باستخدام الفئران، يمكن استخدام هذا البروتوكول لإنشاء نموذج جديد للعدوى بفيروس نقص المناعة البشرية النشطة باستخدام فيروس نقص المناعة البشرية الشميري. مع الفئران ، وإنشاء نموذج العدوى EcoHIV لدراسات تعاطي المخدرات والاضطرابات العصبية المعرفية يمكن أن تكون مفيدة لدراسة فيروس نقص المناعة البشرية العصبي وفيروس نقص المناعة البشرية - 1 المرتبطة الاضطرابات العصبية المعرفية. إثبات الإجراء سيكون (هايلونغ لي)، باحث مشارك من مختبري.
لتعبئة الفيروس في 293 T-الخلايا, البذور خمس مرات 10 إلى الخامس 293 تي الخلايا لكل ملليلتر من DMEM تكملها مع 10٪ FBS في كل من اثنين من الجيلاتين المغلفة 75 قوارير سنتيمتر مربع واحتضان الخلايا في 37 درجة مئوية حتى الثقافات تصل إلى 50٪ التقاء. في يوم العدوى ، تمييع 22.5 ميكرولتر من كاشف العدوى في 750 ميكرولتر من المتوسط لكل قارورة في أنبوب ميكروسينتر الطرد 1.5 ملليلتر ودوامة الحل لمدة ثلاث ثوان. تمييع 20 ميكروغرام من الحمض النووي البلازميد EcoHIV الشيمي في 750 ميكرولتر من المتوسط في أنبوب طرد ميكرولتر 1.5 ملليلتر ثاني لكل قارورة مع خلط شامل.
الجمع بين الحمض النووي المخفف مع كاشف العدوى المخفف مع خلط لطيف واحتضان الحل الناتج لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. في نهاية الحضانة، إضافة كل تعليق الفيروس إلى 10 ملليلتر من المتوسط DMEM قبل الحرب وإضافة كل حل الفيروس تكملة إلى قارورة واحدة من 293 تي الخلايا. بعد يومين من ثقافة الخلية، تجمع supernatant من قوارير في أنبوب واحد مخروطي 50 ملليلتر للطرد المركزي ونقل supernatant أوضح إلى أنبوب جديد 50 ملليلتر.
إضافة ثمانية ملليلترات من لينتي X المكثف إلى supernatant أوضح وتخلط مع انعكاس لطيف. بعد احتضان لمدة يومين في أربع درجات مئوية، والطرد المركزي الخليط وإزالة بعناية supernatant، ثم resuspend بلطف بيليه مع 100 ميكرولتر من 100 ملليمولار PBS واستخدام مجموعة P24 ELISA لتأليه تركيز الفيروس. لحقن EcoHIV-EGFP، بعد تأكيد عدم وجود استجابة لرد الفعل دواسة، حلق الشعر من منطقة الدماغ وتعقيم الجلد المكشوف مرتين مع 70٪ الإيثانول وفرك القائم على الكلورهيكسيدين.
تأمين الفئران في موقف عرضة في جهاز ستيريوتاكسيك وجعل شق خمسة إلى ستة سنتيمترات من خلال الجلد على طول خط الوسط فروة الرأس. وضع علامة على موقع حفر واحد في 0.8 ملليمتر الجانبي وواحد 1.2 ملليمتر rostral إلى bregma وحفر ثقب قطره 0.4 ملليمتر في كل موقف الجمجمة. تحميل 1.04 مرات 10 إلى وحدات النقل السادس لكل ملليلتر من محلول EcoHIV Lentivirus المدور في حقنة حقن 10 ميكرولتر وتأمين الحقنة إلى الجهاز الاستريوتاكسيكي.
تحريك الإبرة بالقرب من سطح حفرة حفر واحدة وإدراج الإبرة 2.5 ملليلتر في الحفرة. غرس ميكرولتر واحد من محلول الفيروس بمعدل 0.2 ميكرولتر من الفيروس في الدقيقة الواحدة. عندما يتم حقن كل الفيروس، اترك الإبرة داخل منطقة الحقن لمدة خمس دقائق قبل سحب الإبرة ببطء حتى تخرج من جمجمة الفئران.
