A.J.C وJ.A.T و I.L تعترف بتمويل المفوضية الأوروبية من خلال مشروع أفق 2020 ACEnano (المنحة رقم H2020-NMBP-2016-720952). و.ز تعترف بتمويل الدكتوراه من مجلس المنح الدراسية في الصين (CSC، رقم 201507060011). 22- تعترف منظمة البحوث العلمية الهولندية بالدعم المالي المقدم من خطة منحة فيدي (NWO Vidi 723.0160330).

تمت الموافقة على استخدام السائل الحيوي البشري وفقا للمبادئ التوجيهية بروتوكول IRB من جامعة لايدن وجامعة إنسبروك الطبية. عندما يتم التحقيق في السوائل الحيوية البشرية أو الحيوانية ، مطلوب موافقة أخلاقية من مؤسسة البحث ، وقد تم الحصول عليها في حالة النتائج الموضحة في هذا البروتوكول. وعلاوة على ذلك ينبغي أيضا أن يتم إعداد تقارير كافية لضمان الشفافية وإعادة استخدام البيانات في العمل المستقبلي9و29و30.
1. إعداد الشوارد الخلفية (BGE)
ملاحظة: يجب إعداد جميع المذيبات في غطاء الدخان المناسب ويجب استخدام معدات الحماية الشخصية الكافية لجميع الخطوات (معطف وقفازات ونظارات واقية). في كل خطوة، مطلوب قنينات بلاستيكية منخفضة الربط لتقليل فقدان التحليل وتلوث العينة بالأملاح المذابة من الأواني الزجاجية.
<ol><li>إعداد 10٪ حمض الخليك BGE (v/v)، درجة الحموضة 2.2 على أساس يومي لنواتج الأيض.<ol>
<li>في قارورة حجمية 10 مل إضافة 1 مل من حمض الخليك، تليها إضافة المياه deionized (DI) إلى خط ملحوظ وخلط شامل.</li>
	</ol>
</li>
	<li>إعداد حمض الخليك 100 mM، درجة الحموضة 2.9 على أساس يومي لبروتيوميوم.<ol>
<li>في قارورة حجمية 10 مل إضافة 57 ميكرولتر من حمض الخليك، تليها إضافة المياه DI إلى خط ملحوظ وخلط شامل.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. إعداد NM
<ol><li>تفريق NMs بقوة في الماء باستخدام المبادئ التوجيهية المنشورة31،32،33. ملاحظة: في تطوير هذا البروتوكول، استخدمت 7 NMs على النحو التالي: 100 و 1000 نانومتر البوليسترين carboxylated استخدمت للبروتين والهالة المستقلب، على التوالي. 100 نانومتر غير معدلة البوليسترين NMs, 13 نانومتر anatase TiO2 NMs التي كانت غير معدلة أو المغلفة إما البولي أكريلات أو البوليمرات PVP و 22 نانومتر غير معدلة SiO2 NMs استخدمت لكل من البروتين والهالة المستقلب. في حين تم تطوير هذه الطريقة وأثبتت باستخدام هذه NMs، تجدر الإشارة إلى أن هذا النهج سيكون قابلا للتطبيق على مجموعة واسعة من التراكيب NM، والأحجام والأشكال، والمورفولوجيا.</li>
	<li>تميز حجم الجسيمات باستخدام إما ضوء ديناميكي تشتت34،35، جسيم واحد يقترن استحثاليا البلازما الطيف الكتل36، تحليل تتبع الجسيمات النانوية37، أو المجهر الإلكتروني انتقال وشحن السطح كما زيتا المحتملة باستخدام زيتا sizer34.</li>
</ol>3. تشكيل الهالة الجزيئية الحيوية
<ol><li>تقسيم 2 مل من البلازما البشرية (أو بيوفلويد من اختيار) إلى 1 مل aliquots, واحد لاليكوت المستقلب والبروتين كورونا والثانية لتوصيف الأيض البلازما.</li>
	<li>احتضان 1 ملغم / مل من NMs في البلازما البشرية لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية بينما الاختلاط بلطف في 500 دورة في الدقيقة في thermomixer. بعد حضانة الطرد المركزي العينة في 4000 × ز لمدة 15 دقيقة في 4 درجة مئوية لبيليه NMs.</li>
	<li>جمع البلازما supernatant لتحليل الهالة المستقلب. الاحتفاظ مجمع كورونا NM-البروتين لتوصيف هالة البروتين.</li>
</ol>4. عزلة هالة البروتين
<ol><li>Resuspend NM-البروتين المعقدة (بيليه) في 1 مل من 10x برنامج تلفزيوني العازلة ودوامة بقوة لمدة 2 دقيقة لإزالة البروتينات غير المنضمة. الطرد المركزي حل برنامج تلفزيوني في 4000 × ز لمدة 15 دقيقة في 4 درجة مئوية بيليه NMs، وإزالة بعناية supernatant دون إزعاج بيليه.</li>
	<li>Resuspend بيليه في 1 مل من العازلة بيكربونات الأمونيوم (ABC) (100 mM، pH 8.0) ودوامة بقوة لمدة 2 دقيقة لإزالة البروتينات غير المنضمة والأملاح غير المرغوب فيها. جهاز طرد مركزي عند 4000 x g لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية لكريات NMs؛ إزالة وتجاهل supernatant. كرر هذه الخطوة.</li>
	<li>تقليل الروابط البروتين كبريتيد عن طريق حل بيليه البروتين NM في 20 ميكرولتر من العازلة ABC (100 mM درجة الحموضة 8) التي تحتوي على 10 mM dithiotheritol. احتضان حل التخفيض لمدة 30 دقيقة عند 56 درجة مئوية.</li>
	<li>لهضم البروتينات، إضافة 2 ميكروغرام من الدرجة تسلسل تريبسين إلى 20 ميكرولتر من ABC تحتوي على 0.1٪ السطحي. احتضان محلول الهضم لمدة 16 ساعة عند 37 درجة مئوية.</li>
	<li>ألكيلات العينة بإضافة 20 ميكرولتر من iodoacetamide في 55 mM في 100 mM ABC واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة.</li>
	<li>إضافة 20 ميكرولتر من 0.1 م HCl إلى شق السطحي وترك لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.</li>
	<li>إثراء وإزالة الببتيدات باستخدام C18 معبأة تلميح ماصة تحلية.<ol>
<li>الرطب تلميح مع 80 ميكرولتر 0.1٪ حمض الفورميك 50٪ أسيتونيتريل 5 مرات، نظيفة مع 80 ميكرولتر 0.1٪ حمض الفورميك 5 مرات، ورسم وعينة elute 10 مرات، عينة desalt عن طريق مسح 80 ميكرولتر 0.1 ٪ حمض الفورميك 5 مرات وealute العينة 2 مرات مع 80 ميكرولتر 0.1٪ حمض الفورميك 70٪ acetonitrile في أنبوب PCR منخفضة الربط نظيفة.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Lyophilize العينات وتخزينها في -20 درجة مئوية حتى التحليل.</li>
