيءا / دقيقا ، أو تعتمد نظاما برمجيا آليا لتحديد أنماطالدوران 33. والبديل هو زيادة لزوجة ميغابايت باستخدام السليلوز الميثيل (أو وكيل مماثل) للمساعدة في إبطاء وحل دوران البكتيريا أسرع أو تعويض عندما الكاميرات مع انخفاض framerates قيد الاستخدام.</li>
		<li>كرر الخطوة 2.3.2 مع التكرارات البيولوجية لتجميع تمثيل السكان من الفائدة.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. إعداد أسراب في عملية فحص عبور الحدود
ملاحظة: استخدم هذه الطريقة لتقييم تأثير طفرة أو حالة على الحركة الجماعية. سرب أغار يشير إلى أجار حيث النسبة المئوية عادة ما تكون أعلى من تلك الناعمة أجار. في أجار لينة (0.3٪)، تسبح الخلايا بشكل فردي داخل أجار. في سرب أجار (0.5٪ وما فوق)، تتحرك الخلايا كمجموعة على السطح. في حين يجب استخدام لوحات سرب كما هو مفصل هنا، لوحات السباحة لها عمر أطول الرف، ويمكن استخدامها لعدة أيام. تفضيلنا الشخصي هو استخدام في 1-2 أيام.
<ol><li>
إعداد سرب أجار
	<ol>
<li>إضافة 5 غرام من إيكن أغار (0.5٪ ث / v) و 20 غرام من LB إلى قارورة أسفل جولة 2 L. إضافة 1 لتر من DDH2O إلى القارورة وخلط بالتساوي تعليق باستخدام قضيب اثارة ولوحة التحريك المغناطيسي.</li>
		<li>أوتوكلاف لمدة 20 دقيقة عند 121 درجة مئوية.</li>
		<li>السماح لتبرد مع التحريض لطيف لتجنب أي فقاعات الهواء باستخدام قضيب / لوحة على النحو الوارد أعلاه. عند حوالي 50 درجة مئوية، أضف الجلوكوز المعقم للفلتر لتركيز نهائي قدره 0.5٪.</li>
		<li>صب 25 مل في أطباق بيتري العقيمة (100 ملم × 15 ملم) والسماح لتعيين في درجة حرارة الغرفة لمدة 14 ساعة على الأقل وليس أكثر من 20 ساعة. لا تخزن للاستخدام في المستقبل.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
تلقيح واحتضان لوحات سرب
	<ol>
<li>تلقيح 6 ميكرولتر من ثقافة منتصف الأسي (أعدت كما هو الحال في 1.2) عن طريق اكتشاف على رأس أجار.</li>
		<li>اترك الغطاء لمدة 5-10 دقائق واستبدله عندما يجف ال inoculum إلى سطح أجار.</li>
		<li>حضانة عند 30 درجة مئوية لمدة 8 ساعة. تجنب إغراء لفحص التقدم سرب عن طريق إزالة الغطاء، وهذا سوف يسهم في تجفيف أجار وضعف يحتشدون. ملاحظة: قد يختلف وقت الحضانة حسب النمط الظاهري للإجهاد. قد تعوق بعض الطفرات المعزولة القدرة على الاحتشاد وستتطلب نسبة أقل من أجار أو فترة حضانة أطول.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
إعداد لوحات المقايسة لعبور الحدود ملاحظة: يستخدم هذا المقايسة طبق Petri معدل، حيث يقوم قسمة بلاستيكية (حدود) بإنشاء حجرتين، بدلا من غرفة واحدة(الشكل 2A). يمكن إعداد كل غرفة بشكل مستقل عن الأخرى ، مما يوفر ظروفا مختلفة للحشد ، قبل "ربط" الاثنين. اعتمادا على التصميم التجريبي، يمكن إعداد الغرفة الأولى (المعينة إلى اليسار) إما مع أجار السباحة (0.3٪ ث / v) أو سرب أجار (0.5٪ ث / الخامس) من حيث يمكن للبكتيريا الهجرة عبر الحدود إلى الغرفة اليمنى التي تحتوي على سرب أجار +/- أي ملحق المطلوبة أو التحدي (على سبيل المثال، المضادات الحيوية). عادة ما يتم قياس الهجرة على أي من أجار / مقارنة عن طريق تسجيل أوسع قطر من الاستعمار البكتيري (من الحافة إلى الحافة) من النقطة الأصلية للتلقيح.<ol>
<li>إعداد أجار السباحة كما هو موضح في 1.1 إذا لزم الأمر.</li>
		<li>إعداد سرب أجار كما هو موضح في 3.1.</li>
		<li>صب ~ 30 مل من أجار سرب (مع مكملات المطلوب إذا لزم الأمر) في الغرفة اليمنى من طبق بيتري مزدوجة المقصورة (100 ملم × 15 ملم)، لدرجة أنه هو مستوى مع مقسم البلاستيك بين الغرف، ولكن لا تفيض في اليسار(الشكل 2B).</li>
		<li>بعد أن تصلب أجار، وملء الغرفة اليسرى مع ~ 30 مل من السباحة أو سرب أجار، مرة أخرى إلى نقطة الاتصال مع الفجوة البلاستيكية(الشكل 2C). قبل أن يحدد، استخدم طرف ماصة معقمة لسحب بلطف أجار عبر الحدود لربط الجانبين مع جسر أجار طويل القامة ~ 1 ملم الذي يمتد على طول الفجوة(الشكل 2D).</li>
		<li>السماح للطبق لتجف في درجة حرارة الغرفة (3.1). ملاحظة: طريقة بديلة لإنشاء جسر هو السماح للغار الغرفة اليسرى لتجف ثم ماصة ببطء ~ 100 ميكرولتر من أجار سرب المنصهر على طول المقسم البلاستيك لسد الغرفتين (3.4). تلقيح لوحات على الغرفة اليسرى كما هو مفصل أعلاه للسباحة (1.2.2) أو سرب (3.2) أجار، قبل احتضان في 30 درجة مئوية لمدة 12-16 ساعة، أو حتى أسراب حققت تقدما كافيا على الغرفة اليمنى للسماح بإجراء مقارنات بين سلالات الاهتمام.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.

