بينما يتم استخدام تقنيات تقييم المؤشرات الحيوية الكيميائية الحيوية على نطاق واسع ، يقدم هذا البروتوكول تفاصيل مهمة لتوحيد وتكرار المنهجية في الأنوران الاستوائية الجديدة. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي تكلفتها المنخفضة وقابليتها للتكرار وتطبيقها. يمكن تطبيق هذه التقنية للحصول على بيانات كمية لتقييم التغيرات في الميلانين الداخلي.
مقايسة المذنب هي تقنية حساسة ومتعددة الاستخدامات وبسيطة تسمح بتحديد التأثيرات السامة للجينات التي يسببها مركب معين. يمكن تطبيقه على أي نوع من الخلايا حقيقية النواة لمراقبة تلف الحمض النووي وإصلاح الحمض النووي وتقييم حالة مضادات الأكسدة للخلايا. للبدء ، افتح البرنامج Image-Pro Plus 6.0 وحدد القائمة وشريط الأدوات كبيولوجي.
لتحديد المساحة التي يشغلها الميلانين، حدد قياس، ثم حدد المعايرة المكانية للتكبير المستخدمة لالتقاط الصور المجهرية. بعد فتح الصورة النسيجية، حدد عدد الأدوات ثم قم بقياس الكائنات. ضع علامة على التلوين المراد قياسه في الصورة باستخدام أداة تحديد الألوان والقطارة، ثم أغلق النافذة.
تصور النتائج بالنقر فوق العد والعرض والإحصائيات. احتضان خليط من PBS وبيروكسيد الهيدروجين وعينة في كوفيت كوارتز سعة ثلاثة ملليلتر بطول مسار سنتيمتر واحد. ثم قم بإزالة العينة المحفوظة في أنبوب طرد مركزي سعة 500 ميكرولتر وأضفها إلى كوفيت الكوارتز.
اقرأ حركية الكاتلاز عند 240 نانومتر لمدة دقيقتين في مقياس الطيف الضوئي للأشعة فوق البنفسجية واحسب نشاط الإنزيم باستخدام المعادلة الموضحة على الشاشة. خفف عينة الدم التي تم جمعها بملليلتر واحد من PBS. قم بالطرد المركزي عند 381 جم لمدة تسع دقائق ، وأعد تعليق الحبيبات ب 50 مل من PBS.
امزج 30 ميكرولترا من عينة الدم في 70 ميكرولترا من درجة الانصهار المنخفضة agarose أو LMPA بتركيز 0.5٪ من الاغاروز لتشكيل الطبقة الثانية. ضع 50 ميكرولترا من الطبقة الثانية على شريحة مغلفة مسبقا بالطبقة الأولى تحتوي على 100 ميكرولتر من 0.5٪ نقطة انصهار عادية من الاغاروز. قم بتغطية الشريحة بغطاء وضعها في البرد عند أربع درجات مئوية لمدة 10 دقائق لتصلب الطبقة الثانية.
بعد التصلب ، قم بإزالة الغطاء. قم بتشكيل الطبقة الثالثة عن طريق وضع 100 ميكرولتر من 0.5٪ LMPA وتغطية الشريحة مرة أخرى. بعد أن تصلب الطبقة الثالثة ، قم بإزالة الغطاء واغمر كل شريحة في وعاء كوبلين سعة 100 مل يحتوي على محلول التحلل المحضر في نفس اليوم.
ضع برطمانات الكوبلين في حمام بارد على حرارة أربع درجات مئوية لمدة ساعة واحدة في الظلام حتى يحدث التحلل. في نهاية التحلل ، قم بإزالة الشرائح واغمرها في محلول المخزن المؤقت للرحلان الكهربائي في خزان الرحلان الكهربائي لمدة 15 دقيقة عند أربع درجات مئوية للسماح للحمض النووي بالاسترخاء. بعد فك الحمض النووي النووي ، قم بإجراء الرحلان الكهربائي على نفس المخزن المؤقت عند أربع درجات مئوية لمدة 10 دقائق عند 25 فولت و 250 مللي أمبير.
في نهاية الرحلان الكهربائي ، قم بتحييد العينات في الشرائح عن طريق إضافة ملليلترين من محلول الهيدروكلوريك ثلاثي ثلاث مرات لمدة خمس دقائق. ضع العينات في عبوات كوبلين سعة 100 مل تحتوي على 95٪ كحول عند أربع درجات مئوية لتجفيف العينات. قم بتلطيخ العينات بإضافة 10 ميكرولتر من DAPI إلى وسط الشريحة.
