Name: detection of cell-free dna in blood plasma samples of cancer patients
Uploaded: 2020-09-09T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 25 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detection of Cell-Free DNA in Blood Plasma Samples of Cancer Patients at JoVE.com

ويود المؤلفون أن يشكروا أعضاء مختبر علم الجينوم السرطاني والتراكم البيولوجي للأمراض المعقدة على إسهاماتهم الملاحظةية الشديدة ومشاركتهم في مناقشات متعددة في مختلف مراحل هذا المشروع. ويشمل الدعم التمويلي منحة من جمعية إسرائيل للسرطان (ICA منحة M.F-M 2017-2019) ومنحة Kamin من هيئة الابتكار الإسرائيلية (ل M.F-M.).

ويعلن أصحاب البلاغ أنهما لا يملكان مصالح مالية متنافسة.

جمع دم المريض في أنبوب, شحنة وتخزين الخطوات الأولية الحاسمة في خزعة السائل. يمكن أن تعيق المعالجة غير السليمة جودة البلازما ، وبالتالي ، يمكن أن تتداخل مع نتائج خزعة السائل47. إذا تم جمع عينة دم في أنبوب الدم EDTA، يجب فصل البلازما في غضون ساعتين من جمع الدم لتجنب تحلل من WBCs وإطلاق...