وقد ساهم عزل وتوصيف الطفرات القامعة بنجاح في تحديد المكونات الرئيسية لنظام chemotaxis35،36،37، وكذلك الآلات الحركية نفسها38،39،40. 11- ومن المهم، أثناء استخدام البروتوكول 1، إدراج نسخ متماثلة مستق...

البكتيريا تستخدم العديد من الزوائد للحركة والتشتت في منافذها الإيكولوجية1. حركية Flagella يحركها هو أسرع من هذه، وتعزيز استعمار محلى مواتية استجابة للإشارات البيئية، والمساهمة بشكل كبير في القدرة المسببة للأمراض من بعض الأنواع2،3. يمكن للبكتيريا flagellated السباحة بشكل فردي في السائل السائبة، أو سرب كمجموعة على سطح شبه صلب4. يلتصق flagella خارج الخلية بمحركات دوارة مضمنة في الغشاء ويقودها ، والتي تسخر قوة تدرجات الأيونات لتوليد عزم الدوران الذي يسبب الدوران1،2،4،5،6،7،8. في الإشريكية القولونية، التي تعمل محركاتها بعزم دوران ثابت9، يمكن تصنيف إخراج المحرك من حيث سرعة الدوران وتبديل الدوار بين اتجاه عكس اتجاه عقارب الساعة (CCW) واتجاه عقارب الساعة (CW). يعزز دوران اتفاقية الأسلحة التقليدية تشكيل حزمة flagellar متماسكة تدفع الخلية إلى الأمام (تشغيل) ، في حين أن التبديل العابر في اتجاه الدوران (CW) يتسبب في تفكيك الحزمة إما جزئيا أو كليا10، والخلية لإعادة توجيه اتجاه السباحة (تعثر). E. القولونية تشغيل عادة لثانية واحدة وتعثر لمدة عشر من الثانية. يتم التحكم في تبديل تردد الدوار أو "التحيز المتعثر" من خلال نظام الإشارات chemotaxis ، حيث تكتشف مستقبلات الشيمورسيبتس العابرةmembrane الإشارات الكيميائية الخارجية وتنقلها عبر الفوسفوريلاي إلى محرك flagellar لتمديد الأشواط استجابة للمجذبات ، أو قمعها استجابة للمواد الكيميائية السامة11،12. يتم فحص حركة السباحة في أجار ناعم بنسبة 0.3٪.
أثناء يحتشدون، البكتيريا التنقل على سطح شبه صلب كمجموعة كثيفة، حيث حزم من البكتيريا تيار في حركة الدوامةالمستمرة 2،13،14،15. E. أسراب القولونية المعرض تغيير علم وظائف الأعضاء chemosensory (انخفاض التحيز تعثر), سرعات أعلى, وارتفاع التسامح مع مضادات الميكروبات على الخلايا السباحة في السائل السائب16,17. أسراب تختلف في نشرها لعدد كبير من الاستراتيجيات التي تساعد على الحركة، بما في ذلك إنتاج السطحي، فرط التضخم، وإطالة الخلية2. يحتشدون يقدم البكتيريا ميزة تنافسية في كل من الإيكولوجية والإعداداتالسريرية 18،19،20. هناك فئتان من البكتيريا يحتشدون: أسراب المعتدلة، والتي يمكن أن سرب فقط على وسائل الإعلام توطدت مع 0.5-0.8٪ أجار، وأسراب قوية، والتي يمكن التنقل عبر تركيزات أجار أعلى21.
توجد مجموعة متنوعة من المقايسات لاستجواب حركة السباحة وتنظيمها. عندما تضعفها الطفرات أو الظروف البيئية ، فإن الحركة نفسها تقدم مجموعة قوية لتحديد طفرات القامع لكسب الوظيفة. يمكن أن تكون هذه القامعات عودة حقيقية للطفرة الأصلية ، أو العودة الزائفة ، حيث تستعيد الطفرة الثانية الوظائف. ويمكن تحديد هذه المسوخ من خلال تسلسل الجينوم كله (WGS). البديل لاختيار القامع غير المتحيز هو استراتيجية الطفرات المستهدفة المتحيزة (على سبيل المثال ، تولد الطفرات PCR). وغالبا ما تسلط هذه المنهجيات الضوء على وظيفة جهاز الحركة أو تنظيمه البيئي. إذا كان الهدف هو دراسة الوظيفة الحركية ، فإن استعادة الحركة البرية كما تقاس بالنعومة قد لا تشير بالضرورة إلى استعادة إخراج المحرك البري. يمكن أن يكون المقايسة التي تربط الخلايا، والتي يتم فيها ربط الخلايا بسطح زجاجي بواسطة علم واحد ويتم رصد دوران جسم الخلية لاحقا، هي المقايسة الأولية للاختيار لتقييم السلوك الحركي. على الرغم من أن أكثر منهجيات متطورة متاحة الآن لرصد خصائص المحرك، المطلوبة عالية السرعة الكاميرا انشاء وتطبيق حزم البرمجيات لتحليل الحركة تحد من استخدامها على نطاق واسع22،23،24،25. يتطلب الفحص ربط الخلية فقط أن يتم قص flagella ، مما يسمح بتعلق خيوط قصيرة إلى شريحة زجاجية ، تليها تسجيل فيديو دوران جسم الخلية. على الرغم من أن السرعات الحركية المسجلة منخفضة في هذا المقايسة بسبب الحمل العالي الذي يمارسه جسم الخلية على flagellum ، إلا أن هذا الفحص ساهم مع ذلك في رؤى قيمة في الاستجابات الكيميائية26و27و28و29، ولا يزال أداة تحقيق صالحة كما هو موضح أدناه.
