يمكن لهذا البروتوكول التقاط الحركية في الوقت الحقيقي على مستوى خلية واحدة. يمكننا قياس معلمات الخلايا الفردية استجابة للعدوى بفيروس نقص المناعة البشرية وربط أحداث الإشارات المبكرة بالخطوات المتأخرة لدورة الحياة الفيروسية. هذا هو بديل متكامل قابل للتطوير لأساليب التصوير التقليدية باستخدام منصة جديدة optofluidic لفرز خلية واحدة ، وزراعة ، والتصوير ، وأتمتة البرمجيات.
هذه هي الطريقة الأولى الراسخة لثقافة النانوفلويدية ، عالية الإنتاجية ، الطولية ذات الخلية الواحدة والتصوير. يمكن اعتماد هذه التقنية على نطاق واسع لدراسة الحركية الإشارات الخلوية والتفاعلات الجزيئية الديناميكية في مجموعة متنوعة من حالات المرض. من المهم عرض مرئي لهذه الطريقة لنقل كيفية إعداد التجربة ، وكيف يتم فرز الخلايا بصريا إلى أقلام ، وكيفية إعداد التسريبات من خلال الشريحة.
للبدء، وإعداد محلول تحميل Fluo-4 AM الطازج بإضافة 25 ميكرولتر من مذيب المنظفات المركزة 100X و2.5 ميكرولتر من 1،000X Fluo-4 AM إلى أنبوب 1.5 ملليلتر، ثم دوامة لخلط. ماصة 2.5 ملليلتر من الوسائط الثقافية في حل التحميل وعكس لخلط. أجهزة الطرد المركزي مليوني خلية MT-4 في 500 مرة G لمدة ثلاث دقائق، ثم إزالة وسائل الإعلام وإعادة إنفاق بيليه في اثنين من ملليلتر من محلول التحميل فلوو-4 AM المعدة.
ماصة إعادة تعليق الخلايا في طبق بيتري 35 ملليمتر. تحتضن في 37 درجة مئوية لمدة 15 إلى 30 دقيقة، ثم احتضان لمدة إضافية 15 إلى 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. نقل تعليق الخلية إلى أنبوب الطرد المركزي والطرد المركزي الخلايا في 500 مرة G لمدة ثلاث دقائق، ثم إزالة supernatant.
إعادة تشغيل بيليه الخلية عن طريق الأنابيب في ملليلتر واحد من الثقافة المتوسطة والطرد المركزي في 500 مرة G لمدة ثلاث دقائق لغسل. إعادة إنفاق بيليه الخلية عن طريق الأنابيب في وسط الثقافة بتركيز مليوني خلية لكل ملليلتر لما لا يقل عن 50 ميكرولتر. لإعداد رقاقة مع محلول التبول، مما يسهل خلية penning، تحميل أنابيب الطرد المركزي التي تحتوي على اثنين من ملليلتر من محلول التبول و 50 ملليلتر من الماء deionized على الصك مع رقاقة optofluidic جديدة وتشغيل وظيفة رقاقة الرطب الذي سوف الفيضانات رقاقة مع محلول التبول.
احتضان رقاقة في 50 درجة مئوية وتدفق رقاقة بالماء ثلاث مرات. بمجرد الانتهاء من تدفق المياه ، قم بمسح الشريحة بثلاث دورات من 250 ميكرولتر من وسائل الإعلام الثقافية. تكملة تعليق الخلية من الخطوة السابقة مع واحد لكل 100 أجزاء F127 المنظفات solute قبل التحميل للحد من احتمال الخلايا التمسك قنوات رقاقة.
استخدم إبرة تصدير الأداة لاستيراد خلايا من أنبوب طرد مركزي 1.5 ملليلتر مع عملية التحميل واستيراد صغير الحجم لحجم حزمة خلية ميكرولتر خمسة. خلايا القلم باستخدام تحديد المواقع الأمثل البصريات الإلكترونية أو الجهد OEP من 4.3 فولت وخمسة ميكرومترات في الثانية سرعة القفص باستخدام وظيفة القلم التلقائي، والتي سوف لصناعة السيارات في الكشف عن خلايا واحدة، وتحيط بها مع قفص OEP، ونقلها إلى قلم قريب. إذا ظلت الخلايا ذات الاهتمام تتبع الكتابة التلقائية، فاستخدم الدالة القلم اليدوي لتحديد الخلايا المستهدفة والقلم الوجهة.
بمجرد الانتهاء من الكتابة ، قم بمسح الشريحة بثلاث دورات من 250 ميكرولتر من وسائل الإعلام الثقافية لمسح أي خلايا غير مبندة متبقية من الشريحة. بعد تأليف الخلايا، والحصول على صور الفلورسنت من الخلايا في FITC، تكساس الأحمر وقنوات DAPI لقياس خط الأساس فلوو-4، mCherry، وoutofluorescence. غرس فيروس نقص المناعة البشرية-1 في رقاقة في تركيز 13 نانوغرام من فيروس نقص المناعة البشرية-1 NLCI لكل مليوني خلية عن طريق أنبوب ببطء تعليق في رقاقة من خلال إبرة التصدير.
مباشرة بعد إضافة فيروس نقص المناعة البشرية-1، والحصول على صور مرارا وتكرارا في قنوات FITC وDAPI على مدى دورة زمنية لمدة 10 دقائق. الحصول على الصور في قنوات تكساس الأحمر وDAPI في واحد واثنين وثلاثة وأربعة أيام بعد العدوى. وقد استخدمت هذه المنهجية لتحديد الخلايا المصابة وغير المصابة بفيروس نقص المناعة البشرية وتتجمع فيها عن طريق قياس mCherry.
تم تجميع الخلايا التي لديها تغيير في إشارة mCherry أكبر أو أقل من 40،000 متوسط كثافة الفلورسنت في ارتفاع mCherry أو انخفاض عدد السكان mCherry على التوالي. تم تحليل هذه المجموعات حركية تدفق الكالسيوم عن طريق قياس الكالسيوم داخل الخلايا باستخدام فلو-4 فلوريسينس مرارا وتكرارا على مدى دورة زمنية مدتها تسع دقائق، مما يدل على تدفق الكالسيوم في وقت مبكر في الخلايا المصابة بفيروس نقص المناعة البشرية. ولوحظ وجود ارتباط إيجابي كبير بين تدفق الكالسيوم وفلوريسانس mCherry.
أثناء محاولة هذا الإجراء، من المهم أن نتذكر أن تبدأ مع الخلايا ضمن نطاق النمو الأسي لإنتاج الفيروسات والعدوى على حد سواء لأن الخلايا المتضخمة سيؤدي إلى انخفاض كبير في إشارة من هذا المقايسة. يمكن أن يكون العمل مع فيروس نقص المناعة البشرية-1 خطرا. لذلك ، ينبغي دائما أن تؤخذ ممارسات BSL-2 كما هو مبين في معيار مسببات الأمراض المنقولة بالدم OSHA أثناء إجراء هذا الإجراء.
هذه التقنية مثيرة لأنها ستسمح لنا بدراسة التغيرات الظاهرية أحادية الخلية أو النسخ في ظل ظروف خاضعة للرقابة. وهذا له إمكانات واسعة لربط تأثير المحفزات على المسارات الجزيئية في العديد من أنواع الخلايا.
