يحدد هذا البروتوكول الخطوات المعلوماتية الحيوية للتحقيق في التطور الجزيئي والتعبير عن الجينات المرشحة. هنا نقدم تعليمات شاملة بحيث يمكن لأي شخص لديه خبرة المعلوماتية الحيوية الحد الأدنى من تشغيل من خلال هذا البروتوكول. يمكن تطبيق خط الأنابيب هذا على أي كائن حي وأي عائلة جينية.
إحدى القضايا الشائعة عند القيام المعلوماتية الحيوية هي فشل البرامج النصية قذيفة. عند محاولة هذا البروتوكول، تأكد من أن لديك أحدث البرامج، اقرأ ملفات الخطأ، وتحقق من الدليل بعناية. للبدء، قم بتسجيل الدخول إلى حساب نظام المجموعة الكمبيوتر على محطة طرفية أو إطار تطبيق PuTTY.
على المحطة الطرفية، قم بتنزيل الإصدار 2.8.1 من مجموعة أدوات SRA باستخدام Wget، ثم قم بإنهاء تثبيت البرنامج. ابحث NCBI عن رقم الانضمام SRA للعينات المطلوبة، ثم الحصول على بيانات تسلسل RNA في إطار المحطة الطرفية. الحصول على ملفين FASTQ لنوع الملفات المقترنة نهاية.
العثور على الجينوم المرجعي على الانترنت إذا كان أحد موجود. للحصول على تجميع مرجع اكتب wget في إطار المحطة الطرفية ثم لصق عنوان الارتباط. إذا كان متوفرا، أيضا نسخ ملف GTF والبروتين FASTA ملف للجينوم المرجعي.
فهرسة الجينوم، ثم خريطة يقرأ وحساب التعبير لكل عينة. إعادة تسمية ملف النتائج إلى شيء وصفي، وإنشاء مصفوفة من جميع التهم. افتح نافذة متصفح الإنترنت واذهب إلى NCBI GenBank.
في شريط البحث، اكتب اسم جين الاهتمام واسم الأنواع ذات الصلة الوثيقة التي تم تسلسلها. على يسار شريط البحث، حدد Protein ( Protein)، ثم انقر فوق بحث. استخراج التسلسلات بالنقر فوق إرسال إلى ثم حدد ملف.
ضمن تنسيق ، حدد FASTA، ثم انقر فوق إنشاء ملف. نقل FASTA ملف من المتجانسات إلى كتلة الكمبيوتر باستخدام إطار محطة طرفية محلية أو FileZilla. بعد ذلك ، ابحث عن الجينات المرشحة باستخدام BLAST + على مجموعة الكمبيوتر ، قم بإجراء قاعدة بيانات BLAST من الجينوم أو البروتين المترجم بالنص ، FASTA.
BLAST تسلسل الجينات متجانسة من NCBI إلى قاعدة بيانات الأنواع ذات الاهتمام، ثم عرض ملف الإخراج باستخدام الأمر أكثر من ذلك. نسخ معرفات جينية فريدة من نوع الاهتمام إلى ملف نصي جديد. استخراج تسلسل الجينات المرشحة.
لتأكيد التعليقات التوضيحية الجينية باستخدام التبادل BLAST، انتقل إلى أداة البحث عن المحاذاة المحلية BLAST، وحدد BLASTP، ثم الصق تسلسلات المرشح، وحدد قاعدة بيانات تسلسل البروتين غير المتكررة، وانقر فوق BLAST. فتح MEGA، انقر على محاذاة، ثم تحرير بناء المحاذاة، حدد إنشاء محاذاة جديدة، وانقر فوق موافق. حدد البروتين. عند فتح نافذة المحاذاة، انقر على تحرير.
انقر فوق إدراج تسلسلات من ملف، وحدد FASTA مع تسلسل البروتين من الجينات المرشحة والمتجانسات المحتملة. حدد كافة التسلسلات. العثور على رمز الذراع وتحوم فوقه.
وينبغي أن أقول تسلسل محاذاة باستخدام خوارزمية العضلات. انقر فوق رمز الذراع، ثم انقر فوق محاذاة البروتين لمحاذاة تسلسل تحرير المعلمات أو انقر فوق موافق لاستخدام المعلمات الافتراضية. تم تطبيق هذا البروتوكول على أنسجة هيدرا فولغاريس وهو اللافقاريات المياه العذبة التي تنتمي إلى Cnidaria فيلوم.
تم التحقيق في جينات أوبسين للحصول على نظرة ثاقبة في تطور العينين والكشف عن الضوء في الحيوانات. تم استخراج تسلسل الجينات المرتبطة opsin من H.vulgaris والأنواع الأخرى في ملف FASTA من بنك NCBI GenBank. تم محاذاة جينات الأوبسين في MEGA ، مما يجعل من الممكن تحديد هيدرا أوبسين التي كانت تفتقد حمض أميني محفوظ لليسين ضروري لربط جزيء حساس للضوء.
تم إنشاء شجرة أقصى احتمال باستخدام تسلسل opsin من هيدرا vulgaris والأنواع الأخرى. يشير الفيلوجيني إلى أن جينات الأوبسين تتطور من خلال الازدواجية الخاصة بالنسب في cnidarians ، وربما عن طريق الازدواجية جنبا إلى جنب في H.vulgaris. بعد ذلك ، تم إجراء تحليل التعبير التفاضلي في edgeR للتحقيق في التعبير المطلق عن جينات الأوبسين.
لتحديد ما إذا كان واحد أو أكثر من opsins هي ما يصل تنظيمها في hypostome ، أو الرأس ، ومقارنات الزوج الحكيم من hypostome مقابل عمود الجسم ، في مهدها المنطقة والقدم ، وأجريت مخالب. وتبين أن 774 1 نسخة تم التعبير عنها بشكل متفاوت بين الهيبوستوم وعمود الجسم. تم تحديد الجينات التي تم تنظيمها عبر مقارنات متعددة ، وتم إجراء إثراء وظيفي في Blast2GO.
وأخيرا، تم التحقيق في التعبير المطلق عن جينات الأوبسين في أنسجة مختلفة خلال مراحل مختلفة من الناشئة، وخلال نقاط زمنية مختلفة من التجديد. الفحص البصري للمحاذاة والشجرة سيؤكد ما إذا كانت الجينات المرشحة تنتمي إلى عائلة الاهتمام. الجينات التي تختلف كثيرا في التسلسل أو مجموعة خارج كل شيء آخر، وربما هي جزء من عائلة الجينات المختلفة.
يمكن اعتبار نتائج هذا البروتوكول مولدة للفرضية. يمكن لخط الأنابيب هذا تسليط الضوء على الجينات المرشحة للدراسة وظيفيا في الدراسات المستقبلية. بعد استكشاف تعبير هيدرا أوبسين، نستخدم الآن تقنيات مماثلة للتحقيق في الجينات ذات الصلة عبر الأنواع من أجل تحديد أوجه التشابه والاختلاف في الوظيفة.