وقد أدت التطورات التكنولوجية إلى تسلسل مئات من الجينوم السرطان و النسخ1. وقد ساهم هذا في فهم المناظر الطبيعية للتغيرات الجزيئية عبر أنواع السرطان المختلفة2. وقد ساعدت دراسات أخرى على هذه المناظر الطبيعية تميز التعديلات الجسدية المتتابعة والانصهار الجيني3 التي تشارك في السرطان أو تطور الورم ، عن طريق تعطيل مسارات الخلايا المبرمجة تسلسليا4. ولذلك، يمكن أن الطفرات الجسدية وندمج الجينات الجينات تقديم معلومات حول الأورام من خلال العمل كعلامات حيوية في المرضى الفردية لنوع معين من الورم5، وتحديد الأورام الأولية القائمة التكهن6، تصنيف الأورام الثانوية على أساس التغيرات الجزيئية7، وتحديد أهداف الورم القابلة للأدوية8. قد تسهل هذه المعلومات في اختيار العلاج المخصص لمرضى السرطان وفي تحديد ردود إيجابية وسلبية العلاج9. ومع ذلك، الحصول على مواد الورم لتحديد التنميط الجينومي للأنسجة الورم هو إجراء الغازية10. وعلاوة على ذلك, خزعة الورم لا تشمل سوى جزء صغير من ورم غير متجانسة; ويجوز لذلك، لا يكون ممثلا للملامح الجزيئية للورم كله11. يتطلب الرصد المتسلسل والورم genotyping مجموعة متكررة من أنسجة الورم ، والتي ، عادة ، غير مجدية بسبب غزو إجراء خزعة الورم وقضايا السلامة التي تنشأ عن مثل هذه الإجراءات12.
تقنية خزعة السائل، من ناحية أخرى، وقد اكتسبت اهتماما هائلا في علم الأورام الدقة على مدى العقد الماضي13،14. ويرجع ذلك أساسا إلى عدم الغازية من هذه التقنية، وإمكانية تكرار ذلك في نقاط زمنية متعددة، مما يتيح تقنية سهلة الاستخدام وآمنة لرصد دورات المرض15،16. تعتمد الخزعة السائلة على ظاهرة تتكاثر فيها الخلايا السرطانية بسرعة ، وفي نفس الوقت يخضع العديد منها للتخثر والناخر. وهذا يؤدي إلى إطلاق حطام الخلايا المبرمج في دم المرضى ، جنبا إلى جنب مع شظايا الحمض النووي التي يتم قطعها بأحجام دقيقة خلال المبرمج17. إن موت الخلايا غير السرطانية يؤدي أيضاً إلى إطلاق حطامها الخلوي في الدم، ومع ذلك، فإن معدل موت الخلايا المبرمج في هذه الخلايا أقل بكثير نسبياً من الخلايا السرطانية18. عقلاني من تقنية خزعة السائل هو التقاط الجزيئات المرتبطة بالورم مثل الحمض النووي, RNA, البروتينات, والخلايا السرطانية14,19 التي تدور باستمرار في الدم. تقنيات مختلفة20 يمكن استخدامها لتحليل هذه الجزيئات بما في ذلك الجيل التالي التسلسل (NGS)، الرقمية القطيرة البوليميراز سلسلة التفاعل (DdPCR)، PCR في الوقت الحقيقي، والمناعة المرتبطة الانزيم المقايسة (ELISA). تقنية خزعة السائل تمكن تحديد المؤشرات الحيوية التي هي خصائص الخلايا السرطانية. هذه الجزيئات العلامات الحيوية ليست فقط إطلاقها من أجزاء محددة من الورم، ولكن بدلا من جميع أجزاء الورم21. وبالتالي، علامات محددة في خزعة السائل يمثل التنميط الجزيئي للورم غير متجانسة بالكامل، بالإضافة إلى الأورام الأخرى في الجسم، وبالتالي، وجود مزايا على الأنسجة على أساس تقنية22.
وcfDNA لديه فترة قصيرة نصف العمر في الدم المتداولة تتراوح بين بضع دقائق إلى 1-2 ساعة23. ومع ذلك، فإن فترة نصف العمر القصيرة لـ cfDNA تسهل إجراء التحليلات في الوقت الحقيقي من خلال تقييم استجابة العلاج وتقييمات الورم الديناميكية. تشير مستويات cfDNA المشتقة من الورم إلى التكهن بمرحلة الورم / حجمها الذي أظهرته العديد من الدراسات ، والتي أظهرت وجود علاقة بين مستويات CFDNA ونتائج البقاء على قيد الحياة24. وعلاوة على ذلك، أثبتت الدراسات أن CFDNA لديه قدرة تنبؤ أفضل من علامات الورم الموجودة25. التكهن من cfDNA هو أكثر وضوحا بعد علاج السرطان, مستويات أعلى من cfDNA بعد العلاج يرتبط بشكل جيد مع انخفاض معدل البقاء على قيد الحياة, ومقاومة للعلاج. في حين, انخفاض مستويات cfDNA بعد العلاج يتوافق عموما مع استجابة إيجابية للعلاج. وبالإضافة إلى ذلك، ييسر نظام cfDNA الكشف المبكر عن الاستجابة للعلاج من طرق الكشف التقليدية.
وcfDNA يزيد من إمكانية الكشف المبكر عن الطفرات المرتبطة بالسرطان: خلال مرحلة مبكرة من المرض15, بداية الأعراض26 وقبل تشخيص السرطان تصل إلى 2 سنة27. كما يتم الافراج عن cfDNA من مناطق أو بؤر متعددة الورم، وتحليلها يوفر نظرة شاملة للجينوم الورم أنه يمثل28. ولذلك، فإن cfDNA تمكن من الكشف عن الطفرات الجسدية التي قد غاب في عينات الأنسجة29. كما يمكن الكشف عن التغايرية داخل الورم والطفرات تحت النسيلة عن طريق التسلسل العميق للمناطق الجينومية التي تمتد على آلاف القواعد، وبالتالي فإن تحليل cfDNA تمكن من الكشف عن أنواع فرعية جزيئية محددة مع تواقيع الجينومية المتميزة13. للحصول على مستوى مماثل من المعلومات من خلال عينة الأنسجة كان هناك حاجة إلى العديد من الخزعات الصلبة.