ثم انشر الصبغة في جميع أنحاء العينات باستخدام غطاء. افحص الشرائح تحت مجهر ضوئي مضان باستخدام مرشح NU. حدد كمية تلف الحمض النووي من خلال تقييم طول هجرة الحمض النووي من النواة.
في هذه الحالة ، حدده بصريا على 100 خلية مختارة عشوائيا دون تداخل. ثم قم بتصنيف تلف الحمض النووي إلى أربع فئات حيث صفر إلى واحد لعدم وجود ضرر ، واثنان للحد الأدنى من الضرر ، وثلاثة للضرر المتوسط ، وأربعة للضرر الأقصى. عبر عن البيانات كمتوسط عدد الخلايا التالفة ومتوسط درجة المذنب لكل مجموعة علاجية.
أخيرا ، من هذه البيانات ، احسب مؤشر الضرر الجيني أو GDI لكل كائن اختبار باستخدام المعادلة الموضحة على الشاشة. يظهر مؤشر الكتلة المتدرج للبالغين Boana pulchella و Leptodactylus luctator في هذا الشكل. لتحليل مؤشر الكتلة المقاسة ، تم إجراء تحليل انحدار غير خطي يوضح علاقة دالة القوة بين SVL وكتلة الجسم للأنواع لتحديد أس التحجيم.
يعد مؤشر الكتلة المتدرج مفيدا لمقارنة مجموعات البالغين أو الأحداث من نفس النوع. يتم عرض الأقسام النسيجية لكبد Boana raniceps هنا. يمكن ملاحظة كمية أكبر من c وأبعاد أكبر لخلايا الكبد ونواة خلايا الكبد من هذه الأقسام.
تظهر الاستجابات المختلفة والتكميلية للمؤشرات الحيوية الخلوية في التعرض لسيناريو مبيدات الأعشاب في Boana pulchella في هذا الشكل. هنا ، تشير الأشرطة السوداء إلى 48 ساعة ، وتشير الأشرطة الرمادية إلى 96 ساعة. يجب دائما اعتبار وقت التعرض والتركيز عاملا هنا لأن وقتا أو تركيزا معينا قد لا يكونا كافيين لإحداث الضرر.
تصف الصورة التمثيلية كيفية ارتباط المؤشرات الحيوية بمؤشر استجابة المؤشرات الحيوية. وهنا، يشير اللون الأزرق إلى مجموعة التحكم، بينما تشير الألوان البرتقالية والصفراء والخضراء إلى سيناريوهات التعرض للإشريك ثنائي الفينيل متعدد البروم 209. تشير هذه البيانات إلى أن الكاتلاز هو مؤشر حيوي فعال لحالات الإجهاد التي يوجد فيها الضغوطات بأعلى تركيزات.
عند حساب مؤشر حالة الجسم ، التقط صورا باستمرار من نفس المسافة. في الضفادع الصغيرة ، قم بقياس طول جسم SVL حتى الأنبوب المذرقي ، باستثناء زعنفة الياقة. يعالج هذا النهج بأمان فسيولوجيا البرمائيات وتأثير التغيرات البيئية.
في حين توجد مؤشرات حيوية بديلة يحتمل أن تكون غازية ، فإن هذه الطرق تقدم رؤى حول الإجهاد التأكسدي والديناميكا السمية وعلم السموم. يمكن أن تكون قياسات الإنزيم الإضافية المتعلقة بالإجهاد التأكسدي بمثابة منهجيات بديلة. تقوم تقنية تحليل اختلاف اللون بتقييم استجابات الأنسجة في الصور المجهرية بناء على التفاوتات اللونية.
بالنسبة للنظام الصباغي ، تأكد من توافق معايرة البرنامج مع التصوير المجهري. هذه التقنية المتقدمة مفيدة في التحقيق فيما إذا كانت الكائنات الحيوية الغريبة تؤثر بشكل مباشر على الحمض النووي في أنواع الخلايا المتنوعة ، ومعالجة الاستفسارات المتعلقة بالضرر التأكسدي للمواد الوراثية وعمليات الإصلاح التي لا تستطيع تقنيات الوراثة الخلوية الأخرى معالجتها.