</ol>5. عزل هالة ميتابوليت
<ol><li>تأخذ البلازما التحكم وsupernatant من حضانة البلازما NM من الخطوة 3.3 والحفاظ على الجليد أثناء إعداد العينة.</li>
	<li>خذ 50 ميكرولتر من كل منها إلى قنينات منفصلة وتمييع 1 من كل 10 مع ماء DI. خذ 50 ميكرولتر من كل عينة مخففة وانتقل إلى قوارير جديدة للخطوة 5.3.</li>
	<li>إضافة 200 ميكرولتر كلوروفورم، 250 ميكرولتر الميثانول و 350 ميكرولتر DI المياه وخليط دوامة بقوة لمدة 2 دقيقة. جهاز طرد مركزي لمدة 10 دقائق عند 20,800 × ز عند 4 درجات مئوية.</li>
	<li>خذ 500 ميكرولتر من الناسخ الفائق والفلتر من خلال فلتر طرد مركزي 3 kDa لمدة 2 ساعة عند 10000 × غرام عند 4 درجات مئوية. خذ 430 ميكرولتر من الترافلترات وجاف في سرعة فاك. ويمكن الآن تجميد العينات قبل تحليلها.</li>
</ol>6. إعداد نظام CESI-MS38
ملاحظة: قبل تثبيت الشعيرات الدموية، تحقق من أن مدخل ومنفذ نهاية الشعيرات الدموية سليمة وأنه لا توجد أية الكسر مرئية في الشعيرات الدموية.
<ol><li>تركيب الشعرية المغلفة محايدة لتحليل هالة البروتين39.<ol>
<li>ضع شعرية مغلفة محايدة جديدة (طول 90 سم بقطر داخلي 30 ميكرومتر) في أداة CESI وفقا لإرشادات الشركة المصنعة.</li>
	</ol>
</li>
	<li>إعداد الشعيرات الدموية CESI للتحليل بروتيوميك.<ol>
<li>قم بمسح الشعرية الفاصلة في الاتجاه الأمامي باستخدام 100 mM من HCl لمدة 5 دقائق عند 100 psi وتحقق من تكوين القطيرات في منفذ الشعرية. تدفق فصل الشعرية مع BGE في 100 psi لمدة 10 دقيقة ثم DI المياه في 100 psi لمدة 30 دقيقة (وهذا مطلوب فقط للشعيرات الدموية الجديدة).</li>
		<li>تدفق كل من الشعيرات الدموية الفصل والشعيرات الدموية موصل مع BGE في 90 psi لمدة 5 دقائق وضمان شكل قطرات في نهاية منفذ كل من الشعيرات الدموية.</li>
		<li>تدفق الشعيرات الدموية فصل مع الماء DI في 90 psi لمدة 10 دقيقة، ثم 50 psi لمدة 10 دقيقة مع 0.1 M HCl، تليها مرة أخرى 90 psi لمدة 10 دقيقة مع الماء DI وأخيرا BGE في 90 psi لمدة 10 دقيقة. زوجين CESI إلى MS باستخدام مصدر nanospray ومحول كما هو موضح سابقا38.</li>
	</ol>
</li>
	<li>تركيب الشعرية السيليكا تنصهر عارية لتوصيف هالة المستقلب38.<ol>
<li>ضع شعرية السيليكا العارية الجديدة (بطول 90 سم بقطر داخلي 30 ميكرومتر) في أداة CESI باتباع إرشادات الشركة المصنعة.</li>
	</ol>
</li>
	<li>إعداد الشعيرات الدموية CESI لتحليل الأيض.<ol>
<li>تدفق الشعرية فصل في الاتجاه الأمامي باستخدام 100٪ MeOH في 50 psi لمدة 15 دقيقة والتحقق من تشكيل قطرة في منفذ الشعرية. تدفق كل من الشعيرات الدموية الفصل والشعيرات الدموية موصل مع BGE في 90 psi لمدة 5 دقائق وضمان قطرات تشكل في منفذ كل من الشعيرات الدموية.</li>
		<li>تدفق الشعرية الفصل مع المياه DI في 90 psi لمدة 10 دقيقة، ثم 50 psi لمدة 10 دقيقة مع 0.1 M NaOH، تليها مرة أخرى 90 psi لمدة 10 دقيقة مع الماء DI وأخيرا BGE في 90 psi لمدة 10 دقيقة. الزوجين CESI إلى ESI-MS باستخدام مصدر nanospray ومحول كما هو موضح سابقا. 38
</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. CE-MS لتحليل هالة البروتين
<ol><li>عينات ريسوسبند من الخطوة 4.8 في 20 ميكرولتر من خلات الأمونيوم 50 mM درجة الحموضة 4.0.</li>
	<li>إجراء 5 psi 10 s حقن الهيدروديناميكية من العينة. فصل باستخدام الجهد فصل 30 كيلو فولت مع الانحدار الضغط التالي: 0-10 دقيقة في 1 psi، 10-35 دقيقة في 1.5 psi و 35-45 دقيقة في 5 psi باستخدام 100 mM، درجة الحموضة 2.9 حمض الخليك كما BGE.</li>
	<li>جمع الأطياف الشامل بين 250-2000 م / ض مع أعلى 10 بيانات تعتمد على اقتناء التجزئة.</li>
	<li>بين العينات، شطف الشعرية مع 0.1 M HCl لمدة 3 دقائق في 100 psi و 10 دقيقة 100 psi من BGE لفصل الشعرية و 3 دقائق في 100 psi للشعيرات الدموية السائلة موصل.</li>
</ol>8. CESI-MS لتحليل هالة المستقلب
ملاحظة: يجب تحليل كافة العينات مرتين، مرة في الوضع الإيجابي للكشف عن الكاتيونات ومرة واحدة في الوضع السلبي للكشف عن أنيونات. عينات البلازما التحكم تحتاج إلى تحليلها على الأقل 5 مرات.
<ol><li>Resuspend NM المكشوفة وغير المكشوفة عينات البلازما من الخطوة 5.4 في 430 ميكرولتر من المياه DI ودوامة بقوة لمدة 2 دقيقة. تصفية من خلال مرشح غشاء 0.1 ميكرومتر.</li>
	<li>خذ 95 ميكرولتر من الفيلترات وأضف 5 ميكرولتر من المعايير الداخلية عند 200 ميكرومتر للكاتيونات (كبرفون L-methionine) و400 ميكرومتر للأيونات (2,2,4,4-D4-حمض الستريك) ودوامة بقوة. جهاز طرد مركزي عند 4000 x g عند 4 درجات مئوية لمدة 10 دقائق قبل تحليل CESI-MS.</li>
	<li>حقن عينة هيدروديناميكالي لمدة 30 ق (كاتيون) و 40 ق (أنيونات) في 2 psi.</li>
	<li>المستقلبات منفصلة في 10٪ حمض الخليك مع الجهد فصل 30 كيلو فولت في الأمام (كاتيون) وعكس (أنيونات) واسطة. ويساعد وضع فصل عكسي مع 0.5 PSI الضغط إلى الأمام على الشعرية الفصل.</li>
	<li>تعيين مطياف الكتلة لجمع البيانات في إيجابية (كاتيون) أو سلبية (أنيونات) وضع على مدى كتلة 65-1000 م / ض. بين العينات، شطف الشعرية مع 0.1 M HCl، 0.1 M NaOH، DI المياه وBGE في 50 psi لمدة 2 دقيقة.</li>
</ol>

