الهدف من هذه الطريقة هو تحديد الطفرات في المسار التنفسي الضوئي باستخدام فحص CO2 منخفض. نقدم طريقة لتحديد الطفرات التي تعطل التنفس الضوئي بعد التعرض لانخفاض CO2. ميزة هذه الطريقة هي أنها غربلة عالية الإنتاجية للشتلات يمكن إجراؤها في فترة زمنية قصيرة نسبيا.
ستوفر الأقسام التالية تفاصيل حول تحضير البذور وتعقيمها ، ونمو النبات ومعالجة CO2 المنخفضة ، وتكوين نظام التصوير الفلوري ، وقياس العائد الكمي للعينات المعالجة ، والنتائج والاستنتاجات التمثيلية. إعداد البذور وتعقيمها. يتكون تحضير البذور من تشرب البذور وتعقيم البذور.
من المهم ملاحظة أن كل هذه الخطوات تتم في غطاء تدفق رقائقي للحفاظ على ظروف معقمة. يتم تعقيم جميع المواد اللازمة والكواشف ووسط النمو. خطوط البذور المستخدمة هي plgg1-1 و abcb26 و WT أو النوع البري.
اشرب البذور في ماء معقم في غطاء تدفق رقائقي ، ثم طبقي عند أربع درجات مئوية في الظلام لمدة يومين. في ظل ظروف معقمة ، قم بإعداد 10 ملليلتر من حجم 50٪ إلى محلول تبييض الحجم وأضف حوالي 20 ميكرولتر من توين 20. قم بإزالة الماء من البذور المشبعة ، ثم أضف ملليلتر واحد من محلول التبييض في أنبوب الطرد المركزي الدقيق واحتضانه في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق.
قم بإزالة محلول التبييض باستخدام ماصة. شطف البذور في ملليلتر واحد من الماء المعقم لإنعاش. قم بإزالة الماء بمجرد أن تستقر البذور في القاع.
أعد تعليق البذور في محلول معقم 0.1٪ أغاراروز. لطلاء البذور ، لوحات متوسطة القاعدية مع 1 ٪ MS المتوسطة مع الفيتامينات و 1 ٪ أجار لزراعة طفرات الاختبار. قطع 200 ميكرولتر ماصة بشفرة حلاقة.
باستخدام ماصة ، ضع بذرة واحدة في وسط الشبكة المربعة المخصصة لكل طافرة اختبار أو نمط وراثي. هنا ، يتم استخدام لوحة مربعة مع شبكة واحدة تلو الأخرى. يساعد ذلك في الحفاظ على مسافة موحدة بين كل شتلة وتجنب التداخل ، والذي سيكون مهما لاحقا في التصوير والتحليل الفلوري.
بمجرد طلاء البذور ، لف الشريط الجراحي حول الغطاء لإغلاقه ، ثم ضعه في حجرة النمو. نمو النبات وانخفاض CO2 العلاج. قم بزراعة النباتات لمدة سبعة إلى تسعة أيام عند 20 درجة مئوية في إطار دورة ضوئية مدتها ثماني ساعات تبلغ 120 ميكرومول لكل متر مربع في الثانية و 16 ساعة من الظلام عند 18 درجة مئوية.
تحقق من النباتات في اليوم السادس لتحديد ما إذا كانت كبيرة بما يكفي للتصوير. في اليوم الثامن بعد الطلاء ، تعرض النباتات لانخفاض CO2. ضع محطات المعالجة في صندوق مغلق داخل غرفة النمو بكثافة ضوء تبلغ 200 ميكرومول لكل متر مربع في الثانية لمدة 12 ساعة.
تم إنشاء حالة CO2 المنخفضة باستخدام حاوية شفافة محكمة الإغلاق مع 100 جرام من جير الصودا الموضوعة في قاع الحاوية. تم وضع الحاوية داخل نفس غرفة النمو مثل التحكم. ستبقى محطات التحكم أقل من 120 ميكرومول لكل متر مربع في الثانية في CO2 المحيط لمدة 12 ساعة.
تكوين نظام التصوير الفلوري. ضع لوحة اختبار في منتصف الكاميرا على مسافة ثابتة في نظام التصوير الفلوري. داخل برنامج الجهاز ، انتقل إلى النافذة المباشرة وحدد المربع ومضات لتشغيل ومضات القياس غير النشطة.
انقر فوق أدوات التكبير والتركيز حتى ترى صورة كاملة وحادة. اضبط قيمة EL shutter على الصفر واضبط الحساسية للحصول على إشارة فلورسنت في نطاق 200 إلى 500 وحدة رقمية. ضع مقياس الضوء في نفس الموضع المستخدم لضبط إعدادات الكاميرا.