أغلق شق الجلد بخيط حرير 4-0 وعقم المحلول بإيثانول 70٪، ثم ضع الجرذ في غرفة الإنعاش مع لوحة تسخين مع المراقبة حتى شغل المنصب. بعد أسبوع إلى ثمانية أسابيع من التسريب الفيروسي ، بعد تأكيد عدم الاستجابة لرد الفعل على دواسة ، قم بإصلاح الجرذ في وضع ية داخل غطاء الدخان واقوس الجلد على طول خط الوسط الصدري. قطع الحجاب الحاجز لفتح تجويف الصدر وإدراج مقياس 20 من قبل 25 ملليمتر إبرة في البطين الأيسر.
افتح الأذين الأيمن على الفور بمقص وثقب 50 ملليلتر من برنامج تلفزيوني مبرد مسبقا 100 ملليمولار بمعدل تدفق خمسة ملليلترات في الدقيقة. عندما تم تسليم كل من برنامج تلفزيوني، perfuse مع 100 ملليلتر من البرد 4٪ paraformaldehyde. عندما يتم تسليم كل من المثبت، وإزالة الدماغ من الجمجمة وإصلاح الأنسجة بين عشية وضحاها في 4٪ paraformaldehyde الطازجة.
في صباح اليوم التالي، ضع العينة في 40 ملليلتر من السكروز 30٪ في 100 ملليمولار PBS في أنبوب 50 ملليلتر لمدة ثلاثة أيام تقريبا حتى يستقر الدماغ إلى أسفل الأنبوب قبل المفاجئة تجميد أنسجة الدماغ في ميثيل بتانول لمدة دقيقتين في ناقص 80 درجة مئوية. بعد التجميد، استخدم شهادة البرد ناقص 20 درجة مئوية وفرشاة طلاء ناعمة للحصول على 50 ميكرون من المقاطع التاجية السميكة. عندما يتم الحصول على جميع المقاطع، قم بتغطية العينات ب 300 ميكرولتر من الوسائط المضادة للتلاشي وتركيبها ب 22 غطاء 50 ملليلتر.
عندما جفت المتوسطة، صورة المقاطع عن طريق المجهر confocal. بعد سبعة أيام من حقن فيروس لينتي، تكشف صور شرائح الدماغ التاجية للفئران عن وجود كبير لإشارات EcoHIV-EGFP في جميع أنحاء أنسجة الدماغ، وخاصة داخل القشرة وجيروس الأسنان الحصين. وضع العلامات المزدوجة مع وIba1 وEcoHIV-EGFP تحقيقات توفر أدلة قوية على أن microglia هي نوع الخلية السائدة التي تؤوي التعبير EcoHIV في الدماغ.
بعد ثمانية أسابيع من العدوى ، تظهر الحيوانات المحقونة EcoHIV عدم حساسية نسبية للتلاعب بفاصل بين فترة التحفيز كما يتضح من وظيفة الفاصل الزمني التملق نسبيا مقارنة بالضوابط المالحة. بالإضافة إلى ذلك ، تعرض الفئران المحقونة EcoHIV تغييرات عميقة في مورفولوجيا العمود الفقري التشجر كما يتضح من زيادة التردد النسبي للعمود الفقري التشجر أقصر مع زيادة أقطار الرأس والرقبة بالنسبة للسيطرة على الحيوانات. تركيز و titrating من حالة المتوسطة قبل الحقن ستيريوتاكسيك أمر بالغ الأهمية لضمان نتائج متسقة ويمكن تكرارها عبر التجارب.
هذا الحقن ستيريوتاكسيك الإقليمية محددة من EcoHIV يوفر عدوى فيروس نقص المناعة البشرية كفاءة داخل الدماغ وتنتج العجز في المعالجة الزمنية في الفئران. ويتيح استخدام حقن فيروس نقص المناعة البشرية المجسمة في الفئران لتوسيع نطاق نموذج العدوى بفيروس نقص المناعة البشرية فرصة رئيسية لمعالجة المسائل الجديدة المتعلقة بفيروس نقص المناعة البشرية العصبية المطروحة.