J.A.T هو موظف في شركة AB Sciex UK Ltd الذين يشاركون كشريك صناعي في مشروع ACEnano ، J.A.T وجميع المؤلفين الآخرين ليس لديهم تضارب في المصالح في هذا العمل.

هذه هي الطريقة الأولى المقترحة لتوصيف الهالة الجزيئية الحيوية الكاملة التي تتضمن البروتينات والأيض ، من نفس العينة ، باستخدام CESI-MS. القدرة على توصيف كل من البروتينات والأيض من نفس العينة سوف تزيد بشكل كبير من كمية البيانات التي تم جمعها من التعرض التجريبي واحد تمكين رؤى جديدة في عملية تشكيل الهالة وآثارها على سمية NMs وفعالية مثل الأدوية النانوية. وعلاوة على ذلك، CESI-MS هو منصة مثالية لتوصيف كل من فئتي الجزيئات الحيوية مع مجرد تغيير الشعيرات الدموية المطلوبة. للمضي قدما، فإن الأساليب الجديدة التي تم تطويرها ل CE غير المائية ستمكن من إجراء الدهون باستخدام CE-MS40 وبالتالي فمن الممكن الآن تحليل البروتينات والأيض والدهون باستخدام منصة واحدة. وسيتطلب النهج التقليدية الحالية منصتين مخصصتين للتصلب المتعدد LC، إحداهما للهالة البروتينية و واحدة للهالة المستقلب. وبالتالي، يمكن لهذا النهج جمع ضعف البيانات باستخدام منصة تحليلية واحدة.
هناك بعض المحاذير لهذا النهج لا سيما مع هالة المستقلب كما يقترح هذا البروتوكول قياس غير مباشر للهالة. على هذا النحو, قد تنشأ مشكلة عندما تكون مستويات المستقلب موجودة بتركيزات عالية بالنسبة إلى NMs والانخفاض اللاحق في تركيز المستقلب في المصفوفة صغير. ومع ذلك ، على عكس هالة البروتين ، فمن غير المرجح أن يتم تطوير نهج "مقاس واحد يناسب الجميع" لعزل هالة المستقلب بسبب وجود كيمياء سطحية فريدة من نوعها لكل NM. للمضي قدما فمن المرجح أن يتم تطوير نهج محددة NM لعزل هالة المستقلب والتحقق من صحتها ومع ذلك; وهذا ينطبق فقط على أن NM محددة. على الرغم من هذا، فإن CESI-MS لا تزال منصة مناسبة للغاية لتوصيف الأيض القطبي المشحون بغض النظر عن كيفية عزلها. وتجدر الإشارة أيضا إلى أنه إذا لم تتشكل الكريات أثناء خطوات الطرد المركزي المصممة لكريات ال NMs، فقد تكون هناك حاجة إلى قوة طرد مركزي أعلى؛ هذا هو الأكثر احتمالا أن يحدث مع NMs أقل كثافة. ومن الأهمية بمكان أيضا أن يتم الالتزام بجميع خطوات التصفية في إطار البروتوكول بسبب التجويف الضيق للشعيرات الدموية التي يمكن أن تصبح محظورة بسهولة إذا لم يتم التخلص من أي جسيمات بشكل كاف من العينة.
في حين أن هالة البروتين كانت منطقة مكثفة من البحوث لعدد من السنوات القدرة على الجمع بين ذلك مع هالة المستقلب هو مجال جديد من الاهتمام للعلماء التحقيق في واجهة النانو الحيوي6،14. حتى الآن، ركزت غالبية هذه الدراسات على غير القطبية، جزء الدهون من الهالة المستقلب9،28. هذه الطريقة الحالية تمكن من توصيف الأيض القطبية للغاية والمحملة في الهالة التي تشمل الأيض الهامة المشاركة في استقلاب الطاقة, تحلل, وتوليف الحمض النووي. ونتيجة لذلك ، عندما يقترن سير العمل البروتيوميات ، وصف أكثر شمولية من الهالة الجزيئية الحيوية ممكن. وهذا يتيح تحليلا أكثر تعمقا للتفاعلات الحيوية النانوية للمضي قدما. تمكن هذه الطريقة من تعزيز الرؤى الميكانيكية في الغدد الصماء بوساطة المستقبلات عن طريق التفاعلات البروتينية والمستقلب مع مستقبلات الأغشية. وعلاوة على ذلك، يمكن استكشاف التفاعلات بين وداخل الهالة بين البروتينات والجزيئات الصغيرة؛ على سبيل المثال، فقد تبين مؤخرا أن البروتينات في الهالة تلعب دورا رئيسيا في تجنيد الأيض15. تجدر الإشارة إلى أن النتائج التمثيلية في الشكل 3 والشكل 4 هي القياس الكمي المطلق للمثيلات ، ومع ذلك ، فإن اتباع نهج غير مستهدف باستخدام تحليل البيانات متعدد المتغيرات لمقارنة جميع ميزات CE-MS في الضوابط مقارنة بالبلازما المكشوفة من شأنه أيضا توضيح ربط المستقلب. وهكذا، هناك مجال كبير للتحقيق في كيفية، والتي، الأيض والبروتينات تؤثر على تجنيد كل منهما في الهالات NM. قد تساعد هذه الدراسات الإضافية في تصميم الهالات لتحسين تسليم الأدوية النانوية أو الكشف عن المزيد من العقبات أمام تطورها مثل قمع العمل الصيدلاني بسبب انسداد الهالة الجزيئية الحيوية أو إخفاء وظائف الاستهداف.
CESI-MS مع معدلات تدفق مقياس النانو من حوالي 20 نانولتر / دقيقة والحد الأدنى من استخدام المذيبات العضوية يقدم تحسنا في أوراق الاعتماد الخضراء والاقتصادية على معيار LC-MS و nanoLC-MS من حيث استخدام المذيبات، والتحديات الرئيسية لدراسات الأيض والبروتيوميات، على التوالي. CESI-MS يقدم نتائج قابلة للاستنساخ للغاية لكل من وقت الهجرة ومنطقة الذروة التي تقارن بشكل إيجابي مع أساليب LC-MS المستندةإلى 11،15. وعلاوة على ذلك، بالمقارنة مع نانولك-MS، ترحيل ليست قضية في CESI-MS. لذلك ، لا يلزم تنظيف النظام على نطاق واسع بين تحليلات العينات ، مما يحسن بشكل كبير من إنتاجية العينة11.
وباختصار، فإن سير العمل المقترح هو الأول الذي يفصل نهجا لتوصيف كل من البروتين ومكونات المستقلب للهالة الجزيئية الحيوية الكاملة للNMs. وهذا يفتح جانبا جديدا من التفاعلات الحيوية نانو، هالة المستقلب، وبالتالي تمكين جمع ضعف البيانات من نفس العينة، مما يتيح فهم أكثر اكتمالا للتفاعلات في واجهة النانو الحيوي.

التفاعلات الحيوية نانو، في واجهة بين الأسطح نانوماتي (NM) والمصفوفات البيولوجية التي من الجزيئات الحيوية الممتز إلى NM، هو مجال مكثف للبحوث التي تقوم عليها السلامة النانوية والطب النانوي1. هذه الطبقة من الجزيئات الحيوية الممتزة تمنح هوية بيولوجية ل NMs ، وبالتالي تحددها الخلايا بأنها "ذاتية" ، مما يؤثر لاحقا على امتصاص الخلايا وتوزيعها ونقاط النهاية البيولوجية2و3و4. وقد ركزت الغالبية العظمى من الدراسات الحيوية نانو على البروتينات داخل الهالة، وأظهرت أن البروتينات تختلف كميا ونوعيا بين NMs من مختلف التراكيب5. يعتمد هذا الاختلاف على خصائص NM مثل الحجم والوظيفية والمواد بالإضافة إلى خصائص المصفوفة البيولوجية بما في ذلك التركيب ومحتوى الملح5. وهناك مجال متزايد من الاهتمام في واجهة بيو نانو هي الأيض التي الممهرة إلى NMs6. وقد أظهرت العديد من الدراسات أنه، كما هو الحال مع البروتينات، خصائص NM هي عامل رئيسي في تحديد تكوين الأيض في الهالة وأنها يمكن أن تؤثر على النتائج البيولوجية للتعرض NM6،7،8.
في دراسات الهالة الجزيئية الحيوية هناك أربع مراحل متميزة لتوصيفها ، وتشكيل الهالة ، وعزل الجزيئات الحيوية داخل الهالة ، واكتشافها عن طريق قياس الطيف الكتلي النوعي أو الكمي وتحديد9. حتى الآن، وقد اعتمدت مجموعة من التقنيات لعزل هالة البروتين بما في ذلك الغليان في SDS-PAGE تشغيل العازلة، واستخراج المذيبات والملح أو الهضم المباشر للبروتينات في الموقع على سطح NMs. من حيث الأيض في الهالة ، والعزلة أكثر تعقيدا مع أساليب مختلفة باستخدام المذيبات أو حتى حل NMs المقترحة كحلول8،10،11. ومع ذلك ، على عكس هالة البروتين ، من غير المرجح أن ينطبق نهج "مقاس واحد يناسب الجميع" على عزل المستقلبات من NMs ، بسبب المساحة الكيميائية الواسعة التي يشغلها المستقلب وتنوع NMs المحتملة. وهناك نهج بديل هو توصيف المصفوفة البيولوجية قبل وبعد التعرض NM مع الفرق في تركيزات المستقلب يعزى إلى امتصاص الأيض إلى NMs.
هذا النهج البديل سيكون قابلا للتطبيق على جميع المركبات الحيوية وNMs وعلى الرغم من أنه لا يتطلب ضعف التحليل، فإنه يوفر بالتالي مقياسا أكثر دقة بكثير من هالة المستقلب وليس لديه خطر من انخفاض المستقلب يتعافى من سطح NM يجري مخطئا لربط منخفضة من المستقلب محددة.
الخطوة الثانية لتحليل الهالة الجزيئية الحيوية هي الكشف عن الجزيئات الحيوية. تقليديا للبروتينات في الهالة، وكان هذا اختصاص نانو LC-MS، العمود الفقري للبروتيوميات. كما تم تطبيق أساليب أخرى مثل NMR13و 1D و 2D SDS-PAGE. من حيث الهالة المستقلب LC-MS7, GC-MS8 وقد استخدمت قياس الطيف كتلة التسريب المباشر14. ومع ذلك ، بدأ نهج جديد في الآونة الأخيرة لكسب الجر ، وهي الكهروفلوريس الشعرية - قياس الطيف الكتلي (CE-MS)11،15 وكان موجودا في مختبرات NM كتقنية مستقلة لتوصيف مختلف الخصائص الفيزيائية والكيميائية للNMs16. CE-MS هو تقنية فصل متعامدة لnanoLC-MS وGC-MS وقادر على تمكين الكشف عن الأيض القطبية للغايةوالمشحنة 17،18. وعلاوة على ذلك، CE-MS هو مناسبة تماما لتحليل البروتينات وتعديلاتها بعد النقل مثل الفوسفور والجليكوزيليشن19،20،21،22. ويمكن تنفيذ الخطوة النهائية وتحديد الهوية وتحليل البيانات بعدة طرق اعتمادا على ما إذا كان يتم استخدام نهج كمي / نوعي أو مستهدف / غير مستهدف ، ومع ذلك ، يقع هذا خارج نطاق هذا البروتوكول.
CESI-MS، وهو مزيج من CE وواجهة nanoESI، هو تقدم حديث في تكنولوجيا CE باستخدام واجهة غمد. وهذا يمكن الاتصال المباشر للتدفق المنخفض للغاية CE (<20 nL/min) بمطياف كتلة عالي الدقة بدون تخفيف ، مما يؤدي إلى تحسن كبير في حساسية الكشف23و24و25. CESI-MS تمكن حجم العينات محدودة (< 10 ميكرولتر) ليتم تحليلها مع الحفاظ على تحليل حساس للغاية26. CESI-MS يقارن أيضا بشكل إيجابي إلى معدل التدفق المنخفض التقليدية نانولك-MS النهج المستخدمة في البروتيوميات وeabolomics من حيث استنساخ27،28، والإنتاجية، وتحمل أكثر مما يجعلها احتمال مثيرة لتوصيف الهالة الجزيئية الحيوية كاملة.
لتسليط الضوء على إمكانات CESI-MS لتحليل التفاعلات الحيوية نانو هذا العمل يصف إعداد العينة المطلوبة لعزل الهالة الجزيئية الحيوية NM من عينة البلازما البشرية واحدة بطريقة لتحقيق أقصى قدر من البيانات من كل من البروتين وجوانب المستقلب من هالة NM الجزيئية الحيوية الكاملة. بينما نحن تقرير عن استخدام البلازما البشرية، وهذا البروتوكول يكون مناسبا على قدم المساواة لالسوائل الحيوية الأخرى مثل مصل الدم، كامل الخلايا المتوسطة ثقافة، lysate الخلية، السائل النخاعي أو البول. ثم سيتم وصف تحليلات هذين المكونين (البروتينات والأيض) باستخدام الشعيرات الدموية المحايدة المغلفة CESI للهالة البروتين والشعيرات الدموية السيليكا المنصهرة العارية لكل من الأيض القيصري والأيوني.

