بالنظر إلى أن الخلايا العصبية المستقبلة للألم تفرز العديد من الببتيدات العصبية وأن الخلية القاتلة الطبيعية عبرت عن مستقبل هذه الببتيد العصبي ، فقد قررنا ابتكار طريقة زراعة مشتركة لدراسة التفاعل بين الخلية القاتلة الطبيعية والخلايا العصبية المستقبلة للألم. يمكن أن تكون هذه الطريقة الاختزالية مفيدة لدراسة كيفية تحكم الخلايا العصبية المستقبلة للألم في الوظيفة المضادة للورم في الخلية القاتلة الطبيعية ، وقد يكون من المثير للاهتمام أيضا دراسة كيفية تحكم الخلايا القاتلة الطبيعية في القضاء على الخلايا العصبية المصابة. سيوضح الإجراء علي أحمدي ، طالب ماجستير سابق من مختبري.
لبدء عزل وثقافة الخلايا القاتلة الطبيعية أو الخلايا القاتلة الطبيعية ، اجمع طحال الفأر في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 ملليلتر يحتوي على 500 ميكرولتر من PBS المعقم ، ثم قم بتجانس الطحال باستخدام مدقة. بعد ذلك ، قم بتخفيف الخلايا بملليلتر واحد من PBS المعقم وقم بتصفية الخليط من خلال مصفاة خلية 50 ميكرون في أنبوب مخروطي سعة 50 ملليلتر. قم بتعبئة حجم التجانس المصفى إلى 10 ملليلتر باستخدام PBS معقم.
عد الخلايا في 10 ميكرولتر من التجانس المخفف باستخدام مقياس الدم. الطرد المركزي الخلايا المتبقية لمدة خمس دقائق في 500 غرام وإزالة طاف. ثم أعد تعليق الخلايا من 10 إلى الخلايا الثامنة لكل ملليلتر في وسط RPMI 1640 المكمل.
تنقية الخلايا القاتلة الطبيعية للطحال مغناطيسيا باستخدام مجموعة عزل الخلايا القاتلة الطبيعية للفأر وتأكيد نقاء الخلايا القاتلة الطبيعية باستخدام قياس التدفق الخلوي. عد الخلايا باستخدام مقياس الدم ، متبوعا بالطرد المركزي لمدة خمس دقائق عند 500 G ، ثم قم بإزالة المادة الطافية. لتحفيز الخلايا القاتلة الطبيعية المحببة ، أعد تعليق هذه الخلايا في وسط ثقافة IL-2 و IL-15 RPMI 1640 المكمل.
استزرع مرتين في 10 إلى سادس خلايا NK لكل مليلتر في صفيحة قاع U ذات 96 بئرا لمدة 48 ساعة. قبل 24 ساعة من تحفيز الخلايا القاتلة الطبيعية ، قم بتغطية الصفيحة المكونة من 96 بئرا ب 100 ميكرولتر لكل بئر من الصفيحة واحتضانها لمدة 45 دقيقة عند 37 درجة مئوية. بعد الحضانة ، قم بإزالة المحلول واترك الآبار تجف في الهواء في خزانة السلامة الحيوية.
بعد ذلك ، قم بتأمين الماوس الرحيم على السبورة في وضع الانبطاح. ارفع الجلد وشق الجلد على طول العمود الظهري. قطع المفصل القطني العجزي وفصل العجز عن العمود الفقري القطني بالمقص.
ثم افصل العمود الفقري عن طريق قطع العضلات والأضلاع على كلا الجانبين في اتجاه الجمجمة حتى يتم الوصول إلى قاعدة الجمجمة. استخدم المقص لقطع العمود الفقري عند المفصل الأطلسي القذالي. بعد ذلك ، قم بإزالة العضلات والأنسجة الدهنية من العمود الفقري.
قم بتثبيت العمود الفقري وفتحه لإزالة الحبل الشوكي قبل الوصول إلى العقدة الجذرية الظهرية أو DRG في الثقبة الفقرية المتصلة بالحبل الشوكي من خلال الجذر الظهري. بعد ذلك ، قم بحصاد DRGs في أنبوب مخروطي سعة 15 ملليلتر مملوء ب 10 ملليلتر من الثلج البارد المكمل DMEM. ثم الطرد المركزي التحضير لمدة خمس دقائق في 200 غرام في درجة حرارة الغرفة وإزالة طاف.
أضف 250 ميكرولتر من PBS تحتوي على ملليغرام واحد لكل ملليلتر كولاجيناز IV و 2.4 وحدة لكل ملليلتر ديسباز II.احتضان هذا DRG بمحلول كولاجيناز-ديسباز لمدة 80 دقيقة مع تحريض خفيف. لتعطيل الإنزيمات ، أضف خمسة ملليلتر من وسط DMEM المكمل وطرد مركزي المحلول عند 200 G.بعد خمس دقائق ، قم بإزالة المادة الطافية برفق باستخدام ماصة واترك حوالي 100 ميكرولتر من المادة الطافية لتجنب فقدان الخلايا غير المرغوب فيه. بعد ذلك ، أضف ملليلتر واحد من وسط DMEM المكمل إلى الخلايا واستخدم مسدس ماصة وثلاث ماصات باستور زجاجية ذات أحجام متناقصة لسحن DRG برفق في إعداد خلية واحدة.