وعلاوة على ذلك، فإن مستويات cfDNA في المرضى الذين يعانون من مرض محلي مثل القولون, المبيض, وسرطان الرئة بعد العلاج الجراحي و / أو العلاج الكيميائي, أظهرت أن علامة قوية التكهن لتكرار السرطان ونتائج العلاج20. وعلاوة على ذلك، في المرضى الذين يعانون من سرطان القولون والثدي والرئة، يمكن لتحليلات cfDNA من الدم الكشف بنجاح عن التغيرات الورم محددة، مما أدى إلى التنبؤ الدقيق لتكرار عدة أشهر مقدما13. وعلاوة على ذلك, علامات المقاومة العلاج, مثل الطفرات KRAS في المرضى الذين يعانون من CRC تلقي العلاج المضاد EGFR30; VAFs للجينات مثل PIK3CA, MED1 أو EGFR في المرضى الذين يعانون من سرطان الثدي بعد العلاج مع العلاجات المختلفة31; وEGFR T790M المقاومة الطفرة في سرطان الرئة المرضى الذين عولجوا مع المعارف التقليدية التي تستهدف EGFRيمكن أيضا تحديدها من خلال تحليل cfDNA.
باختصار، تحليل cfDNA يمكن أن تستخدم لتحديد المؤشرات الحيوية الدقيقة في مجال الأورام13،33. في هذا البروتوكول، تمت معالجة عينات دم من 3 مرضى الورم الدبقي و 3 ضوابط صحية للحصول على الحمض النووي الجينومي من WBCs وCFDNA من البلازما. في سرطان الورم الدبقي، والطفرات في IDH، TERT، ATRX، EGFR، وTP53 بمثابة علامات التشخيص وكذلك التكهن التي قد تساعد في التشخيص المبكر للأورام الدبقية، وتصنيف أنواع مختلفة من الأورام الدبقية، وتوجيه العلاج الدقيق للمريض الفرد وفهم استجابة العلاج34،35. يمكن تحديد الحالة الطفرة لهذه الجينات باستخدام CFDNA المستمدة من الدم. في هذه المخطوطة، نقدم بروتوكول مفصل من cfDNA المشتقة من البلازما التي تم استخدامها لدراسة التغيرات الطفرة في سرطان الورم الدبقي12. مثل هذا بروتوكول خزعة السائل المستندة إلى cfDNA الموضح في هذه المقالة يمكن استخدامه لدراسة التغيرات الطفرة في العديد من أنواع السرطان الأخرى. وعلاوة على ذلك، أظهرت دراسة حديثة أن خزعة السائل المستندة إلى CFDNA يمكن الكشف عن 50 نوعا مختلفا منالسرطانات 36.
جمع عينات الدم وتخزينها وشحنها هي خطوات حاسمة في هذا البروتوكول، حيث أن درجة الحرارة غير المنضبطة خلال هذه الخطوات تتسبب في تحلل مراكز حماية الملوثات البرية ، مما يؤدي إلى إطلاق الحمض النووي الجينومي من WBC في البلازما والتسبب في تلوث عينة cfDNA ، مما يؤثر على بقية الإجراء37. يمكن أن ينكمز الانحلال بسبب درجة الحرارة غير المنضبطة عمليات إعداد عينة المصب من cfDNA، مثل خطوات PCR38. يحتوي المصل على نسبة عالية من cfDNA الخط الجرثومي بدلاً من البلازما ، على الرغم من أنه يقدم ضوضاء خلفية كبيرة لـ cfDNA المرتبطة بالورم39. ولذلك، لعزل cfDNA المرتبطة بالورم، البلازما هي عينة مناسبة39. وينبغي طرد الدم المسحوب في مضاد للتخثر يحتوي على أنبوب جمع الدم على الفور أو في غضون ما يصل إلى ساعتين، لفصل البلازما وتجنب التلوث بcfDNA. في هذا البروتوكول، يتم استخدام أنابيب جمع الدم CFDNA التجارية المخصصة (انظر جدول المواد)، والتي هي بديل لتخثر الدم التي تحتوي على أنابيب جمع الدم. هذه الأنابيب المخصصة لجمع الدم تحافظ على CFDNA و CFRNA ، وتمنع تحلل WBCs لمدة تصل إلى 30 يومًا في درجة الحرارة المحيطة ، وما يصل إلى 8 أيام عند 37 درجة مئوية. وهذا يسهل الحفاظ على درجة الحرارة المناسبة أثناء شحنة عينة الدم وحتى يتم فصل البلازما وWBC40.
هناك ثلاثة أنواع من منهجيات استخراج cfDNA المتاحة حاليا: عزل المرحلة، السيليكون غشاء محور العمود، والعزلة المغناطيسية القائمة على الخرز41. وأسفرت طريقة عمود الدوران القائم على غشاء السيليكون عن كمية عالية من cfDNA مع سلامة عالية مقارنة مع أساليب استخراج cfDNA الأخرى42.
التقييم الكمي للحمض النووي هو شرط أساسي في خزعة السائل، وهناك حاجة لتطوير بسيطة، بأسعار معقولة، وإجراء موحدة لتنفيذها سهلة والاستخدام على نطاق واسع. ثلاث طرق شائعة الاستخدام لقياس كمي cfDNA هي القياس الطيفي، الفلوريمترية، و qPCR. وثبت أن الأسلوب الفلوريمتري أفضل من الطرق الأخرى المتعلقة بدقة وتكلفة وسهولة إجراء43.
يمكن تقدير سلامة ونقاء cfDNA إما بواسطة الأجاجوز الكهربائي أو الكهربائي الشعري. Agarose electrophoresis لا يظهر حساسية في تركيز منخفض من cfDNA ولا دقة عالية لإظهار حجم جزء دقيق من cfDNA. من ناحية أخرى، الكهربائي الشعري لديه ميزة على الكهربائي agarose من خلال التغلب على التحديات المرتبطة بها، وبالتالي، تستخدم على نطاق واسع من قبل الباحثين لتحليل حجم الجزء cfDNA. في هذا البروتوكول، تم تقدير توزيع حجم جزء من cfDNA معزولة باستخدام أداة كهربائية شعرية آلية (انظر جدول المواد).