<table><tbody><tr><td>1,4-Dithiothreitol</td><td>Sigma</td><td>10197777001</td><td></td></tr><tr><td>2,2,4,4-D4-citric</td><td>Simga</td><td>485438-1G</td><td>Internal standard anion</td></tr><tr><td>Ammonium Acetate &gt;98%</td><td>Sigma</td><td>A1542</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium Bicarbonate &gt;99.5%</td><td>Sigma</td><td>09830</td><td></td></tr><tr><td>Capillary cartridge coolant</td><td>Sciex</td><td>359976</td><td></td></tr><tr><td>CESI 8000 instrument</td><td>Sciex</td><td>A98089</td><td></td></tr><tr><td>CESI Cap</td><td>Sciex</td><td>B24699</td><td></td></tr><tr><td>CESI Vials</td><td>Sciex</td><td>B11648</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Sigma</td><td>650498</td><td>Toxic, use in a fume hood</td></tr><tr><td>Glacial Acetic acid</td><td>Sigma</td><td>A6283</td><td></td></tr><tr><td>Hydrochloric acid 1mol/L</td><td>Sigma</td><td>43617</td><td></td></tr><tr><td>Iosoacetamide</td><td>Sigma</td><td>I1149</td><td></td></tr><tr><td>L-methionine sulfone</td><td>Sigma</td><td>M0876-1G</td><td>Internal standard cation</td></tr><tr><td>Methonal (LC-MS Ultra Chromasolve)</td><td>Sigma</td><td>14262</td><td>Use in a fume hood</td></tr><tr><td>Microvials</td><td>Sciex</td><td>144709</td><td></td></tr><tr><td>nanoVials</td><td>Sciex</td><td>5043467</td><td></td></tr><tr><td>Neutral Surface Cartridge 30 &amp;micro;M ID x 90 cm total length</td><td>Sciex</td><td>B07368</td><td></td></tr><tr><td>OptiMS Adapter for Sciex Nanospray III source</td><td>Sciex</td><td>B07363</td><td>B07366 and B83386 for Thermo mass spectrometers, B85397 for Waters mass spectrometers, B86099 for Bruker mass spectrometers</td></tr><tr><td>OptiMS Fused-Silica Cartridge 30 &amp;micro;m ID x 90 cm total length</td><td>Sciex</td><td>B07367</td><td></td></tr><tr><td>Phospahte buffered saline 10x</td><td>Sigma</td><td>P7059</td><td></td></tr><tr><td>Pierce C18 Tips, 100 &amp;micro;L bed</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>87784</td><td></td></tr><tr><td>Polystyrene 100 nm</td><td>Polysciences Inc</td><td>876</td><td></td></tr><tr><td>Polystyrene carboxylated 100 nm</td><td>Polysciences Inc</td><td>16688</td><td></td></tr><tr><td>Polystyrene carboxylated 1000 nm</td><td>Polysciences Inc</td><td>08226</td><td></td></tr><tr><td>Rapigest SF (surfactant)</td><td>Waters</td><td>186001860</td><td></td></tr><tr><td>Sequencing Grade modified Trypsin</td><td>Promega</td><td>V5111</td><td></td></tr><tr><td>SiO2 Ludox TM-40</td><td>Sigma</td><td>420786</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Hydroxide solution</td><td>Simga</td><td>72079</td><td></td></tr><tr><td>TiO2 Dispex coated</td><td>Promethion particles</td><td>Bespoke particles</td><td></td></tr><tr><td>TiO2 PVP coated</td><td>Promethion particles</td><td>Bespoke particles</td><td></td></tr><tr><td>TiO2 uncoated</td><td>Promethion particles</td><td>Bespoke particles</td><td></td></tr></tbody></table>

capillary electrophoresis mass spectrometry approaches for characterization of the protein and metabolite corona acquired by nanomaterials

كان امتصاص الجزيئات الحيوية من المصفوفات البيولوجية المحيطة إلى سطح المواد النانوية (NMs) لتشكيل الهالة موضع اهتمام على مدى العقد الماضي. ينشأ الاهتمام بالواجهة الحيوية النانوية من حقيقة أن الهالة الجزيئية الحيوية تمنح هوية بيولوجية ل NMs وبالتالي تجعل الجسم يحددها على أنها "ذاتية". على سبيل المثال، أظهرت الدراسات السابقة أن البروتينات الموجودة في الهالة قادرة على التفاعل مع مستقبلات الأغشية للتأثير على امتصاص الخلايا وأثبتت أن الهالة مسؤولة عن الاتجار الخلوي بالأجهزة NMs وسمية ها في نهاية المطاف. حتى الآن، ركزت معظم الأبحاث على هالة البروتين وتجاهلت الآثار المحتملة للمييضات المدرجة في الهالة أو الآثار التآزرية بين المكونات في الهالة الجزيئية الحيوية الكاملة. على هذا النحو، يوضح هذا العمل منهجيات لتوصيف كل من مكونات البروتين وال المستقلب من الهالة الجزيئية الحيوية باستخدام نهج البروتيوميات من أسفل إلى أعلى ونواتج الأيض بالتوازي. وهذا يشمل هضم على الجسيمات من هالة البروتين مع السطحي المستخدمة لزيادة استعادة البروتين, وتوصيف سلبي للهالة المستقلب من خلال تحليل المصفوفات المستقلب قبل وبعد التعرض NM. يقدم هذا العمل الكهروفورسيس الشعري – قياس الطيف الكتلي (CESI-MS) كتقنية جديدة لتوصيف هالة NM. وتبين البروتوكولات المبينة هنا كيف يمكن استخدام CESI-MS لتوصيف موثوق به لكل من البروتين والهالة المستقلب التي حصلت عليها NMs. الانتقال إلى CESI-MS يقلل بشكل كبير من حجم العينة المطلوبة (مقارنة بالكروماتوغرافيا السائلة التقليدية - نهج قياس الطيف الكتلي (LC-MS) مع حقن متعددة ممكنة من أقل من 5 ميكرولتر من العينة ، مما يجعلها مثالية للعينات المحدودة الحجم. وعلاوة على ذلك، فإن العواقب البيئية للتحليل تنخفض فيما يتعلق بالتصلب المتعدد LC بسبب انخفاض معدلات التدفق (<20 nL/min) في CESI-MS، واستخدام الشوارد المائية التي تلغي الحاجة إلى المذيبات العضوية.