تشكل الحركة المحتشدة مجموعة مختلفة من التحديات للباحثين. اختيار القامع كسب وظيفة يعمل فقط في أسراب التي تنتج السطحي وفيرة وسرب بسهولة13. السطحية غير المنتجين مثل كولاي هي fastidious فيما يتعلق باختيار أجار، وتكوين وسائل الإعلام والرطوبة للبيئة2،13،14،21. وبمجرد تهيئة الظروف المحتشدة، فإن المقايسة17 لعبور الحدود هي منهجية مفيدة لاستجواب قدرة سرب على التنقل في ظروف جديدة/قاسية. على الرغم من أن البروتوكولات المعروضة أدناه تتعلق بالإشريكية القولونية، إلا أنه يمكن تكييفها بسهولة للتطبيق في الأنواع الأخرى.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Reagents&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bacto Dehydrated Agar</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0140-15-4</td><td></td></tr><tr><td>EDTA Disodium Salt, Dihydrate</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-002-786</td><td></td></tr><tr><td>Eiken agar</td><td>Eiken Chemical Co. Japan</td><td>E-MJ00</td><td>Essential for E. coli swarming</td></tr><tr><td>Glucose D (+)</td><td>Fisher Scientific</td><td>410955000</td><td></td></tr><tr><td>LB (Lennox) Broth</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1427-500</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-lysine Solution (0.1%)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8920</td><td></td></tr><tr><td>Potassium chloride (KCl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>18-605-496</td><td></td></tr><tr><td>Potassium Phosphate monobasic (KH2PO4)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP362-500</td><td></td></tr><tr><td>Potassium Phosphate dibasic (K2HPO4)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP363-500</td><td></td></tr><tr><td>Sodium chloride (NaCl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271-500</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Materials and Equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CellSense microscope imaging software (V. 1.6)</td><td>Olympus</td><td></td><td>Or equivalent software for microscope used</td></tr><tr><td>Electron Microscopy Sciences Scotch 666 Doube Sided Tape</td><td>Fisher</td><td>50-285-28</td><td></td></tr><tr><td>Frosted microscope slides 3x1x1mm</td><td>Fisher</td><td>12-550-343</td><td></td></tr><tr><td>Olympus BX53 microscope</td><td>Olympus</td><td>BX53</td><td>Any upright or inverted phase microscope can be used</td></tr><tr><td>Petri dishes (100 mm diameter)</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875712</td><td>For soft-agar assays</td></tr><tr><td>Polyethylene Nebulizer Capillary Tubing (0.58mm x 99mm 3.0m)</td><td>Perkin Elmer</td><td>9908265</td><td></td></tr><tr><td>Round Petri Dish with 2 Compartments</td><td>VWR</td><td>89200-944</td><td>For border-crossing assays</td></tr><tr><td>Safety Hypodermic Needles (23G)</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-826A</td><td></td></tr><tr><td>Sterile Syringe - 1 mL</td><td>Fisher scientific</td><td>14-955-450</td><td></td></tr><tr><td>Task/Tissue wipes</td><td>Fisher scientific</td><td>06-666</td><td>Or equivalent single use tissue wipes</td></tr><tr><td>VWR micro cover-glass 18x18mm</td><td>VWR</td><td>48366205</td><td></td></tr><tr><td>XM10 camera</td><td>Olympus</td><td>XM10</td><td>Or equivalent microscope camera</td></tr></tbody></table>