في النافذة المباشرة ، حدد المربع Super لبدء نبضة مشبعة تدوم لمدة 800 مللي ثانية. استخدم شريط التمرير لضبط النسبة المئوية للطاقة النسبية للنبضة الفائقة حتى يقرأ مقياس الضوء 6،000 إلى 8،000 ميكرومول لكل متر مربع في الثانية. قياس العائد الكمي للعينات المعالجة.
بعد العلاج مباشرة ، قم بتغطية الألواح بورق الألمنيوم لمدة 15 دقيقة للتكيف الداكن. قم بإزالة الرقاقة لقياس العائد الكمي للنظام الضوئي الثاني باستخدام مقياس الفلورومتر المعدل بسعة النبضة. ثم ضع لوحة الشتلات مباشرة تحت الكاميرا وقم بتشغيل بروتوكول العائد الكمي الموجود في مستودع GitHub الخاص بنا.
قم بتنزيل بروتوكول العائد الكمي من GitHub. استخدم برنامج مقياس الفلور لفتح ملف البرنامج بالنقر فوق رمز المجلد والانتقال إلى موقع الملف. قم بتشغيل بروتوكول العائد الكمي بالنقر فوق رمز البرق الأحمر.
بعد اكتمال البروتوكول ، انتقل إلى نافذة التحليل المسبق. قسم اللوحة إلى شتلات فردية من خلال تسليط الضوء على جميع وحدات البكسل لكل شتلة على صورة اللوحة. انقر فوق استثناء الخلفية لإزالة أي وحدات بكسل خلفية مميزة ، مع ترك منطقة الشتلات فقط.
انقر فوق تحليل لإنشاء بيانات مضان لكل شتلة على صورة اللوحة. اضبط نطاق قيمة التألق يدويا لعرض قيم دنيا وقصوى متسقة بين جميع اللوحات. في علامة التبويب تجربة، انقر على تصدير، ثم على رقمي.
انقر فوق المتوسط العددي لإنشاء ملف نصي يحتوي على العائد الكمي لكل شتلة. افتح الملف النصي وجدول البيانات للتحليل. يحتوي جدول البيانات على رقم المنطقة وحجم وحدات البكسل و Fm و Ft و Fq و QY. أولا ، نحتاج إلى تحديد رقم المنطقة للنمط الجيني المقابل له ، سواء كان نوعا بريا أو متحولا اختباريا ، النتائج.
فيما يلي صور لوحة الصور الخام والفلورية من فحص CO2 المحيط والمنخفض للأنواع البرية واختبار الطفرات. يتم تمييز كل لوحة برقم المنطقة مع قراءات التألق المقابلة على أنها عائد كمي أو QY. يتم تصدير البيانات كملف نصي ويمكن فتحها في جدول بيانات لتحليلها. يتم تصور كفاءات العائد الكمي Fv / Fm المتكيفة المظلمة للأنواع البرية والطفرات من خلال مخططات الصندوق والشعير.
لاختبار الفرق الإحصائي للأنواع البرية واختبار الطفرات ، تم استخدام اختبار T الزوجي بقيمة P أقل من 0.05. هنا ، نستخدم خط الطفرة التنفسية الضوئية مع انخفاض العائد الكمي Fv / Fm كمتحولة اختبار للتحقق من كفاءة طريقة الفحص لدينا. تظهر نتائجنا أن طفرات الاختبار لها كفاءة إنتاجية كمية أقل بكثير مقارنة بالأنواع البرية.
يشير هذا إلى أن طريقة الفحص لدينا قادرة على تحديد طفرات الجهاز التنفسي الضوئي باستخدام فحص CO2 المنخفض. الاستنتاجات. من الأشياء المهمة التي يجب تذكرها أثناء استخدام هذا البروتوكول التأكد من أن شتلات Arabidopsis كبيرة بما يكفي لقياس التألق ، ولكنها ليست كبيرة جدا بحيث تتداخل النباتات أثناء التصوير. يفضل تصوير الشتلات على أنها الأوراق الحقيقية الأولى لمحاولة الحفاظ على حجم الورقة وزوايا الأوراق موحدة.
يمكن استخدام هذا البروتوكول كفحص عالي الإنتاجية للشتلات. تصوير كل لوحة سريع نسبيا ولديه القدرة على فحص أكثر من 1،000 شتلة في اليوم. سمح لنا تحليل مضان الكلوروفيل بتحديد طفرات الجهاز التنفسي الضوئي باستخدام فحص CO2 منخفض ، وهو أمر مهم للحفاظ على كفاءة التنفس الضوئي.
لا يقتصر هذا البروتوكول على أرابيدوبسيس وله إمكانية استخدامه في تجارب الاستجابة للإجهاد اللاأحيائي.