الطريقة الموصوفة هي الأولى التي تميز كل من البروتينات والأيض في هالة الجزيئية الحيوية NM باستخدام نفس عينة البلازما البشرية. هذه الطريقة قادرة على الكشف عن >200 البروتينات ونواتج الأيض >150، وبالتالي تمكين نظرة عامة أشمل من الهالة الجزيئية الحيوية الكاملة التي يتعين تحديدها، مما يتيح تعزيز فهم المرفق الخلوي NMs، وامتصاص والآثار.
استخدام CESI-MS لكلا البروتيوميات(الشكل 1)و metabolomics (الشكل 2) الفصل والكشف يظهر نوافذ فصل جيدة على كل من الشعيرات الدموية لكل نهج.
هذه الطريقة قادرة على التمييز بين البروتينات في الهالة عبر مجموعة واسعة من التراكيب NMs، مما يدل على قابلية الأساليب للتطبيق على NMs عبر مجموعة واسعة من الخصائص الفيزيائية والكيميائية(الجدول 1).
ويمكن أيضا تمييز بصمات الأصابع الفريدة من هالة المستقلب باستخدام الفرع الأيضي لهذه المنهجية(الشكل 3). على الرغم من أن هذا النهج يستخدم نهجا سلبيا لتوصيف هالة الأيض NM أنها لا تزال قادرة على الكشف عن رؤى مثيرة للاهتمام في دور الأيض في الهالة الجزيئية الحيوية مثل الامتزاز التفاضلي للأيزومرات (الشكل 4).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61760/61760fig01.jpg"> الشكل 1: تصوير كهربي مثالي لفصل كورونا البروتيني SiO2 باستخدام CESI-MS بعد هضم على الجسيمات. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61760/61760fig01large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61760/61760fig02.jpg"> الشكل 2: مثال على الكتروفيروغرامات الأيونية المستخرجة التي تم الحصول عليها من المركبات الذاتية في البلازما بواسطة CE-MS. المركبات المرقم هي على النحو التالي: 1. Ornithine; 2. ليسين؛ 3. أرجينين; 4. هيستيدين؛ 5. الكرياتين; 6. غليسين; 7. ألانين؛ 8. فالين؛ 9. إيسولوسين; 10. ليوستين; 11. سيرين; 12. ثريونين; 13. الهليون; 14. ميثيونين; 15. الجلوتامين; 16. حمض الغلوتاميك. 17. فينيل-D5-ألانين; 18- فينيل ألانين؛ 19. تيروزين; 20. برولين; 21- ميثيونين سلفون (معيار داخلي). نشرت تحت وصول مفتوح الإبداعية المشاع CC BY الترخيص واستنسخت من تشانغ وآخرون17. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61760/61760fig02large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
الجدول 1: تحليل هالة البروتين عبر مجموعة من 6 NMs. خريطة الحرارة لفئات البروتين المحددة على السيليكا (SiO2)،تيتانيا (TiO2)،PVP توج تيتانيا (TiO2-PVP)، dispex توج تيتانيا (TiO2-Dispex)، البوليسترين وكاربوكسيلات البوليسترين NMs. النسب المئوية تشير إلى وفرة البروتينات نسبة إلى إجمالي محتوى البروتين على أساس أعلى 3 الببتيدات وفرة لكل بروتين. وبالنظر إلى الاختلافات التي لوحظت في وفرة النسبية من البروتينات في الهالات NM مختلفة، فمن الواضح أن هذا البروتوكول المقترح حساسة بما فيه الكفاية للتمييز بين هالة البروتين من مختلف NMs. الشكل المستنسخة من تحليل CESI-MS من هالة البروتين، نشرت تحت وصول مفتوح المشاع الإبداعي CC BY ترخيص11. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61760/Table_1.xlsx" target="_blank">الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الجدول.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61760/61760fig03.jpg"> الشكل 3: تحليل مستهدف للمييضات cationic في هالة NM. الامتزاز من الكاتيونات إلى SiO2 و TiO2 NMs. الأحمر يشير إلى التركيز الأولي من الأيض في حين يشير الأزرق إلى تركيز الأيض بعد حضانة 1 ساعة مع NMs في 37 درجة مئوية. انخفاض تركيز المستقلب في المحلول هو نتيجة امتصاص المستقلب إلى سطح NM. لم يلاحظ أي امتصاص كبير من الأيض للبوليسترين NMs. تمثل مخططات المربع القيم الدنيا والقصه، والنطاقات الوسيطة والبينية. الرقم المستنسخ من تحليل CESI-MS المستهدف للهالة المستقلب المنشورة بموجب ترخيص Creative Commons CC BY15. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61760/61760fig03large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61760/61760fig04.jpg"> الشكل 4: تحليل مستهدف من الأيض الانيوني في هالة NM مع التركيز على الامتزاز الإيزومر. يظهر الامتزاز من أنيونات لمجموعة من الأجهزة التيتانيومية اختلافات واضحة بين ايزوميرات مختلفة مثل فوسفات السكر. الأحمر يشير إلى التركيز الأولي من الأيض في حين يشير الأزرق إلى تركيز الأيض بعد حضانة 1 ساعة مع NM في 37 درجة مئوية. انخفاض تركيز المستقلب في المحلول هو نتيجة امتصاص المستقلب إلى سطح NM. لم يلاحظ أي امتصاص كبير من الأيض لSIO2 والمؤامرات NMs. البوليسترين مربع تمثل القيم الدنيا والقصى، ومتوسط ونطاقات بين الكوارتيل. الرقم المستنسخ من تحليل CESI-MS المستهدف للهالة المستقلب المنشورة تحت وصول مفتوح الإبداعية المشتركة CC BY ترخيص15. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61760/61760fig04large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>أنوليت</td>
			<td>متوسط منطقة ذروة RSD</td>
			<td>متوسط وقت ترحيل RSD</td>
		</tr>
<tr>
<td>1928 الببتيدات خلال اليوم (ن = 3)</td>
			<td>15%</td>
			<td>0.30%</td>
		</tr>
<tr>
<td>27 كاتيون خلال اليوم (ن = 16)</td>
			<td>5.80%</td>
			<td>2.20%</td>
		</tr>
<tr>
<td>27 cation بين اليوم (ن = 36)</td>
			<td>8.60%</td>
			<td>1.80%</td>
		</tr>
</tbody></table>الجدول 2: استنساخ النسخ المتماثلة التقنية CESI-MS للببتيدات والأيض cationic. RSD: الانحراف المعياري النسبي، كمقياس للتكرار. إن إمكانية إعادة إنتاج CESI-MS من حيث مناطق الذروة وأوقات الهجرة جيدة جدا ، حيث يكون لدى جميع التحليلات متوسط RSD <15٪ وأوقات الهجرة <2.2٪. وتبين هذه النتائج درجة الثقة العالية التي يمكن أن تعزى إلى البيانات التي تم جمعها باستخدام هذه التقنية وتؤكد أن الاختلافات المكتشفة ترجع إلى اختلافات حقيقية في تكوين العينة (الإثراء على ال NMs) بدلا من الاختلاف التحليلي. يتم إنشاء الجدول 2 من النتائج المعروضة سابقا11،15.

