وصفنا التقنية المثلى للحقن داخل الجمجمة لخلايا الورم الأرومي الدبقي المشتقة من GEM في دماغ فأر مناعي مما يؤدي إلى أورام تلخص السمات الرئيسية للورم الأرومي الدبقي البشري. هذه التقنية للحقن التقويمي لخلايا TRP المشتقة من GEM تعطي نتائج قابلة للتكرار بدرجة كبيرة وقابلة للتطوير ومتسقة للأورام التي تنشأ في القشرة ، مع الحفاظ على غزو أورام GEM. تظهر أورام الدماغ الورم الأرومي الدبقي للفأر نموا عدوانيا وتغزو حمة الدماغ المحيطة.
لذلك ، يمكن استخدامه لتقييم العلاجات التي قد تمنع تسلل الورم والهجرة لدى المرضى. يمكن تخصيص هذا البروتوكول لنماذج أورام المخ الأخرى أو الفيروسات أو العلاجات أو تكييفها للحقن في مناطق مختلفة من الدماغ مع تعديلات الإحداثيات المجسمة. سيوضح الإجراء ديفون أتكينسون ، وهو باحث مشارك من مختبري.
للبدء ، ضع واقيات السطح تحت الجهاز التجسيمي وعلى سطح العمل. قم بتوصيل أنبوب الفينيل من آلة التخدير بمنفذ منصة التخدير الغازي لجهاز التجسيم ، وأنبوب آخر بمنفذه الخارجي. قم بتوصيل الشاشة الرقمية بمصدر طاقة والجهاز.
بعد ذلك ، قم بتوصيل المضخة الصغيرة بذراع المعالج للجهاز بعد توصيل وحدة تحكم المضخة الصغيرة بمصدر الطاقة. اضبط المضخة الصغيرة على 5.6 نانولتر في الثانية. قم بتوصيل وسادة تسخين الماوس بجهاز التحكم في درجة الحرارة ومصدر الطاقة.
قم بتحميل حقنة دقيقة قياس 30 مع خليط خلية ميثيل ميثيل سلولوز عن طريق تجنب الفقاعات. بعد إدخال المكبس ، قم بتوصيل الإبرة ، واضغط على المكبس حتى يسقط خليط الخلية المحمل عبر الإبرة. نظف الإبرة باستخدام ضمادة تحضير كحول بنسبة 70٪.
بمجرد توصيل المحقنة الدقيقة بالمضخة الدقيقة ، قم بتدوير ذراع المناور بعيدا عن المسرح قبل وضع الماوس لمنع إزاحة إبرة المحقنة. انقل الماوس المخدر إلى أداة التجسيم وقم بتثبيته في مخروط الأنف عن طريق وضع الأسنان العلوية على دعامة مخروط الأنف. بعد شد مخروط الأنف بمقبض ، اضغط على إصبع القدم للتحقق من ردود الفعل لضمان التخدير المناسب.
ثم أدخل قضبان الأذن وشد المقبض لتأمين الرأس. ضع مرهم العين لتليين العينين تحت ظروف التخدير. حقن مسكن البوبرينورفين SR تحت الجلد ، ووضع مسبار الماوس المستقيم لمراقبة درجة الحرارة الداخلية.
تعقيم المجال الجراحي باستخدام الدوائر الخارجية ، بالتناوب بين فرك الجراحية والإيثانول ثلاث مرات. اسحب الجلد المشدود بالملقط واستخدم شفرة مشرط لعمل شق بطول 1 سم تقريبا بين العينين. لحقن الخلايا ، أعد ذراع المناور مع المحقنة المتصلة بالماوس.
بعد شد المقابض ، حرك المحقنة باستخدام مقابض X و Y في المستوى الأفقي وقم بتثبيتها فوق bregma. اخفض الإبرة ، باستخدام مقبض Z ، لتأكيد موضع bregma ، واضبط وحدة التحكم في القراءة الرقمية على الصفر. ثم حرك الإبرة إلى الموضع المطلوب ، كما هو موضح في المخطوطة ، باستخدام مقابض X و Y والقراءات الرقمية المقابلة ، واستخدم مقبض Z لتحريك الإبرة إلى سطح الجمجمة.
ثقب ثقب في الجمجمة باستخدام حقنة 1 ملليلتر مع إبرة قياس 25 المرفقة. قم بتدوير ذراع المناور بعناية إلى الجانب ، مع وضع شطبة الإبرة باتجاه المحقنة الدقيقة ذات المقياس 30. بمجرد وضع ذراع المناور بإبرة المحقنة الدقيقة المحملة فوق الفتحة ، قم بمحاذاة طرف الإبرة مع الفتحة ، واستخدم مقبض Z لخفض الإبرة في الجافية في الدماغ.
بعد ضبط وحدة التحكم في القراءة الرقمية على الصفر ، اخفض الإبرة 1 ملم باستخدام مقبض Z ، وانتظر لمدة دقيقة واحدة. بمجرد الوصول إلى عمق 2 ملم ، أوقف المضخة الصغيرة ، وتأكد من توقف المضخة عند حقن 2 ميكرولتر من تعليق الخلية. لإزالة الإبرة من الجمجمة ، ارفعها ملليمترا واحدا ، وانتظر دقيقة واحدة.
لإغلاق الجرح ، باستخدام الطرف الخشبي لقضيب ذو رأس قطني ، خذ قطعة من شمع العظام وشكلها على شكل مخروط. بعد وضع الشمع في الفتحة في الجمجمة ، ادفعه إلى الحفرة. استخدم ملقط الخرزة المعقم لإذابة الشمع المتبقي على الجمجمة.
بمجرد أن يصبح ناعما ، أضف قطرتين من محلول بوبيفاكايين المخدر في الشق ، واسحب حواف الجلد معا باستخدام ملقط. بعد سحب الجلد مشدودا ، باستخدام مقطع أو مقطعين للجرح ، أغلق الجلد ، ضع الماوس في قفص استرداد نظيف على وسادة تدفئة في منطقة خالية من السحب ، وراقب الماوس عن كثب. أظهرت فحوصات التصوير بالرنين المغناطيسي الأسبوعية زيادة عبء الورم داخل الدماغ ، وقياسات حجم الورم.
كشف قياس حجم الورم بالرنين المغناطيسي عن نقص في قمع نمو الورم حتى بعد العلاج الإشعاعي ، ولم يتم زيادة بقاء الفئران المعالجة. يبدو أن أورام GBM في النماذج التخليقية نمت بقوة واخترقت الجمجمة من نقطة النهاية الطرفية. إذا لوحظ نمو خارج الجمجمة على التصوير بعد زرع الخلية ، فهذا يشير إلى تسرب الخلايا أثناء عملية الحقن ، ويجب توخي المزيد من الحذر أثناء سحب إبرة الحقن.
أكد علم أمراض الأنسجة لأورام TRP GBM التقويمية وجود ورم نجمي من الدرجة 4 ، بما في ذلك تلخيص السمات المميزة في الأورام مثل الشلل الكاذب والنخر. كن دقيقا عند ضبط نقطة الصفر في bregma لضمان إحداثيات حقن الخلايا الصحيحة. يجب أن يكون خفض ورفع الإبرة في الدماغ بطيئا لمنع الصدمة والتدفق العكسي.
بعد حقن الخلايا السرطانية ، يمكن استخدام فحوصات التصوير بالرنين المغناطيسي الأسبوعية لتحديد حجم الورم الأساسي قبل بدء العلاج ولتصور عبء الورم المتغير داخل الدماغ.
