تكمن أهمية هذا البروتوكول في اختبار الاحتمال الإجمالي للأمعاء، على النموذج المختبري للظهارة المبكرة. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي قياس النفاذية من تجويف مغلق يحاكي البيئة المضيئة للأمعاء. يمكن استخدام هذا البروتوكول لدراسة العوامل التي تحفز أو تخفف من مرض الأمعاء المتسرب.
ويمكن أيضا تطبيقه على الأنظمة البطانية أو الوعائية لدراسة الظروف التي يمكن أن تحفز تسرب الأوعية الدموية. يتطلب هذا البروتوكول بعض الممارسة. نوصي بممارسة كل قسم على حدة قبل وضع الإجراء بأكمله معا.
للبدء ، انقل شرائح الأمعاء إلى طبق بتري بمساحة 60 × 15 ملليمتر مربع مع PBS من Dulbecco البارد مع الأمفوتيراسين وانقع لمدة 20 دقيقة على الجليد. باستخدام مشرط مع زوج من المقص ، قم بقطع شرائح الأمعاء إلى ثلاث إلى خمس قطع ملليمتر ووضع قطعة إلى قطعتين في طبق بتري 35 × 15 ملم مربع يحتوي على 0.5 إلى ملليلتر واحد من وسط النمو العضوي على الجليد. قطع الأنبوب المعوي طوليا باستخدام تشريح المقص الدقيق والملقط.
ثم استخدم الملقط لكشط الخلايا الظهارية من اللفافة. قم بإزالة اللفافة وقم بتدوير الطبق لكسر كتل الخلايا. ثم ، باستخدام طرف قطع ماصة سعة 20 ميكرولتر ، انقل الخلايا والوسائط بزيادة تتراوح من خمسة إلى 10 ميكرولترات إلى مزيج مصفوفة غشاء سفلي لصنع محلول 285 ميكرولتر.
امزج الخلايا عن طريق السحب في مصفوفة غشاء سفلي على الجليد باستخدام طرف مقطوع سعة 200 ميكرولتر. بعد الخلط ، ضع خمسة شرائط سعة 50 ميكرولتر من مزيج مصفوفة الغشاء السفلي للخلية في بئر واحد من صفيحة من ستة آبار تم تسخينها مسبقا محفوظة على لبنة رغوية دافئة. احتضن الصفيحة عند 37 درجة مئوية و 5٪ من ثاني أكسيد الكربون لمدة 10 دقائق للسماح بالبلمرة وتصلب مصفوفة الغشاء السفلي.
بمجرد تصلب شرائط المصفوفة ، أضف ملليلترين من وسائط النمو المعوية في البئر قبل وضع اللوحة مرة أخرى في الحاضنة. بعد نقل الأمعاء إلى بئر من لوحة من ستة آبار أو 12 بئرا ، كل يوم بديل ، استبدل الوسائط القديمة بوسائط جديدة. وعندما بدأت الأمعاء في الازدهار ، تمر الخلايا كل خمسة إلى سبعة أيام.
لتلطيخ التألق المناعي ، أضف 500 ميكرولتر من الجسم المضاد الأساسي في المخزن المؤقت المانع لكل بئر من الأمعاء واحتضنها بين عشية وضحاها عند أربع درجات مئوية. في اليوم التالي ، قم بإزالة محلول الأجسام المضادة وغسل الأمعاء ثلاث مرات باستخدام PBS. بعد الحضانة في واحد إلى 400 محلول الأجسام المضادة الثانوية المخففة ، تليها الحضانة في DAPI ، اغسل الأمعاء ثلاث مرات باستخدام PBS.
للحفاظ على الهياكل ثلاثية الأبعاد للأمعاء ، استخدم قواطع من صفائح مطاط السيليكون الرقيقة أو زلات الغطاء الزجاجي لإنشاء مساحة 0.5 إلى ملليمتر واحد بين الشريحة الزجاجية السفلية وانزلاق الغطاء. للتركيب ، اغسل الأمعاء الملطخة بنسبة 70٪ من الجلسرين. ثم ، باستخدام حلقة تلقيح ميكرولتر واحدة ، أو طرف مقطوع 200 ميكرولتر ، ارفع الأمعاء خارج اللوحة وقم بتركيبها مع الجلسرين على شريحة مجهر زجاجية.