investigating flagella-driven motility in escherichia coli by applying three established techniques in a series

الحركة أمر بالغ الأهمية لبقاء ونجاح العديد من الأنواع البكتيرية. توجد العديد من المنهجيات لاستغلال الحركة لفهم مسارات الإشارات ، لتوضيح وظيفة وتجميع أجزاء flagellar ، ودراسة وفهم أنماط الحركة. هنا نبين مجموعة من ثلاث من هذه المنهجيات. الحركة في أجار لينة هو الأقدم، وتقدم مجموعة قوية لعزل الطفرات القامع كسب الوظيفة في سلالات حركية ضعف، حيث يتم استعادة الحركة من خلال طفرة ثانية. ويمكن استخدام تقنية ربط الخلايا، التي استخدمت لأول مرة لإثبات الطبيعة الدوارة لمحرك flagellar، لتقييم تأثير تأثيرات الإشارات على سرعة المحرك وقدرته على تبديل الاتجاه الدوراني. أما المقايسة "العابرة للحدود" فهي أحدث عهدا، حيث يمكن تجهيز بكتيريا السباحة للانتقال إلى التحرك الجماعي كسرب. وتمثل هذه البروتوكولات مجتمعة نهجا منهجيا وقويا لتحديد مكونات آلية الحركة، وتوصيف دورها في مختلف جوانب السباحة والازحراب. ويمكن تكييفها بسهولة لدراسة الحركة في الأنواع البكتيرية الأخرى.