<table><tbody><tr><td>2100 Bioanalyzer Instrument</td><td>Agilent Technologies, Inc.</td><td>G2939BA</td><td>The 2100 Bioanalyzer system is an established automated electrophoresis tool for the sample quality control of biomolecules.</td></tr><tr><td>Adjustable Clip for Priming Station</td><td>Agilent Technologies, Inc.</td><td>5042-1398</td><td>Used in combination with syringe to apply defined pressure for chip priming.</td></tr><tr><td>Agilent High Sensitivity DNA Kit</td><td>Agilent Technologies, Inc.</td><td>5067-4626</td><td>The High Sensitivity DNA assays are often used for sample quality control for next-generation sequencing libraries</td></tr><tr><td>cf-DNA/cf-RNA Preservative Tubes</td><td>Norgen Biotek Corp.</td><td>63950</td><td>Norgen&#039;s cf-DNA/cf-RNA Preservative Tubes are closed, evacuated plastic tubes for the collection and the preservation of cf-DNA, circulating tumor DNA, cf-RNA and circulating tumor cells in human whole blood samples during storage and shipping</td></tr><tr><td>Chip Priming Station</td><td>Agilent Technologies, Inc.</td><td>5065-4401</td><td>Used to load gel matrix into a chip with a syringe provided with each assay kit&amp;mdash; used for RNA, DNA, and protein assays. Includes priming station, stop watch, and 1 syringe clip</td></tr><tr><td>Electrode Cleaner Kit</td><td>Agilent Technologies, Inc.</td><td>5065-9951</td><td>Prevents cross-contamination. Removes bacterial or protein contaminants from electrodes.</td></tr><tr><td>Filters for Gel Matrix</td><td>Agilent Technologies, Inc.</td><td>185-5990</td><td>Used for proper mixing of DNA dye concentrate and DNA gel matrix</td></tr><tr><td>IKA Basic Chip Vortex</td><td>IKA-Werke GmbH &amp;amp; Co. KG</td><td>MS-3-S36</td><td>Used for proper mixing of DNA ladder and DNA sample on Bioanalyzer assay chips</td></tr><tr><td>NucleoSpin Tissue kit</td><td>MACHEREY-NAGEL</td><td>740952.5</td><td>With the NucleoSpin Tissue kit, genomic DNA can be prepared from tissue, cells&lt;br/&gt; (e.g., bacteria), and many other sources.</td></tr><tr><td>QIAamp circulating nucleic acid kit</td><td>Qiagen</td><td>55114</td><td>The QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit enables efficient purification of these circulating nucleic acids from human plasma or serum and other cell-free body fluids.</td></tr><tr><td>QIAvac 24 Plus vacuum manifold</td><td>Qiagen</td><td>19413</td><td>The QIAvac 24 Plus vacuum manifold is designed for vacuum processing of QIAGEN columns in parallel.</td></tr><tr><td>QIAvac Connecting System</td><td>Qiagen</td><td>19419</td><td>In combination with the QIAvac Connecting System, the QIAvac 24 Plus vacuum manifold can be used as a flow-through system. The sample flow-through, containing possibly infectious material, is collected in a separate waste bottle.</td></tr><tr><td>Qubit 2.0 fluorometer</td><td>Invitrogen</td><td>Q32866</td><td>The Qubit 2.0 Fluorometer is an easy-to-use, analytical instrument designed to work with the Qubit assays for DNA, RNA, and protein quantitation.</td></tr><tr><td>Qubit assay tubes</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Q32856</td><td>Qubit assay tubes are 500 &amp;micro;L thin-walled polypropylene tubes for use with the Qubit Fluorometer.</td></tr><tr><td>Qubit dsDNA HS Assay Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Q32851</td><td>The Qubit dsDNA HS (High Sensitivity) Assay Kit is designed specifically for use with the Qubit Fluorometer. The assay is highly selective for double-stranded DNA (dsDNA) over RNA and is designed to be accurate for initial sample concentrations from 10 pg/&amp;micro;L to 100 ng/&amp;micro;L.</td></tr><tr><td>Vacuum Pump</td><td>Qiagen</td><td>84010</td><td>used for vacuum processing of QIAGEN columns</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Miscellaneous&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 ml centrifuge tubes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Crushed ice</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ethanol (96&amp;ndash;100%)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Heating block or similar at 56 &amp;deg;C (capable of holding 2 ml collection tubes)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol (100%)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuge</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Phosphate-buffered saline (PBS)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipettes (adjustable)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sterile pipette tips (pipette tips with aerosol barriers are recommended to help prevent cross-contamination)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Water bath or heating block capable of holding 50 mL centrifuge tubes at 60 &amp;deg;C</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