قم بإعداد طبق بتري مغطى بغطاء فيلم شفاف وأضف قطرتين إلى أربع قطرات ميكرولتر واحد من Dextran-FITC على الفيلم. باستخدام المتلاعب الدقيق، قم بقيادة طرف الماصة الدقيقة داخل السائل وفوق الفيلم تحت مجهر ستيريو، ثم اسحب المحقنة برفق لسحب Dextran-FITC إلى الماصة الدقيقة. بعد ملء الماصة الصغيرة بميكرولترين إلى أربعة ميكرولترات من Dextran-FITC ، ادفع المحقنة لإزالة أي هواء من طرف الماصة.
أيضا ، افحص عمود المواد المحقونة في الماصة الدقيقة لضمان عدم وجود جيب هوائي وتسجيل حجم Dextran-FITC داخل الماصة الصغيرة. بعد ذلك ، قم بتشغيل مصدر الهواء المتصل بالمضخة الهوائية قبل تشغيل المضخة وضبط مدة المضخة على 10 إلى 15 مللي ثانية. ثم أدر السدادة على المحقنة لفتح الخط من المضخة إلى الماصة الصغيرة.
قم بإزالة المعوية من الحاضنة ووضع الطبق على لبنة رغوية دافئة في حاوية مغطاة لتقليل التعرض للضوء بعد الحقن المجهري. ضع طبق بتري مع المعوية تحت المجهر الاستريو وحرك مقابض المتلاعب الدقيقة لوضع طرف الماصة الدقيقة بزاوية 35 إلى 45 درجة على السطح الأفقي. تصور وتحديد الأمعاء الكروية بهدف حقن ثلاثة إلى خمسة أمعاء لكل طبق.
بعد ذلك ، تقدم الطرف إلى المعوية المستهدفة من خلال النظر من خلال قطع العين المجهرية. ثم ، تقدم مقبض المحور Z بحركة بطيئة دقيقة ، قم بثقب الأمعاء بطرف الماصة الدقيقة. يجب أن يتوقف التقدم بمجرد أن يمر الطرف عبر السطح المعوي ، الذي يثبط وينبثق مرة أخرى.
اضغط على دواسة المضخة بقدم واحدة واملأ الأمعاء بمحلول Dextran-FITC الأخضر حتى يتم توسيعه. سجل عدد المضخات لحساب حجم الضخ وتركيز ديكستران. أظهر هذا البروتوكول توصيف الأمعاء المشتقة من أنسجة الجنين عن طريق تلطيخ مختلف المؤشرات الحيوية الخاصة بالظهارة المعوية بالأجسام المضادة المناعية الفلورية ، مما يؤكد أصلها الظهاري للأمعاء الدقيقة.
تظهر المعوية في مراحل مختلفة هنا. المعوية التي يتراوح عمرها بين سبعة و 10 أيام صغيرة وسميكة. في حين أن المعوية الجاهزة للحقن المجهري كانت كبيرة مع تجويف وجدار رقيق.
لا يزال المعوي بعد يومين من الحقن المجهري يحتوي على كميات كبيرة من Dextran-FITC. تم تقييم نفاذية الأمعاء بعد الحقن المجهري عن طريق قياس تركيز ديكستران في الوسائط. تم استخدام EGTA ، المعروف بزيادة نفاذية الغشاء عند التقاطعات الضيقة ، كعنصر تحكم إيجابي.
يظهر اختبار قياس Dextran أيضا أن LPS أدى إلى زيادة النفاذية وارتفاع تركيز LPS أدى إلى نفاذية أعلى. أهم شيء في التثبيت والتلطيخ هو عدم تعطيل شكل الأمعاء أو فقدانها أثناء العملية. بعد الحقن المجهري ، يمكن جمع الوسائط لفحص السيتوكين ويمكن حصاد الأمعاء لتسلسل الحمض النووي الريبي.