تم تفصيل عزل الرجعيات الزائفة في سلالة الإشريكية القولونية التي تضعف حركتها بسبب المستويات العالية من جزيء الإشارات c-di-GMP ، في العمل الأخير من مختبرنا34. هذه السلالة (JP1442) تؤوي اثنين من الطفرات:Δ yhjH وΔ ycgR. YhjH هو فوسفوديستراز الأكثر نشاطا أن يحط ج دي GMP في الإشريك?...

Watch this Scientific Journal Video about Investigating Flagella-Driven Motility in Escherichia coli by Applying Three Established Techniques in a Series at JoVE.com

Investigating Flagella-Driven Motility in Escherichia coli by Applying Three Established Techniques in a Series

تستخدم العديد من البكتيريا الحركة التي تحركها flagella للتنقل في بيئتها واستعمار المناطق المحيطة المواتية على حد سواء بشكل فردي وجماعي. يتضح هنا هو استخدام ثلاث طرق راسخة تستغل الحركة كأداة اختيار لتحديد المكونات / المسارات المساهمة في السباحة والحركة.

التحقيق في حركية Flagella يحركها في الإشريكية القولونية من خلال تطبيق ثلاث تقنيات راسخة في سلسلة

Motility is crucial to the survival and success of many bacterial species. Many methodologies exist to exploit motility to understand signaling pathways, ...

investigating-flagella-driven-motility-escherichia-coli-applying

Research

JoVE Journal

Biology

Investigating Flagella-Driven Motility in Escherichia coli by Applying Three Established Techniques in a Series

7.5K Views.  The University of Texas at Austin. تستخدم العديد من البكتيريا الحركة التي تحركها flagella للتنقل في بيئتها واستعمار المناطق المحيطة المواتية على حد سواء بشكل فردي وجماعي. يتضح هنا هو استخدام ثلاث طرق راسخة تستغل الحركة كأداة اختيار لتحديد المكونات / المسارات المساهمة في السباحة والحركة.

Video: Investigating Flagella-Driven Motility in Escherichia coli by Applying Three Established Techniques in a Series

Controlling Flow Speeds of Microtubule-Based 3D Active Fluids Using Temperature

We present a method for using temperature to tune the flow speeds of kinesin-driven, microtubule-based three-dimensional (3D) active fluids. This method allows for tuning the speeds in situ without the need to manufacture new samples to reach different desired speeds. Moreover, this method enables the dynamic control of speed. Cycling the temperature leads the fluids to flow fast and slow, periodically. This controllability is based on the Arrhenius characteristic of the kinesin-microtubule reaction, demonstrating a controlled mean flow speed range of 4&#8211;8 &#181;m/s. The presented method will open the door to the design of microfluidic devices where the flow rates in the channel are locally tunable without the need for a valve.

The goal of this protocol is to use temperature to control the flow speeds of three-dimensional active fluids. The advantage of this method not only allows for regulating flow speeds in situ but also enables dynamic control, such as periodically tuning flow speeds up and down.

التحكم في سرعات تدفق السوائل النشطة ثلاثية الابعاد المستندة إلى Microtubule باستخدام درجه الحرارة

We present a method for using temperature to tune the flow speeds of kinesin-driven, microtubule-based three-dimensional (3D) active fluids. This method ...