detection of cell-free dna in blood plasma samples of cancer patients

تحديد الطفرات في أورام مرضى السرطان هو خطوة هامة جدا في إدارة الأمراض. هذه الطفرات بمثابة المؤشرات الحيوية لتشخيص الورم وكذلك لاختيار العلاج واستجابته في مرضى السرطان. الطريقة القياسية الذهبية الحالية للكشف عن الطفرات الورم ينطوي على اختبار وراثي للحمض النووي الورم عن طريق خزعات الورم. ومع ذلك، من الصعب إجراء هذه الطريقة الغازية بشكل متكرر كاختبار متابعة لذخيرة الورم الطفرة. خزعة السائل هو أسلوب جديد وناشئ للكشف عن الطفرات الورمية باعتبارها سهلة الاستخدام وغير الغازية نهج الخزعة.
الخلايا السرطانية تتكاثر بسرعة. بالتوازي، العديد من الخلايا السرطانية تخضع لتخثر الدم. يتم إطلاق الحطام من هذه الخلايا في نظام الدورة الدموية للمريض ، جنبا إلى جنب مع قطع الحمض النووي المجزأة بشكل دقيق ، تسمى شظايا الحمض النووي الخالية من الخلايا (CFDNA) ، والتي تحمل طفرات الحمض النووي الورم. لذلك ، لتحديد المؤشرات الحيوية القائمة على عقود زعنف نا باستخدام تقنية خزعة سائلة ، يتم جمع عينات الدم من مرضى السرطان ، يليها فصل البلازما والمعطف البافي. بعد ذلك ، تتم معالجة البلازما لعزل cfDNA ، ويتم معالجة المعطف الماطفي الخاص به لعزل الحمض النووي الجينومي للمريض. ثم يتم فحص كل من عينات الحمض النووي لكمية ونوعية؛ وتحليلها للطفرات باستخدام الجيل التالي من تقنيات التسلسل (NGS).
في هذه المخطوطة، نقدم بروتوكول مفصل للخزعة السائلة، بما في ذلك جمع الدم، والبلازما، وفصل المعطف البافي، واستخراج الحمض النووي لثنائي cfDNA والجراثيم، وتحديد كمية الحمض النووي للحمض النووي باستخدام الـCFDNA أو الحمض النووي الجرثومي، وتحليل الإثراء لشظايا cfDNA.

فصل البلازما 8.5-9 مل الدم التي تم جمعها في cfDNA أو CFRNA أنابيب المواد الحافظة تسفر عن حوالي ~ 4 مل البلازما في الحجم. قد يختلف حجم البلازما المنفصلة عن الدم الذي يتم جمعه في أنابيب EDTA وفقًا لدرجة الحرارة. التعرض لأنابيب EDTA التي تحتوي على الدم في درجة حرارة أعلى من 37 درجة مئوية يؤدي إلى ا...

Watch this Scientific Journal Video about Detection of Cell-Free DNA in Blood Plasma Samples of Cancer Patients at JoVE.com

Detection of Cell-Free DNA in Blood Plasma Samples of Cancer Patients

في هذه الورقة نقدم بروتوكول مفصل لتقنية خزعة السائل غير الغازية، بما في ذلك جمع الدم، البلازما وفصل معطف بافي، استخراج CFDNA والحمض النووي الجرثومي، وتحديد كم CFDNA أو الحمض النووي الجرومي، وتحليل إثراء جزء CFDNA.

الكشف عن الحمض النووي خالية من الخلايا في عينات بلازما الدم من مرضى السرطان

Identifying mutations in tumors of cancer patients is a very important step in disease management. These mutations serve as biomarkers for tumor diagnosis ...

detection-of-cell-free-dna-in-blood-plasma-samples-of-cancer-patients

Research

JoVE Journal

Cancer Research

10.9K Views.  Bar-Ilan University. في هذه الورقة نقدم بروتوكول مفصل لتقنية خزعة السائل غير الغازية، بما في ذلك جمع الدم، البلازما وفصل معطف بافي، استخراج CFDNA والحمض النووي الجرثومي، وتحديد كم CFDNA أو الحمض النووي الجرومي، وتحليل إثراء جزء CFDNA.