Watch this Scientific Journal Video about Capillary Electrophoresis Mass Spectrometry Approaches for Characterization of the Protein and Metabolite Corona Acquired by Nanomaterials at JoVE.com

Capillary Electrophoresis Mass Spectrometry Approaches for Characterization of the Protein and Metabolite Corona Acquired by Nanomaterials

هنا نقدم بروتوكولا لتوصيف الهالة الجزيئية الحيوية الكاملة والبروتينات والأيضات ، التي تم الحصول عليها بواسطة المواد النانوية من السوائل الحيوية باستخدام الكهروفلوريس الشعري - نهج قياس الطيف الكتلي.

نهج قياس الطيف الكتلي للكهربائية الشعرية لتوصيف البروتين والايض كورونا المكتسبة من المواد النانوية

The adsorption of biomolecules from surrounding biological matrices to the surface of nanomaterials (NMs) to form the corona has been of interest for the ...

capillary-electrophoresis-mass-spectrometry-approaches-for

Research

JoVE Journal

Chemistry

4.4K Views.  University of Birmingham. هنا نقدم بروتوكولا لتوصيف الهالة الجزيئية الحيوية الكاملة والبروتينات والأيضات ، التي تم الحصول عليها بواسطة المواد النانوية من السوائل الحيوية باستخدام الكهروفلوريس الشعري - نهج قياس الطيف الكتلي.

Video: Capillary Electrophoresis Mass Spectrometry Approaches for Characterization of the Protein and Metabolite Corona Acquired by Nanomaterials

Sheathless Capillary Electrophoresis&#8211;Mass Spectrometry for Metabolic Profiling of Biological Samples

In metabolomics, a wide range of analytical techniques is used for the global profiling of (endogenous) metabolites in complex samples. In this paper, a protocol is presented for the analysis of anionic and cationic metabolites in biological samples by capillary electrophoresis&#8211;mass spectrometry (CE-MS). CE is well-suited for the analysis of highly polar and charged metabolites as compounds are separated on the basis of their charge-to-size ratio. A recently developed sheathless interfacing design, i.e., a porous tip interface, is used for coupling CE to electrospray ionization (ESI) MS. This interfacing approach allows the effective use of the intrinsically low-flow property of CE in combination with MS, resulting in nanomolar detection limits for a broad range of polar metabolite classes. The protocol presented here is based on employing a bare fused-silica capillary with a porous tip emitter at low-pH separation conditions for the analysis of a broad array of metabolite classes in biological samples. It is demonstrated that the same sheathless CE-MS method can be used for the profiling of cationic metabolites, including amino acids, nucleosides and small peptides, or anionic metabolites, including sugar phosphates, nucleotides and organic acids, by only switching the MS detection and separation voltage polarity. Highly information-rich metabolic profiles in various biological samples, such as urine, cerebrospinal fluid and extracts of the glioblastoma cell line, can be obtained by this protocol in less than 1 hr of CE-MS analysis.

A protocol for metabolic profiling of biological samples by capillary electrophoresis&#8211;mass spectrometry using a sheathless porous tip interface design is presented.

Sheathless شعري الكهربائي-الطيف الكتلي لالاستقلابية من التنميط العينات البيولوجية

In metabolomics, a wide range of analytical techniques is used for the global profiling of (endogenous) metabolites in complex samples. In this paper, a ...

Biochemistry

Extraction of Aqueous Metabolites from Cultured Adherent Cells for Metabolomic Analysis by Capillary Electrophoresis-Mass Spectrometry

Metabolomic analysis is a promising omics approach to not only understand the specific metabolic regulation in cancer cells compared to normal cells but also to identify biomarkers for early-stage cancer detection and prediction of chemotherapy response in cancer patients. Preparation of uniform samples for metabolomic analysis is a critical issue that remains to be addressed. Here, we present an easy and reliable protocol for extracting aqueous metabolites from cultured adherent cells for metabolomic analysis using capillary electrophoresis-mass spectrometry (CE-MS). Aqueous metabolites from cultured cells are analyzed by culturing and washing cells, treating cells with methanol, extracting metabolites, and removing proteins and macromolecules with spin columns for CE-MS analysis. Representative results using lung cancer cell lines treated with diamide, an oxidative reagent, illustrate the clearly observable metabolic shift of cells under oxidative stress. This article would be especially valuable to students and investigators involved in metabolomics research, who are new to harvesting metabolites from cell lines for analysis by CE-MS.

The purpose of this article is to describe a protocol for extraction of aqueous metabolites from cultured adherent cells for metabolomic analysis, particularly, capillary electrophoresis-mass spectrometry.

استخراج الأيض المائي من خلايا ملتصقة مثقفه للتحليل الأيضي بواسطة الكهربائي الكهربي-الطيف الكتلي

Metabolomic analysis is a promising omics approach to not only understand the specific metabolic regulation in cancer cells compared to normal cells but ...

Cancer Research

Characterization of Proteins by Size-Exclusion Chromatography Coupled to Multi-Angle Light Scattering (SEC-MALS)

Analytical size-exclusion chromatography (SEC), commonly used for the determination of the molecular weight of proteins and protein-protein complexes in solution, is a relative technique that relies on the elution volume of the analyte to estimate molecular weight. When the protein is not globular or undergoes non-ideal column interactions, the calibration curve based on protein standards is invalid, and the molecular weight determined from elution volume is incorrect. Multi-angle light scattering (MALS) is an absolute technique that determines the molecular weight of an analyte in solution from basic physical equations. The combination of SEC for separation with MALS for analysis constitutes a versatile, reliable means for characterizing solutions of one or more protein species including monomers, native oligomers or aggregates, and heterocomplexes. Since the measurement is performed at each elution volume, SEC-MALS can determine if an eluting peak is homogeneous or heterogeneous and distinguish between a fixed molecular weight distribution versus dynamic equilibrium. Analysis of modified proteins such as glycoproteins or lipoproteins, or conjugates such as detergent-solubilized membrane proteins, is also possible. Hence, SEC-MALS is a critical tool for the protein chemist who must confirm the biophysical properties and solution behavior of molecules produced for biological or biotechnological research. This protocol for SEC-MALS analyzes the molecular weight and size of pure protein monomers and aggregates. The data acquired serve as a foundation for further SEC-MALS analyses including those of complexes, glycoproteins and surfactant-bound membrane proteins.

Characterization of Proteins by Size-Exclusion Chromatography Coupled to Multi-Angle Light Scattering SEC-MALS

This protocol describes the combination of size exclusion chromatography with multi-angle light scattering (SEC-MALS) for absolute characterization of proteins and complexes in solution. SEC-MALS determines the molecular weight and size of pure proteins, native oligomers, heterocomplexes and modified proteins such as glycoproteins.

توصيف البروتينات حسب الحجم والاستبعاد الكروماتوغرافيا المقترنة بتشتت الضوء متعدد الزوايا (SEC-MALS)

Analytical size-exclusion chromatography (SEC), commonly used for the determination of the molecular weight of proteins and protein-protein complexes in ...

Large-scale Top-down Proteomics Using Capillary Zone Electrophoresis Tandem Mass Spectrometry

Capillary zone electrophoresis-electrospray ionization-tandem mass spectrometry (CZE-ESI-MS/MS) has been recognized as a useful tool for top-down proteomics that aims to characterize proteoforms in complex proteomes. However, the application of CZE-MS/MS for large-scale top-down proteomics has been impeded by the low sample-loading capacity and narrow separation window of CZE. Here, a protocol is described using CZE-MS/MS with a microliter-scale sample-loading volume and a 90-min separation window for large-scale top-down proteomics. The CZE-MS/MS platform is based on a linear polyacrylamide (LPA)-coated separation capillary with extremely low electroosmotic flow, a dynamic pH-junction-based online sample concentration method with a high efficiency for protein stacking, an electro-kinetically pumped sheath flow CE-MS interface with extremely high sensitivity, and an ion trap mass spectrometer with high mass resolution and scan speed. The platform can be used for the high-resolution characterization of simple intact protein samples and the large-scale characterization of proteoforms in various complex proteomes. As an example, a highly efficient separation of a standard protein mixture and a highly sensitive detection of many impurities using the platform is demonstrated. As another example, this platform can produce over 500 proteoform and 190 protein identifications from an Escherichia coli proteome in a single CZE-MS/MS run.