Engineering

A Microfluidic Device for Quantifying Bacterial Chemotaxis in Stable Concentration Gradients

Chemotaxis allows bacteria to approach sources of attractant chemicals or to avoid sources of repellent chemicals. Bacteria constantly monitor the concentration of specific chemoeffectors by comparing the current concentration to the concentration detected a few seconds earlier. This comparison determines the net direction of movement. Although multiple, competing gradients often coexist in nature, conventional approaches for investigating bacterial chemotaxis are suboptimal for quantifying migration in response to concentration gradients of attractants and repellents. Here, we describe the development of a microfluidic chemotaxis model for presenting precise and stable concentration gradients of chemoeffectors to bacteria and quantitatively investigating their response to the applied gradient. The device is versatile in that concentration gradients of any desired absolute concentration and gradient strength can be easily generated by diffusive mixing. The device is demonstrated using the response of Escherichia coli RP437 to gradients of amino acids and nickel ions.

This protocol describes the development of a microfluidic device for investigating bacterial chemotaxis in stable concentration gradients of chemoeffectors.

جهاز ميكروفلويديك الانجذاب الكيميائي لقياس تركيز البكتيريا في التدرجات مستقرة

Chemotaxis allows bacteria to approach sources of attractant chemicals or to avoid sources of repellent chemicals. Bacteria constantly monitor the ...

Quantifying Bacterial Surface Swarming Motility on Inducer Gradient Plates

Bacterial swarming motility is a common microbiological phenotype that bacterial communities use to migrate over semisolid surfaces. In investigations of induced swarming motility, specific concentration&#160;of an inducer may not be able to report events occurring within the optimal concentration range to elicit the desired responses from a species. Semisolid plates containing multiple concentrations are commonly used to investigate the response within an inducer concentration range. However, separate semisolid plates increase variations in medium viscosity and moisture content within each plate due to nonuniform solidification time.
This paper describes a one-step method to simultaneously test surface swarming motility on a single gradient plate, where the isometrically arranged test wells allow the simultaneous acquisition of multiconcentration responses. In the present work, the surface swarming of Escherichia coli K12 and Pseudomonas aeruginosa PAO1 were evaluated in response to a concentration gradient of inducers such as resveratrol and arabinose. Periodically, the swarm morphologies were imaged using an imaging system to capture the entire surface swarming process.
The quantitative measurement of the swarm morphologies was acquired using ImageJ software, providing analyzable information of the swarm area. This paper presents a simple gradient swarm plate method that provides qualitative and quantitative information about the inducers&#39; effects on surface swarming, which can be extended to study the effects of other inducers on a broader range of motile bacterial species.

Here, we describe the use of inducer gradient plates to evaluate bacterial swarming motility while simultaneously obtaining multiple concentration responses.

قياس حركة احتشاد السطح البكتيري على ألواح التدرج المحفزة

Bacterial swarming motility is a common microbiological phenotype that bacterial communities use to migrate over semisolid surfaces. In investigations of ...

Biochemistry

Visualization of Twitching Motility and Characterization of the Role of the PilG in Xylella fastidiosa

Xylella fastidiosa is a Gram-negative non-flagellated bacterium that causes a number of economically important diseases of plants. The twitching motility provides X. fastidiosa a means for long-distance intra-plant movement and colonization, contributing toward pathogenicity in X. fastidiosa. The twitching motility of X. fastidiosa is operated by type IV pili. Type IV pili of Xylella fastidiosa are regulated by pilG, a chemotaxis regulator in Pil-Chp operon encoding proteins that are involved with signal transduction pathways. To elucidate the roles of pilG in the twitching motility of X. fastidiosa, a pilG-deficient mutant Xf&#916;pilG and its complementary strain Xf&#916;pilG-C containing native pilG were developed. A microfluidic chambers integrated with a time-lapse image recording system was used to observe twitching motility in Xf&#916;pilG, Xf&#916;pilG-C and its wild type strain. Using this recording system, it permits long-term spatial and temporal observations of aggregation, migration of individual cells and populations of bacteria via twitching motility. X. fastidiosa wild type and complementary Xf&#916;pilG-C strain showed typical twitching motility characteristics directly observed in the microfluidic flow chambers, whereas mutant Xf&#916;pliG exhibited the twitching deficient phenotype. This study demonstrates that pilG contributes to the twitching motility of X. fastidiosa. The microfluidic flow chamber is used as a means for observing twitching motility.