Video: Detection of Cell-Free DNA in Blood Plasma Samples of Cancer Patients

Cell-Free DNA Integrity Analysis in Urine Samples

Although the presence of circulating cell-free DNA in plasma or serum has been widely shown to be a suitable source of biomarkers for many types of cancer, few studies have focused on the potential use of urine cell-free (UCF) DNA. Starting from the hypotheses that normal apoptotic cells produce highly fragmented DNA and that cancer cells release longer DNA, the potential role of UCF DNA integrity was evaluated as an early diagnostic marker capable of distinguishing between patients with prostate or bladder cancer and healthy individuals.
A UCF DNA integrity analysis is proposed on the basis of four quantitative real-time PCRs of four sequences longer than 250 bp: c-MYC, BCAS1, HER2, and AR. Sequences that frequently have an increased DNA copy number in bladder and prostate cancers were chosen for the analysis, but the method is flexible, and these genes could be substituted with other genes of interest. The potential utility of UCF DNA as a source of biomarkers has already been demonstrated for urologic malignancies, thus paving the way for further studies on UCF DNA characterization. The UCF DNA integrity test has the advantage of being non-invasive, rapid, and easy to perform, with only a few milliliters of urine needed to carry out the analysis.

A method for analyzing DNA integrity in the cell-free supernatant fraction of urine samples is proposed. The method is suitable for early detection of urological malignancies and has proven accurate for the early diagnosis of bladder cancer.

خلية خالية من الحمض النووي تحليل النزاهة في عينات البول

Although the presence of circulating cell-free DNA in plasma or serum has been widely shown to be a suitable source of biomarkers for many types of ...

Serum and Plasma Copy Number Detection Using Real-time PCR

Serum and plasma cell free DNA (cfDNA) has been shown as an informative, non-invasive source of biomarkers for cancer diagnosis, prognosis, monitoring, and prediction of treatment resistance. Starting from the hypothesis that androgen receptor (AR) gene copy number (CN) gain is a frequent event in metastatic castration resistance prostate cancer (mCRPC), we propose to analyze this event in cfDNA as a potential predictive biomarker.
We evaluated AR CN in cfDNA using 2 different real-time PCR assays and 2 reference genes (RNaseP and AGO1). DNA amount of 60 ng was used for each assay combination. AR CN gain was confirmed using Digital PCR as a more accurate method. CN variation analysis has already been demonstrated to be informative for the prediction of treatment resistance in the setting of mCRPC, but it could be useful also for other purposes in different patient settings. CN analysis on cfDNA has several advantages: it is non-invasive, rapid and easy to perform, and it starts from a small volume of serum or plasma material.

This manuscript describes the copy number variation analysis performed in serum or plasma DNA using real-time PCR approach. This method is suitable for the prediction of drug resistance in castration resistant prostate cancer patients, but it could be informative also for other diseases.

مصل وبلازما نسخة الكشف رقم PCR الوقت الحقيقي باستخدام

Serum and plasma cell free DNA (cfDNA) has been shown as an informative, non-invasive source of biomarkers for cancer diagnosis, prognosis, monitoring, ...

Using 22C3 Anti-PD-L1 Antibody Concentrate on Biopsy and Cytology Samples from Non-small Cell Lung Cancer Patients

Pembrolizumab monotherapy has been approved for the first- and second-line treatment of patients with PD-L1-expressing advanced non-small cell lung cancer (NSCLC). Testing for PD-L1 expression with the PD-L1 immunohistochemistry (IHC) 22C3 companion diagnostic assay, which gives a tumor proportion score (TPS), has been validated on tumor tissue. We developed an optimized laboratory-developed test (LDT) that uses the 22C3 antibody (Ab) concentrate on a widely available IHC autostainer for biopsy and cytology specimens. The PD-L1 TPS was evaluated with 120 paired whole-tumor tissue sections and biopsy samples and with 70 paired biopsy and cytology samples (bronchial washes, n = 40; pleural effusions, n = 30). The 22C3 Ab concentrate-based LDT showed a high concordance rate between biopsy (~100%) and cytology (~95%) specimens when compared to PD-L1 IHC expression determined using the PD-L1 IHC 22C3 companion assay at both TPS cut points (&#8805;1%, &#8805;50%). The optimized LDT presented here, using the 22C3 Ab concentrate to determine the PD-L1 expression in both tumor tissue and in cytology specimens, will expand the ability of laboratories worldwide to assess the eligibility of patients with NSCLC for treatment with pembrolizumab monotherapy in a reliable and reproducible manner.

