هنا نقدم بروتوكولات محسنة لإعداد عينات cryo-EM مع أفلام الدعم باستخدام كتلة تعويم جديدة تسهل التعامل مع مثل هذه الأفلام الحساسة. الميزة الرئيسية لهذه الطريقة هي أن العينة محمية من واجهة مياه الهواء حيث يمكن أن تحدث آثار ضارة مثل التشبع. واحد من البروتوكولات المعروضة هنا يتجنب أي نوع من العلاج مكلفة لجعل الرسم البياني hydrophilic، وبالتالي زيادة إمكانية الوصول إلى المجتمع EM كله.
لا تستخدم أجهزة التعويم الصغيرة على نطاق واسع بعد من قبل المجهر الكهربائي لإعداد جيد. لذلك يمكن أن توفر هذه المظاهرات البصرية معيارا لاستخدامها. للبدء، وغسل شبكات TEM مع الماء المقطر المزدوج وخلات إيثيل تليها تنظيف البلازما.
ثم إضافة 10 إلى 12 ميكرولتر من العينة في تبادل العازلة جيدا، كتلة التعويم و 10 إلى 12 ميكرولتر من محلول خلات المبولة 2٪ في تبادل غير العازلة المجاورة جيدا لتلطيخ السلبية. من الضروري اتخاذ احتياطات السلامة المناسبة عند التعامل مع البقع. قطع بعناية قطعتين صغيرتين من الميكا مع فيلم الكربون predeposited على القمة.
تأكد من أن شظايا الميكا واسعة بما يكفي لتناسب البئر وأطول من طول البئر ، بحيث يمكن للجزأة الجلوس على البئر أثناء تعويم الكربون وهناك مساحة كافية للتعامل مع الجزء بالملاقط. تزج الميكا في البئر مع زاوية تقريبية من 45 درجة حتى الميكا يجلس على منحدر البئر ويلاحظ طبقة الكربون على سطح العينة السائلة. بعد احتضان الكربون مع عينة، سحب ورقة الميكا ببطء شديد لاسترداد فيلم الكربون وتقليل الاحتفاظ بالعينات viscus المتبقية.
لطخة بعناية الميكا عن طريق التنصت على سطح أقل غير الكربون مع ورقة تصفية لإزالة السائل الزائد وتزج جزء الميكا في البئر المعارضة التي تحتوي على 2٪ محلول خلات المبولة لتبادل طبقة الكربون مع وصمة عار سلبية. استعادة طبقة الكربون العائمة مع الكربون المقدسة تغطي الجانب من شبكة EM غسلها والبلازما تنظيفها. ثم اترك الشبكات لتجف حتى يجف التصوير على TEM ، ويفضل أن تغطيها لتجنب التلوث المحمول جوا.
بعد تنظيف شبكات TEM كما هو موضح سابقا، قم بإعداد تعليق أكسيد الجرافين قبل الاستخدام مباشرة ودوامة جيدا. ثم أضف 10 إلى 12 ميكرولتر من تعليق أكسيد الجرافين في آبار التبادل الأربعة غير العازلة. على طول كتلة التعويم.
أضف 10 إلى 12 ميكرولتر من الماء المقطر المزدوج أو المياه النقية للغاية في آبار التبادل العازلة الأربعة المتبقية في الكتلة. إسقاط أربع شبكات بلطف على تعليق أكسيد الجرافين من كل بئر واحتضان لمدة دقيقة واحدة لضمان أن الجانب المغطى بالكربون المقدس على اتصال مع الحل. بعد دقيقة واحدة، واستعادة كل شبكة بعناية عن طريق انزلاق الملاقط في الأخدود ملاقط من كل تبادل غير العازلة جيدا.
دفع بلطف ولفترة وجيزة الجانب النحاس غير الكربون المغطاة من كل شبكة مع الماء المقطر مزدوجة في البئر المجاورة حتى قطرة من الماء مرئيا على الشبكة. ثم عقد بعناية المياه الشبكة إسقاط رأسا على عقب ضد قطعة من ورقة التصفية. تغطية الشبكات وتركها في ملاقط للهواء الجاف.
ضع أربع شبكات غسيل فوق ورقة رسم نحاسي مترسبة على شريحة زجاجية ، وقم بتغطية كل شبكة بقطر من الأيزوبروبانول للسماح بالاتصال الحميم بين الجرافين أحادي الطبقة والشبكة. بعد التبخر الكامل للisopropanol، تعويم ورقة الجرافين النحاس مع الشبكات على محلول كلوريد الحديديك في طبق بيتري الزجاج. ثم قم بتغطية الطبق لتجنب التلوث المحمول جوا واتركه للحفر في درجة حرارة الغرفة بين عشية وضحاها.
استخدام حلقة مع قطر أكبر من حجم الشبكة TEM لصيد الأسماك خارج الشبكات العائمة على طبقة أحادية الجرافين ونقلها بعناية إلى طبق بيتري الزجاج الذي يحتوي على الماء المقطر مزدوجة لغسل. غسل الشبكات مرتين في الماء ونقل الشبكات إلى طبق بيتري تحتوي على عينة عازلة حتى إعداد العينة ويغرق تجميد. أضف 10 إلى 12 ميكرولتر من العينة في بئر من كتلة التعويم.
عندما تكون العينة جاهزة في الكتلة، اختر الشبكة المغلفة بالجرافين من محلول المخزن المؤقت باستخدام زوج من الملاقط النظيفة ووضعها على سطح العينة التي تحتوي على بئر. بعد فترة حضانة مناسبة، التقط الشبكة بزوج من ملاقط التجميد النظيفة وامضي قدما في النشاف والتزجيج. عادة ما يتم تغطية الشبكات الملطخة سلبا المعدة مع كتلة تعويم الدعم بالكربون غير المتبلور عبر سطح الشبكة بأكمله.
في حين يحدث كسر فيلم الكربون في بعض الحالات ، فإن عددا كبيرا من مربعات الشبكة بكر وبالتالي قابلة للتطبيق لأغراض التلطيخ السلبية. وبالمثل ، يتم تحقيق تغطية جيدة للفيلم بشكل روتيني عبر الشبكة بأكملها باستخدام بروتوكول أكسيد الجرافين. يمكن إعداد شبكات أكسيد الجرافين بسرعة من المواد الخام وهي شديدة الحماية للعينة.
الحفاظ على الجرافين الرطب وتطبيق عينة في الموقع قبل التجميد يكفي لتوليد طبقات الجليد مناسبة لالتبريد م. هذا البروتوكول لا يتطلب معدات لجعل هيدروفيلي الجرافين ويوفر ميزة لاستعادة العينة. كتلة دعم التعويم واثنين من منافذ إبرة في موقع كل بئر التي تسمح تمديد العازلة في C2 وهو مفيد جدا للعينات المستمدة من التدرجات الجلسرين.
وقد مكنت كتلة التعويم استكشاف على أساليب تنقية تقارب الشبكة من خلال استخدام تدفق العازلة التي يمكن التحكم فيها من كميات صغيرة، فضلا عن أفلام الدعم وظيفية.