Visualization of Twitching Motility and Characterization of the Role of the PilG in Xylella fastidiosa

In this study, a nano-microfluidic flow chamber was employed to visualize and functionally characterize the twitching motility of Xylella fastidiosa, a bacterium that causes Pierce&#39;s disease in grapevine.

التصور من الوخز على الحركة وتوصيف دور<em&gt; PilG</em&gt; في<em&gt; Xylella fastidiosa</em

Xylella fastidiosa is a Gram-negative non-flagellated bacterium that causes a number of economically important diseases of plants. The twitching motility ...

Immunology and Infection

Reconstitution of Actin-Based Motility with Commercially Available Proteins

Many cell movements and shape changes and certain types of intracellular bacterial and organelle motility are driven by the biopolymer actin that forms a dynamic network at the surface of the cell, organelle, or bacterium. The biochemical and mechanical basis of force production during this process can be studied by reproducing actin-based movement in an acellular manner on inert surfaces such as beads that are functionalized and incubated with a controlled set of components. Under the appropriate conditions, an elastic actin network assembles at the bead surface and breaks open due to the stress generated by network growth, forming an "actin comet" that propels the bead forward. However, such experiments require the purification of a host of different actin-binding proteins, often putting them beyond the reach of non-specialists. This article details a protocol for reproducibly obtaining actin comets and motility of beads using commercially available reagents. Bead coating, bead size, and motility mixture can be altered to observe the effect on bead speed, trajectories, and other parameters. This assay can be used for testing the biochemical activities of different actin-binding proteins, and for performing quantitative physical measurements that shed light on active matter properties of actin networks. This will be a useful tool for the community, enabling the study of in vitro actin-based motility without expert knowledge in actin-binding protein purification.

This protocol describes how to produce actin comets on the surfaces of beads using commercially available protein ingredients. Such systems mimic the protrusive structures found in cells, and can be used to examine physiological mechanisms of force production in a simplified way.

إعادة تكوين الحركة القائمة على الأكتين مع البروتينات المتاحة تجاريا

Many cell movements and shape changes and certain types of intracellular bacterial and organelle motility are driven by the biopolymer actin that forms a ...

Bioengineering

بكتيريا الطباعة الحيوية في مصفوفات الهيدروجيل لدراسة الحركة والنمو

3D Printing Bacteria to Study Motility and Growth in Complex 3D Porous Media

Bacteria are ubiquitous in complex three-dimensional (3D) porous environments, such as biological tissues and gels, and subsurface soils and sediments. However, the majority of previous work has focused on studies of cells in bulk liquids or at flat surfaces, which do not fully recapitulate the complexity of many natural bacterial habitats. Here, this gap in knowledge is addressed by describing the development of a method to 3D-print dense colonies of bacteria into jammed granular hydrogel matrices. These matrices have tunable pore sizes and mechanical properties; they physically confine the cells, thus supporting them in 3D. They are optically transparent, allowing for direct visualization of bacterial spreading through their surroundings using imaging. As a proof of this principle, here, the capability of this protocol is demonstrated by 3D printing and imaging non-motile and motile Vibro cholerae, as well as non-motile Escherichia coli, in jammed granular hydrogel matrices with varying interstitial pore sizes.

تسليط الضوء على المؤلف: دراسة النمو البكتيري في مصفوفات هيدروجيل 3D

This protocol describes a procedure for three-dimensional (3D) printing of bacterial colonies to study their motility and growth in complex 3D porous hydrogel matrices that are more akin to their natural habitats than conventional liquid cultures or Petri dishes.

بكتيريا الطباعة ثلاثية الأبعاد لدراسة الحركة والنمو في الوسائط المسامية ثلاثية الأبعاد المعقدة

Bacteria are ubiquitous in complex three-dimensional (3D) porous environments, such as biological tissues and gels, and subsurface soils and sediments. ...