To expand the ability of laboratories worldwide to assess the eligibility of patients with lung cancer for treatment with pembrolizumab, in a reliable and reproducible manner, we developed an assay that uses the 22C3 antibody concentrate on a widely available immunohistochemical autostainer, for both biopsy and cytology specimens.

3 22 باستخدام الأجسام المضادة-PD-L1 تركز على خزعة وعينات عنق من مرضى سرطان الرئة من الخلايا غير الصغيرة

Pembrolizumab monotherapy has been approved for the first- and second-line treatment of patients with PD-L1-expressing advanced non-small cell lung cancer ...

Methods for Evaluating the Role of c-Fos and Dusp1 in Oncogene Dependence

The demonstration of tyrosine kinase inhibitors (TKIs) in treating chronic myeloid leukemia (CML) has heralded a new era in cancer therapeutics. However, a small population of cells does not respond to TKI treatment, resulting in minimal residual disease (MRD); even the most potent TKIs fail to eradicate these cells. These MRD cells serve as a reservoir to develop resistance to therapy. Why TKI treatment is ineffective against MRD cells is not known. Growth factor signaling is implicated in supporting the survival of MRD cells during TKI treatment, but a mechanistic understanding is lacking. Recent studies demonstrated that an elevated c-Fos and Dusp1 expression as a result of convergent oncogenic and growth factor signaling in MRD cells mediate TKI resistance. The genetic and chemical inhibition of c-Fos and Dusp1 renders CML exquisitely sensitive to TKIs and cures CML in both genetic and humanized mouse models. We identified these target genes using multiple microarrays from TKI-sensitive and -resistant cells. Here, we provide methods for target validation using in vitro and in vivo mouse models. These methods can easily be applied to any target for genetic validation and therapeutic development.

Here, we describe protocols for the genetic and chemical validation of c-Fos and Dusp1 as a drug target in leukemia using in vitro and in vivo genetic and humanized mouse models. This method can be applied to any target for genetic validation and therapeutic development.

أساليب لتقييم دور ج-المنحدر و Dusp1 في الاعتماد على السرطاني

The demonstration of tyrosine kinase inhibitors (TKIs) in treating chronic myeloid leukemia (CML) has heralded a new era in cancer therapeutics. However, ...

Detection and Monitoring of Tumor Associated Circulating DNA in Patient Biofluids

Complications associated with upfront and repeat surgical tissue sampling present the need for minimally invasive platforms capable of molecular sub-classification and temporal monitoring of tumor response to therapy. Here, we describe our dPCR-based method for the detection of tumor somatic mutations in cell free DNA (cfDNA), readily available in&#160;patient biofluids. Although limited in the number of mutations that can be tested for in each assay, this method provides a high level of sensitivity and specificity. Monitoring of mutation abundance, as calculated by MAF, allows for the evaluation of tumor response to therapy, thereby providing a much-needed supplement to radiographic imaging.

Here, we present a protocol to detect tumor somatic mutations in circulating DNA present in patient biological fluids (biofluids). Our droplet digital polymerase chain reaction (dPCR)-based method enables quantification of the tumor mutation allelic frequency (MAF), facilitating a minimally invasive complement to diagnosis and temporal monitoring of tumor response.

الكشف عن ورصد الورم المرتبطة تعميم الحمض النووي في Biofluids المريض

Complications associated with upfront and repeat surgical tissue sampling present the need for minimally invasive platforms capable of molecular ...

A Standardized Liquid Biopsy Preanalytical Protocol for Downstream Circulating-Free DNA Applications

The term liquid biopsy (LB) refers to molecules such as proteins, DNA, RNA, cells, or extracellular vesicles in blood and other bodily fluids that originate from the primary and/or metastatic tumor. LB has emerged as a mainstay in translational research and has started to become part of clinical oncology practice, providing a minimally invasive alternative to solid biopsy. The LB allows real-time monitoring of a tumor via a minimally invasive sample extraction, such as blood. The applications include early cancer detection, patient follow-up for the detection of disease progression, assessment of minimal residual disease, and potential identification of molecular progression and mechanism of resistance. In order to achieve a reliable analysis of these samples that can be reported in the clinic, the preanalytical procedures should be carefully considered and strictly followed. Sample collection, quality, and storage are crucial steps that determine their usefulness in downstream applications. Here, we present standardized protocols from our liquid biopsy working module for collecting, processing, and storing plasma and serum samples for downstream liquid biopsy analysis based on circulating-free DNA. The protocols presented here require standard equipment and are sufficiently flexible to be applied in most laboratories focused on biological procedures.