A detailed protocol is described for the separation, identification, and characterization of proteoforms in protein samples using capillary zone electrophoresis-electrospray ionization-tandem mass spectrometry (CZE-ESI-MS/MS). The protocol can be used for the high-resolution characterization of proteoforms in simple protein samples and the large-scale identification of proteoforms in complex proteome samples.

البروتيوميات من أعلى إلى أسفل على نطاق واسع باستخدام المنطقة الشعرية التفريد جنبا إلى جنب الكتلي

Capillary zone electrophoresis-electrospray ionization-tandem mass spectrometry (CZE-ESI-MS/MS) has been recognized as a useful tool for top-down ...

Capillary Electrophoresis-based Hydrogen/Deuterium Exchange for Conformational Characterization of Proteins with Top-down Mass Spectrometry

Resolving conformational heterogeneity of multiple protein states that coexist in solution remains one of the main obstacles in the characterization of protein therapeutics and the determination of the conformational transition pathways critical for biological functions, ranging from molecular recognition to enzymatic catalysis. Hydrogen/deuterium exchange (HDX) reaction coupled with top-down mass spectrometric (MS) analysis provides a means to characterize protein higher-order structures and dynamics in a conformer-specific manner. The conformational resolving power of this technique is highly dependent on the efficiencies of separating protein states at the intact protein level and minimizing the residual non-deuterated protic content during the HDX reactions. 
Here we describe a capillary electrophoresis (CE)-based variant of the HDX MS approach that aims to improve the conformational resolution. In this approach, proteins undergo HDX reactions while migrating through a deuterated background electrolyte solution (BGE) during the capillary electrophoretic separation. Different protein states or proteoforms that coexist in solution can be efficiently separated based on their differing charge-to-size ratios. The difference in electrophoretic mobility between proteins and protic solvent molecules minimizes the residual non-deuterated solvent, resulting in a nearly complete deuterating environment during the HDX process. The flow-through microvial CE-MS interface allows efficient electrospray ionization of the eluted protein species following a rapid mixing with the quenching and denaturing modifier solution at the outlet of the sprayer. The online top-down MS analysis measures the global deuteration level of the eluted intact protein species, and subsequently, the deuteration of their gas-phase fragments. This paper demonstrates this approach in differential HDX for systems, including the natural protein variants coexisting in milk.

Presented here is a protocol for a capillary electrophoresis-based hydrogen/deuterium exchange (HDX) approach coupled with top-down mass spectrometry. This approach characterizes the difference in higher-order structures between different protein species, including proteins in different states and different proteoforms, by conducting concurrent differential HDX and electrophoretic separation.

تبادل الهيدروجين / الديوتيريوم القائم على الرحلان الكهربائي الشعري للتوصيف التوافقي للبروتينات باستخدام مطياف الكتلة من أعلى إلى أسفل

Resolving conformational heterogeneity of multiple protein states that coexist in solution remains one of the main obstacles in the characterization of ...

Analyzing Large Protein Complexes by Structural Mass Spectrometry

Living cells control and regulate their biological processes through the coordinated action of a large number of proteins that assemble themselves into an array of dynamic, multi-protein complexes1. To gain a mechanistic understanding of the various cellular processes, it is crucial to determine the structure of such protein complexes, and reveal how their structural organization dictates their function. Many aspects of multi-protein complexes are, however, difficult to characterize, due to their heterogeneous nature, asymmetric structure, and dynamics. Therefore, new approaches are required for the study of the tertiary levels of protein organization.
One of the emerging structural biology tools for analyzing macromolecular complexes is mass spectrometry (MS)2-5. This method yields information on the complex protein composition, subunit stoichiometry, and structural topology. The power of MS derives from its high sensitivity and, as a consequence, low sample requirement, which enables examination of protein complexes expressed at endogenous levels. Another advantage is the speed of analysis, which allows monitoring of reactions in real time. Moreover, the technique can simultaneously measure the characteristics of separate populations co-existing in a mixture. 
Here, we describe a detailed protocol for the application of structural MS to the analysis of large protein assemblies. The procedure begins with the preparation of gold-coated capillaries for nanoflow electrospray ionization (nESI). It then continues with sample preparation, emphasizing the buffer conditions which should be compatible with nESI on the one hand, and enable to maintain complexes intact on the other. We then explain, step-by-step, how to optimize the experimental conditions for high mass measurements and acquire MS and tandem MS spectra. Finally, we chart the data processing and analyses that follow. Rather than attempting to characterize every aspect of protein assemblies, this protocol introduces basic MS procedures, enabling the performance of MS and MS/MS experiments on non-covalent complexes. Overall, our goal is to provide researchers unacquainted with the field of structural MS, with knowledge of the principal experimental tools.

Mass spectrometry has proven to be a valuable tool for analyzing large protein complexes. This method enables insights into the composition, stoichiometry and overall architecture of multi-subunit assemblies. Here, we describe, step-by-step, how to perform a structural mass spectrometry analysis, and characterize macromolecular structures.

تحليل البروتين المجمعات الكبيرة التي الطيف الكتلي الإنشائية

Living cells control and regulate their biological processes through the coordinated action of a large number of proteins that assemble themselves into an ...

Biology

T-wave Ion Mobility-mass Spectrometry: Basic Experimental Procedures for Protein Complex Analysis

Ion mobility (IM) is a method that measures the time taken for an ion to travel through a pressurized cell under the influence of a weak electric field. The speed by which the ions traverse the drift region depends on their size: large ions will experience a greater number of collisions with the background inert gas (usually N2) and thus travel more slowly through the IM device than those ions that comprise a smaller cross-section. In general, the time it takes for the ions to migrate though the dense gas phase separates them, according to their collision cross-section (&Omega;). 
Recently, IM spectrometry was coupled with mass spectrometry and a traveling-wave (T-wave) Synapt ion mobility mass spectrometer (IM-MS) was released. Integrating mass spectrometry with ion mobility enables an extra dimension of sample separation and definition, yielding a three-dimensional spectrum (mass to charge, intensity, and drift time). This separation technique allows the spectral overlap to decrease, and enables resolution of heterogeneous complexes with very similar mass, or mass-to-charge ratios, but different drift times. Moreover, the drift time measurements provide an important layer of structural information, as &Omega; is related to the overall shape and topology of the ion. The correlation between the measured drift time values and &Omega; is calculated using a calibration curve generated from calibrant proteins with defined cross-sections1.
The power of the IM-MS approach lies in its ability to define the subunit packing and overall shape of protein assemblies at micromolar concentrations, and near-physiological conditions1. Several recent IM studies of both individual proteins2,3 and non-covalent protein complexes4-9, successfully demonstrated that protein quaternary structure is maintained in the gas phase, and highlighted the potential of this approach in the study of protein assemblies of unknown geometry. Here, we provide a detailed description of IMS-MS analysis of protein complexes using the Synapt (Quadrupole-Ion Mobility-Time-of-Flight) HDMS instrument (Waters Ltd; the only commercial IM-MS instrument currently available)10. We describe the basic optimization steps, the calibration of collision cross-sections, and methods for data processing and interpretation. The final step of the protocol discusses methods for calculating theoretical &Omega; values. Overall, the protocol does not attempt to cover every aspect of IM-MS characterization of protein assemblies; rather, its goal is to introduce the practical aspects of the method to new researchers in the field.

Ion mobility-mass spectrometry is an emerging gas-phase technology that separates ions, based on their collision cross-section and mass. The method provides three-dimensional information on the overall topology and shape of protein complexes. Here, we outline a basic procedure for instrument setting and optimization, calibration of drift times, and data interpretation.

تي موجة ايون التنقل الكتلة الطيفي : الإجراءات التجريبية الأساسية لتحليل البروتين مجمع

Ion mobility (IM) is a method that measures the time taken for an ion to travel through a pressurized cell under the influence of a weak electric field. ...