Generation of Null Mutants to Elucidate the Role of Bacterial Glycosyltransferases in Bacterial Motility

The study of glycosylation in prokaryotes is a rapidly growing area. Bacteria harbor different glycosylated structures on their surface whose glycans constitute a strain-specific barcode. The associated glycans show higher diversity in sugar composition and structure than those of eukaryotes and are important in bacterial-host recognition processes and interaction with the environment. In pathogenic bacteria, glycoproteins have been involved in different stages of the infectious process, and glycan modifications can interfere with specific functions of glycoproteins. However, despite the advances made in the understanding of glycan composition, structure, and biosynthesis pathways, understanding of the role of glycoproteins in pathogenicity or interaction with the environment remains very limited. Furthermore, in some bacteria, the enzymes required for protein glycosylation are shared with other polysaccharide biosynthetic pathways, such as lipopolysaccharide and capsule biosynthetic pathways. The functional importance of glycosylation has been elucidated in several bacteria through mutation of specific genes thought to be involved in the glycosylation process and the study of its impact on the expression of the target glycoprotein and the modifying glycan. Mesophilic Aeromonas have a single and O-glycosylated polar flagellum. Flagellar glycans show diversity in carbohydrate composition and chain length between Aeromonas strains. However, all strains analyzed to date show a pseudaminic acid derivative as the linking sugar that modifies serine or threonine residues. The pseudaminic acid derivative is required for polar flagella assembly, and its loss has an impact on adhesion, biofilm formation, and colonization. The protocol detailed in this article describes how the construction of null mutants can be used to understand the involvement of genes or genome regions containing putative glycosyltransferases in the biosynthesis of a flagellar glycan. This includes the potential to understand the function of the glycosyltransferases involved and the role of the glycan. This will be achieved by comparing the glycan deficient mutant to the wild-type strain.

Here, we describe the construction of null mutants of Aeromonas in specific glycosyltransferases or regions containing glycosyltransferases, the motility assays, and flagella purification performed to establish the involvement and function of their encoded enzymes in the biosynthesis of a glycan, as well as the role of this glycan in bacterial pathogenesis.

توليد الطفرات الخالية لتوضيح دور الجليكوسيل ترانسفيراز البكتيري في الحركة البكتيرية

The study of glycosylation in prokaryotes is a rapidly growing area. Bacteria harbor different glycosylated structures on their surface whose glycans ...

Preparation, Imaging, and Quantification of Bacterial Surface Motility Assays

Bacterial surface motility, such as swarming, is commonly examined in the laboratory using plate assays that necessitate specific concentrations of agar and sometimes inclusion of specific nutrients in the growth medium. The preparation of such explicit media and surface growth conditions serves to provide the favorable conditions that allow not just bacterial growth but coordinated motility of bacteria over these surfaces within thin liquid films. Reproducibility of swarm plate and other surface motility plate assays can be a major challenge. Especially for more &#8220;temperate swarmers&#8221; that exhibit motility only within agar ranges of 0.4%-0.8% (wt/vol), minor changes in protocol or laboratory environment can greatly influence swarm assay results. &#8220;Wettability&#8221;, or water content at the liquid-solid-air interface of these plate assays, is often a key variable to be controlled. An additional challenge in assessing swarming is how to quantify observed differences between any two (or more) experiments. Here we detail a versatile two-phase protocol to prepare and image swarm assays. We include guidelines to circumvent the challenges commonly associated with swarm assay media preparation and quantification of data from these assays. We specifically demonstrate our method using bacteria that express fluorescent or bioluminescent genetic reporters like green fluorescent protein (GFP), luciferase (lux operon), or cellular stains to enable time-lapse optical imaging. We further demonstrate the ability of our method to track competing swarming species in the same experiment.

Swarming motility is influenced by physical and environmental factors. We describe a two-phase protocol and guidelines to circumvent the challenges commonly associated with swarm assay preparation and data collection. A macroscopic imaging technique is employed to obtain detailed information on swarm behavior that is not provided by current analysis techniques.

التحضير والتصوير، والكمي لالسطحية الجرثومي على الحركة فحوصات

Bacterial surface motility, such as swarming, is commonly examined in the laboratory using plate assays that necessitate specific concentrations of agar ...

التحقيق في حركية Flagella يحركها في الإشريكية القولونية من خلال تطبيق ثلاث تقنيات راسخة في سلسلة

Summary

Explore More Videos

PLAYLIST