The liquid biopsy has revolutionized our approach to oncology translational studies, with sample collection, quality, and storage being crucial steps for its successful clinical application. Here we describe a standardized and validated protocol for downstream circulating-free DNA applications that can be applied in most translational research laboratories.

بروتوكول ما قبل التحليل المسبق للخزعة السائلة الموحدة لتطبيقات الحمض النووي الخالية من التداول في المراحل النهائية

The term liquid biopsy (LB) refers to molecules such as proteins, DNA, RNA, cells, or extracellular vesicles in blood and other bodily fluids that ...

Automatic Separation and Collection of Cancer-Related Substances from Clinical Samples

Recently, liquid biopsies have been used to diagnose various diseases, including cancer. Body fluids contain many substances, including cells, proteins, and nucleic acids originating from normal tissues, but some of these substances also originate from the diseased area. The investigation and analysis of these substances in the body fluids play a pivotal role in the diagnosis of various diseases. Therefore, it is important to accurately separate the required substances, and several techniques are developed to be used for this purpose.
We have developed a lab-on-a-disc type of device and platform named CD-PRIME. This device is automated and has good results for sample contamination and sample stability. Moreover, it has advantages of a good acquisition yield, a short operation time, and high reproducibility. In addition, depending on the type of disc to be mounted, plasma containing cell-free DNA, circulating tumor cells, peripheral blood mononuclear cells, or buffy coats can be separated. Thus, the acquisition of a variety of materials present in the body fluids can be done for a variety of downstream applications, including the study of omics.

This paper describes the application of automated equipment to easily and efficiently separate and collect substances, such as cell-free DNA and circulating tumor cells, from whole blood.

الفصل التلقائي وجمع المواد المرتبطة بالسرطان من العينات السريرية

Recently, liquid biopsies have been used to diagnose various diseases, including cancer. Body fluids contain many substances, including cells, proteins, ...

Isolation of Circulating Cell-free DNA (cfDNA): A Silica-based Membrane Procedure to Extract cfDNA from Blood Plasma of Cancer Patients

Source: Palande, V. et al. <a href="https://www.jove.com/video/61449" target="_blank">Detection of Cell-Free DNA in Blood Plasma Samples of Cancer Patients.</a> J. Vis. Exp. (2020)
This video describes a silica-based membrane procedure to isolate circulating cell-free DNA or cfDNA from human plasma sample. The cfDNA is a promising biomarker for cancer diagnosis and assessment.&#160;

عزل الحمض النووي الخالي من الخلايا المنتشرة (cfDNA): إجراء غشاء قائم على السيليكا لاستخراج cfDNA من بلازما الدم لمرضى السرطان

Source: Palande, V. et al. Detection of Cell-Free DNA in Blood Plasma Samples of Cancer Patients. J. Vis. Exp. (2020)
This video describes a silica-based ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Cancers of the Nervous System

In vitro studies

Automated Capillary Electrophoresis Based Fragment Size Distribution Analysis of cfDNA: A DNA Microchip-based Method to Study Size Distribution of DNA Fragments Isolated from Biofluids

Source: Palande, V. et al. <a href="https://www.jove.com/video/61449" target="_blank">Detection of Cell-Free DNA in Blood Plasma Samples of Cancer Patients.</a> J. Vis. Exp. (2020)
In this video, we analyze the size distribution of cell-free DNA or cfDNA fragments using automated capillary electrophoresis. This technique helps gain insights into the profile of DNA fragments released by cancer cells during apoptosis.

تحليل توزيع حجم الشظايا الآلي القائم على الرحلان الكهربائي الشعري ل cfDNA: طريقة قائمة على رقاقة الحمض النووي لدراسة توزيع حجم شظايا الحمض النووي المعزولة من السوائل الحيوية

Source: Palande, V. et al. Detection of Cell-Free DNA in Blood Plasma Samples of Cancer Patients. J. Vis. Exp. (2020)
In this video, we analyze the size ...

الكشف عن الحمض النووي خالية من الخلايا في عينات بلازما الدم من مرضى السرطان

Summary

Explore More Videos

PLAYLIST