قد يوفر هذا البروتوكول مرجعا منهجيا متغيرا لفهم البنية العصبية الوعائية المعقدة لمدرس الغور القحفي على الحالة الفسيولوجية أو المرضية. الاستفادة من شفافة جبل كامل دورا ماتر، يمكن أن تظهر الارتباط التشنجي من الألياف العصبية المناعية DURAL CGRP والأوعية الدموية في عرض 3D. بعد القتل الرحيم للفئران، تغلغلت عبر القلب مع 100 ملليلتر من 0.9٪ المالحة العادية تليها 250 إلى 300 ملليلتر من 4٪ paraformaldehyde في 0.1 العازلة فوسفات الضرس.
عند الانتهاء، قم بإزالة جلد الرأس وفتح الجمجمة لفضح دورة ماتر والجانب الظهري من الدماغ. تشريح الأم دورا الجمجمة على طول جذع الدماغ إلى لمبة الشم في نمط جبل كامل. شطف الطرية القحفية في 0.1 ضرس الفوسفات العازلة لمدة دقيقة واحدة تقريبا واحتضانه في حل حجب.
نقل ماتر دورا في الأجسام المضادة للماوس CGRP بين عشية وضحاها. في اليوم التالي، غسل الطرية ثلاث مرات في 0.1 ضرس الفوسفات العازلة. احتضان ماتر دورا في حل مختلط من الحمار المضادة للفأرة اليكسا فلور 488 الأجسام المضادة الثانوية وphalloidin 568 في 0.1.
عازل فوسفات المولار يحتوي على مصل حمار طبيعي بنسبة 1٪ و 0.5٪ تريتون X-100 لمدة 1.5 ساعة في درجة حرارة الغرفة. ثم، غسل ماتر دورا ثلاث مرات في 0.1 ضرس الفوسفات العازلة، تقليم حواف، وجبل على الشرائح المجهر. وضع على غطاء زلات مع 50٪ الجلسرين قبل الملاحظة.
صورة جبل كله دورا ماتر مع المجهر الفلوري، ثم التقاط صور للألياف العصبية CGRP المناعي والأوعية الدموية phalloidin المسمى في ماتر دورا باستخدام المجهر confocal. حلق رأس الجرذ بشفرة حلاقة كهربائية، ثم ضع قضبان أذن حادة على الجرذ وضعه على الجهاز المجسم. وضع حامل الفم وتطبيق مرهم العيون على العينين.
تنظيف الجانب الجراحي من الجلد الرأس باستخدام الإيثانول 75٪، وجعل شق على طول خط الوسط من فروة الرأس. إزالة بلانتا periosteum والأنسجة العضلية بعيدا عن الجمجمة باستخدام القطن العقيم يميل التطبيقات. حفر حفرة صغيرة باستخدام حفرة بور مع بت تلميح جولة على العظام الجدارية والصدغية اليسرى فوق الشريان السحاري الأوسط.
بناء بنك حول الحفرة مع أسمنت سيليكات الأسنان وإضافة اثنين من microliters من الفلوروغولد في حفرة حول الشريان السحائي الأوسط مع microsyringe 10 ميكرولتر. غطي الثقب بقطعة صغيرة من إسفنجة الهيموستاتيكي. وضع قطعة من فيلم البارافين على الحفرة وختم حواف مع الشمع العظام.
خياطة الجرح مع الخيط العقيم. إبقاء الفئران في منطقة دافئة حتى أنها قد تعافى تماما. ثم أعد الجرذان إلى أقفاصها
بعد سبعة أيام البقاء على قيد الحياة، perfuse هذه الفئران مع 0.9٪ المالحة العادية تليها 4٪ paraformaldehyde في 0.1 العازلة فوسفات الضرس. تشريح TG وعنق الرحم 1-4 DRGs، ثم قطع لهم في سمك 30 ميكرومتر على نظام microtome cryostat في الاتجاه القوس. وجبل المقاطع على الشرائح الزجاجية المغلفة السيلان.
دائرة المقاطع مع قلم الهسوتشيماكيميكل واحتضانها لمدة 30 دقيقة في حل حجب. نقل العينات إلى حل أرنب المضادة للفلوروغولد والفأر المضادة CGRP الأجسام المضادة واحتضان في أربع درجات مئوية بين عشية وضحاها. في اليوم التالي، اغسل الأقسام ثلاث مرات في 0.1 عازل فوسفات الضرس.
احتضان المقاطع المغسولة في حل مختلط من الحمار المضادة للأرانب اليكسا فلور 594 والحمار المضادة للفأرة اليكسا فلور 488 الأجسام المضادة الثانوية. ثم غسلها ثلاث مرات في 0.1 ضرس الفوسفات العازلة وتطبيق زلات الغطاء مع 50٪ الجلسرين للمراقبة. التقاط صور للخلايا العصبية الفلوروغولد المسمى في TG وDRGs تحت إضاءة الأشعة فوق البنفسجية باستخدام المجهر الفلوري.
ثم، التقاط صور للفلوروغولد وCGRP وصفت الخلايا العصبية في TG وDRGs. بعد immunofluorescent والفلورسنت تلطيخ الهستهوتشيما مع CGRP وphalloidin، CGRP الألياف العصبية المناعية وphalloidin المسمى الشرايين الجافية والأنسجة الضامة تم تصورها بوضوح في جميع أنحاء جبل كامل الجمجمة دورا ماتر في نمط 3D. تعمل الألياف العصبية المناعية السميكة والرقيقة CGRP بالتوازي مع الشرايين الجافية حول جدار الأوعية الدموية أو بين الأوعية الدموية.
بعد سبعة أيام من تطبيق الفلوروغولد على منطقة الشريان السحائي الأوسط ودرا ماتر الجمجمة الجرذ ، تم الكشف عن الخلايا العصبية المسماة بالفلوروغولد في TG وDRGs عنق الرحم على الجانب ipsilateral من تطبيق التتبع ، والذي لوحظ مباشرة تحت إضاءة الأشعة فوق البنفسجية للتنظير الدقيق الفلوري. تم العثور على الخلايا العصبية المسمى فلوروغولد في جميع الفروع الثلاثة من TG، مع تركيزات أعلى على أقسام العيون والفك العلوي ومع تركيزات أقل على الانقسام الفك السفلي. كما لوحظت بعض الخلايا العصبية المسماة بالفلوروغولد في عنق الرحم من اثنين إلى ثلاثة من مجموعات DRGs.
هذه الصور ممثل immunofluorescences مزدوجة تظهر الخلايا العصبية الحسية في TG وDRG. الخلايا العصبية المسماة مع FG، CGRP، وكل من FG و CGRP تم تصورها عن طريق الفلورة المناعية المزدوجة. عند محاولة هذا البروتوكول، تذكر تشريح خارج الجافية الجمجمة تماما ولصقه على شريحة في نمط جبل كامل.