Profiling of Methyltransferases and Other S-adenosyl-L-homocysteine-binding Proteins by Capture Compound Mass Spectrometry (CCMS)

There is a variety of approaches to reduce the complexity of the proteome on the basis of functional small molecule-protein interactions such as affinity chromatography 1 or Activity Based Protein Profiling 2. Trifunctional Capture Compounds (CCs, Figure 1A) 3 are the basis for a generic approach, in which the initial equilibrium-driven interaction between a small molecule probe (the selectivity function, here S-adenosyl-L-homocysteine, SAH, Figure 1A) and target proteins is irreversibly fixed upon photo-crosslinking between an independent photo-activable reactivity function (here a phenylazide) of the CC and the surface of the target proteins. The sorting function (here biotin) serves to isolate the CC - protein conjugates from complex biological mixtures with the help of a solid phase (here streptavidin magnetic beads). Two configurations of the experiments are possible: "off-bead" 4 or the presently described "on-bead" configuration (Figure 1B). The selectivity function may be virtually any small molecule of interest (substrates, inhibitors, drug molecules).
S-Adenosyl-L-methionine (SAM, Figure 1A) is probably, second to ATP, the most widely used cofactor in nature 5, 6. It is used as the major methyl group donor in all living organisms with the chemical reaction being catalyzed by SAM-dependent methyltransferases (MTases), which methylate DNA 7, RNA 8, proteins 9, or small molecules 10. Given the crucial role of methylation reactions in diverse physiological scenarios (gene regulation, epigenetics, metabolism), the profiling of MTases can be expected to become of similar importance in functional proteomics as the profiling of kinases. Analytical tools for their profiling, however, have not been available. We recently introduced a CC with SAH as selectivity group to fill this technological gap (Figure 1A).
SAH, the product of SAM after methyl transfer, is a known general MTase product inhibitor 11. For this reason and because the natural cofactor SAM is used by further enzymes transferring other parts of the cofactor or initiating radical reactions as well as because of its chemical instability 12, SAH is an ideal selectivity function for a CC to target MTases. Here, we report the utility of the SAH-CC and CCMS by profiling MTases and other SAH-binding proteins from the strain DH5&alpha; of Escherichia coli (E. coli), one of the best-characterized prokaryotes, which has served as the preferred model organism in countless biochemical, biological, and biotechnological studies. Photo-activated crosslinking enhances yield and sensitivity of the experiment, and the specificity can be readily tested for in competition experiments using an excess of free SAH.

Profiling of Methyltransferases and Other S-adenosyl-L-homocysteine-binding Proteins by Capture Compound Mass Spectrometry CCMS

Capture Compounds are trifunctional small molecules to reduce the complexity of the proteome by functional reversible small molecule-protein interaction followed by photo-crosslinking and purification. Here we use a Capture Compound with S-adenosyl-L-homocysteine-binding as selectivity function to isolate methyltransferases from an Escherichia coli whole cell lysate and identify them by MS.

التنميط وغيره من Methyltransferases S - adenosyl - L - الهموسيستين ملزم البروتينات المركبة من قبل التقاط الطيف الكتلي (CCMS)

There is a variety of approaches to reduce the complexity of the proteome on the basis of functional small molecule-protein interactions such as affinity ...

A Protocol for the Identification of Protein-protein Interactions Based on 15N Metabolic Labeling, Immunoprecipitation, Quantitative Mass Spectrometry and Affinity Modulation

Protein-protein interactions are fundamental for many biological processes in the cell. Therefore, their characterization plays an important role in current research and a plethora of methods for their investigation is available1. Protein-protein interactions often are highly dynamic and may depend on subcellular localization, post-translational modifications and the local protein environment2. Therefore, they should be investigated in their natural environment, for which co-immunoprecipitation approaches are the method of choice3. Co-precipitated interaction partners are identified either by immunoblotting in a targeted approach, or by mass spectrometry (LC-MS/MS) in an untargeted way. The latter strategy often is adversely affected by a large number of false positive discoveries, mainly derived from the high sensitivity of modern mass spectrometers that confidently detect traces of unspecifically precipitating proteins. A recent approach to overcome this problem is based on the idea that reduced amounts of specific interaction partners will co-precipitate with a given target protein whose cellular concentration is reduced by RNAi, while the amounts of unspecifically precipitating proteins should be unaffected. This approach, termed QUICK for QUantitative Immunoprecipitation Combined with Knockdown4, employs Stable Isotope Labeling of Amino acids in Cell culture (SILAC)5 and MS to quantify the amounts of proteins immunoprecipitated from wild-type and knock-down strains. Proteins found in a 1:1 ratio can be considered as contaminants, those enriched in precipitates from the wild type as specific interaction partners of the target protein. Although innovative, QUICK bears some limitations: first, SILAC is cost-intensive and limited to organisms that ideally are auxotrophic for arginine and/or lysine. Moreover, when heavy arginine is fed, arginine-to-proline interconversion results in additional mass shifts for each proline in a peptide and slightly dilutes heavy with light arginine, which makes quantification more tedious and less accurate5,6. Second, QUICK requires that antibodies are titrated such that they do not become saturated with target protein in extracts from knock-down mutants.
Here we introduce a modified QUICK protocol which overcomes the abovementioned limitations of QUICK by replacing SILAC for 15N metabolic labeling and by replacing RNAi-mediated knock-down for affinity modulation of protein-protein interactions. We demonstrate the applicability of this protocol using the unicellular green alga Chlamydomonas reinhardtii as model organism and the chloroplast HSP70B chaperone as target protein7 (Figure 1). HSP70s are known to interact with specific co-chaperones and substrates only in the ADP state8. We exploit this property as a means to verify the specific interaction of HSP70B with its nucleotide exchange factor CGE19.

A Protocol for the Identification of Protein-protein Interactions Based on 15N Metabolic Labeling, Immunoprecipitation, Quantitative Mass Spectrometry and Affinity Modulation

We present a variation of the QUICK (QUantitative Immunoprecipitation Combined with Knockdown) approach that was introduced previously to distinguish between true and false protein-protein interactions. Our approach is based on 15N metabolic labeling, the modulation of affinities of protein-protein interactions by the presence/absence of ATP, immunoprecipitation, and quantitative mass spectrometry.

بروتوكول لتحديد البروتين البروتين التفاعلات على أساس<sup&gt; 15</sup&gt; N صفها الأيض، مناعي، الكمي والتحوير الطيف الكتلي الانجذاب

Protein-protein interactions are fundamental for many biological processes in the cell. Therefore, their characterization plays an important role in ...

Discovering Protein Interactions and Characterizing Protein Function Using HaloTag Technology

Research in proteomics has exploded in recent years with advances in mass spectrometry capabilities that have led to the characterization of numerous proteomes, including those from viruses, bacteria, and yeast.&#160; In comparison, analysis of the human proteome lags behind, partially due to the sheer number of proteins which must be studied, but also the complexity of networks and interactions these present. To specifically address the challenges of understanding the human proteome, we have developed HaloTag technology for protein isolation, particularly strong for isolation of multiprotein complexes and allowing more efficient capture of weak or transient interactions and/or proteins in low abundance. &#160;HaloTag is a genetically encoded protein fusion tag, designed for covalent, specific, and rapid immobilization or labelling of proteins with various ligands. Leveraging these properties, numerous applications for mammalian cells were developed to characterize protein function and here we present methodologies including: protein pull-downs used for discovery of novel interactions or functional assays, and cellular localization. We find significant advantages in the speed, specificity, and covalent capture of fusion proteins to surfaces for proteomic analysis as compared to other traditional non-covalent approaches. We demonstrate these and the broad utility of the technology using two important epigenetic proteins as examples, the human bromodomain protein BRD4, and histone deacetylase HDAC1.&#160; These examples demonstrate the power of this technology in enabling &#160;the discovery of novel interactions and characterizing cellular localization in eukaryotes, which will together further understanding of human functional proteomics. &#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;

HaloTag technology is a multifunctional technology which has shown significant success in isolation of both small and large protein complexes from mammalian cells.&#160; Here we highlight the advantages of this technology compared to existing alternatives and demonstrate its utility to study numerous aspects of protein function inside eukaryotic cells.

اكتشاف بروتين تفاعلات البروتين وتميز وظيفة عن طريق HaloTag تكنولوجيا

Research in proteomics has exploded in recent years with advances in mass spectrometry capabilities that have led to the characterization of numerous ...

نهج قياس الطيف الكتلي للكهربائية الشعرية لتوصيف البروتين والايض كورونا المكتسبة من المواد النانوية

Summary

Explore More Videos

PLAYLIST