أثناء العمل في خزانة السلامة الحيوية ، قم بتخفيف ألبومين مصل الأبقار أو BSA في PBS معقم إلى تركيز نهائي بنسبة 15٪ وقم بتخزين حصة ملليلتر واحدة عند 20 درجة مئوية تحت الصفر. لإنشاء تدرج BSA في أنبوب مخروطي سعة 15 ملليلتر ، أضف ملليلتر من PBS المعقم ثم قم بتوزيع ملليلتر واحد من محلول BSA بنسبة 15٪ ببطء في الجزء السفلي من الأنبوب. تجنب تعطيل التدرج عن طريق إزالة الماصة برفق.
باستخدام ماصة P200 ، أضف تعليق العقد الذي يحتوي على الخلايا العصبية على جانب الأنبوب إلى التدرج. ثم اضبط التسارع والتباطؤ عند الحد الأدنى للطرد المركزي للخلية العصبية التي تحتوي على تدرج BSA لمدة 12 دقيقة عند 200 G.بعد الطرد المركزي ، قم بإزالة كل المادة الطافية باستخدام ماصة وأعد تعليق الخلايا في 500 ميكرولتر من Neurobasal. لوحة 10،000 خلية عصبية لكل بئر في لوحة مسطحة القاع 96 بئر مطلية بالصفيحة.
للسماح بربط الخلايا العصبية ، احتضان لوحة 96 بئر بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية. لبدء الزراعة المشتركة ، قم بإزالة Neurobasal ببطء من ثقافة الخلايا العصبية. بعد 48 ساعة من التحفيز باستخدام IL-2 و IL-15 ، أعد تعليق الخلايا القاتلة الطبيعية وأضف 10 إلى الخلايا القاتلة الطبيعية الخامسة لكل بئر إلى مزرعة الخلايا العصبية.
شارك في زراعة الخلايا في Neurobasal MX المكمل عند 37 درجة مئوية. بعد 48 ساعة ، قم بجمع الخلايا وغسلها ثلاث مرات باستخدام PBS وطردها بالطرد المركزي لمدة خمس دقائق عند 500 جم عند أربع درجات مئوية. تخلص من المادة الطافية قبل تلطيخ الخلايا بصبغة eFluor 780 مخففة من واحد إلى 1،000 لمدة 15 دقيقة عند أربع درجات مئوية.
اغسل الخلايا وطردها بالطرد المركزي كما هو موضح ، متبوعا بالعلاج بالقرص المضغوط 1632 لمدة 15 دقيقة عند أربع درجات مئوية لحظر المواقع غير المحددة على الخلايا ، يليها جمع الخلايا وغسلها باستخدام PBS ثلاث مرات. بعد الدورة التالية من الغسيل والطرد المركزي ، قم بتلطيخ الخلايا باستخدام BV421 ، ومضاد NK-1.1 ، وفلوريسئين إيزوثيوسيانات مضاد NKp46 ، ومضاد phycoerythrin anti-GM-CSF لمدة 15 دقيقة. مرة أخرى ، قم بجمع الخلايا وغسلها ثلاث مرات باستخدام PBS ، وقم بالطرد المركزي وتخلص من المادة الطافية ، ثم أعد تعليق الخلايا في 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت FACS والنمط المناعي للخلايا القاتلة الطبيعية باستخدام قياس التدفق الخلوي.
عند الاستزراع بمفردها ، عبرت الخلايا القاتلة الطبيعية عن المستويات القاعدية لعامل تحفيز مستعمرة البلاعم المحببة أو GM-CSF و NKp46. عند الاستزراع المشترك مع الخلايا العصبية DRG التي تم حصادها من الفئران السليمة مستقبلات الألم ، قلل تحفيز الكابسيسين من تعبير الخلايا القاتلة الطبيعية عن GM-CSF. لم يكن للكبخاخات أي تأثير على تنشيط الخلايا القاتلة الطبيعية عند زراعتها مع الخلايا العصبية DRG التي تم حصادها من الفئران المستأصلة بمستقبلات الألم.
لم يتأثر مستوى NKp46. الخطوات الرئيسية في هذا البروتوكول هي تفكك DRG والعزل. الفكرة هي الحفاظ على أقصى قدر من الجدوى العصبية عن طريق تجنب صنع الفقاعة واستخدام ماصة الحجم المناسب.
بعد البروتوكول ، يمكن للباحث استخدام تسلسل الحمض النووي الريبي أو qPCR لقياس تغير النص في الخلايا المنقاة FACS ، أو يمكنهم استخدام ELISA لقياس إفراز السيتوكين أو الببتيدات العصبية. يكشف هذا التفاعل أن وظيفة الخلية القاتلة الطبيعية من المحتمل أن يتم ضبطها بواسطة الخلايا العصبية المستقبلة للألم. وقد يكون هذا الحديث المتبادل مهما في العمليات البيولوجية التي تمتد من إصابة الأعصاب والعدوى البكتيرية والفيروسية ، وصولا إلى الأورام الخبيثة.
