تسمح هذه التقنية بالتشخيص التأكيدي لأمراض البريون بواسطة تقنية PrP scrapie في الأنسجة ، وتحليل أنواع PrP scrapie وتوزيعها لتقييم الانحراف العقابي إلى ملف ترسيب PrP المعروف للسكرابي. هذه التقنية موحدة وتستخدم أجساما مضادة محددة ل PrP scrapie ، مما يتيح تصور ترسب PrP scrapie في الأنسجة. تعطي هذه التقنية أيضا معلومات حول المنطقة التشريحية العصبية ونوع الخلايا.
ابدأ بوضع الشرائح مع أقسام الأنسجة في سلة تلطيخ من الفولاذ المقاوم للصدأ. ضع السلة في حمام الزلين. بعد ثلاث دقائق ، قم بإزالة السلة وغمرها مرة أخرى.
لإزالة الزيلين وإعادة ترطيب الأقسام ، اغمر السلة في حمام إيثانول مطلق. بعد ثلاث دقائق ، قم بإزالة السلة وغمرها مرة أخرى. جفف الأجزاء في الهواء قبل وضعها في حمام إيثانول بنسبة 90٪ لمدة دقيقة واحدة.
بعد ذلك ، انقل القسم إلى حمام إيثانول بنسبة 70٪ لمدة دقيقة أخرى. لكل علاج حمام إيثانول ، حرك سلة الشرائح برفق مرتين وصفي السلة قبل النقل التالي. انقل السلة إلى حمام إيثانول بنسبة 50٪ لمدة دقيقة واحدة.
اغمر أقسام الأنسجة بعناية في 98٪ حمض الفورميك في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. شطف الأجزاء في ماء الصنبور لمدة خمس دقائق تليها الشطف مرتين في الماء المقطر. استخدم حاوية تلطيخ من الفولاذ المقاوم للصدأ في حجرة الضغط المملوءة ب 500 ملليلتر من الماء المقطر لمعالجة محلول سترات 10 ملليمولار عند 98 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.
لأغراض مراقبة الجودة ، ضع قسما من شريط مؤشر الأوتوكلاف اللاصق على السلة لمراقبة درجة الحرارة والضغط. بمجرد أن يشير الإنذار إلى أن الجهاز قد وصل إلى وقت البرنامج ودرجة الحرارة ، اغمر السلة بالشرائح. بعد ذلك ، ابدأ البرنامج على غرفة الضغط لتعيين النقطة 2 وتسجيل الضغط الأولي والنهائي لهذا البرنامج.
لتعطيل البيروكسيديز الداخلي ، اغمر سلة الشرائح التي تحتوي على أقسام العينة في حمام من بيروكسيد الهيدروجين 3٪ في الميثانول لمدة 30 دقيقة. قم بسد الأقسام تحت الماء الجاري لمدة خمس دقائق بعد التصريف ، اغمر الأقسام في محلول ملحي مخزن في Tris لمدة خمس دقائق إضافية. للكشف المناعي ، ضع كل شريحة على حامل لوحة غطاء متاح تجاريا مبلل مسبقا بمحلول ملحي مخزن من Tris مع جانب الأنسجة المواجه للحامل وحواف الشريحة التي تتزامن مع النقطتين السفليتين للحامل.
تأكد من تجنب فقاعات الهواء. أمسك مجموعة حامل الشريحة بين الإبهام والسبابة. احتفظ بإصبع واحد أعلى شريحة العينة والآخر في الجزء السفلي من الحامل ، ثم ضع التجميع في معرض النظام.
للتأكد من تجميع المجموعة جيدا ، املأ البئر بين شريحة العينة والحامل بمحلول ملحي مخزن من Tris دون أن يفيض عليه. من هذه النقطة ، تأكد من أنه يجب الاحتفاظ بحوالي 80 ميكرولترا من محلول ملحي مخزن Tris بين الحامل والشريحة. لا تدع الأقسام تجف.
قلل من تلطيخ الخلفية قبل العلاج بالجسم المضاد الأساسي عن طريق احتضان عينات الشريحة مسبقا لمدة 30 دقيقة باستخدام مصل طبيعي بنسبة 20٪ من نفس النوع مثل مضيف الجسم المضاد الثانوي في محلول ملحي مخزن من Tris. بدون غسل الأقسام ، ضع 200 ميكرولتر من محلول الأجسام المضادة الأساسي مباشرة في كل بئر من مجموعة حامل الشريحة واحتضانها لمدة 60 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. لغسل الأقسام ، املأ الآبار بمحلول ملحي مخزن من Tris ، وانتظر لمدة خمس دقائق.
كرر الغسيل مرتين. بعد ذلك ، قم بتخفيف الجسم المضاد الثانوي البيوتينيل بتركيز 1 إلى 200 في محلول ملحي مخزن من Tris مع مصل حصان 10٪. إصلاح الحجم المطلوب اعتمادا على عدد الأقسام المراد معالجتها.
ضع 200 ميكرولتر من محلول الأجسام المضادة الثانوي على كل بئر من مجموعة حامل الشريحة. بعد 30 دقيقة من الحضانة في درجة حرارة الغرفة ، كرر غسول المحلول الملحي المخزن من Tris. للحضانة باستخدام بيروكسيديز مركب avidin-biotin ، قم بإعداد الكاشف قبل 30 دقيقة من الاستخدام وقم بتطبيق 200 ميكرولتر من المحلول في كل بئر من حامل لوحة الانزلاق.
بمجرد الانتهاء من ذلك ، احتضن حامل اللوحة لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. تم تحديد مستوى وضع العلامات المناعية غير المحددة في الحيوانات ذات الاعتلال الدماغي الإسفنجي القابل للانتقال المعروف - السيطرة السلبية لتفسير العلامات المناعية لبروتينات البريون غير الطبيعية المحددة بشكل صحيح. لوحظ أن العلامات غير المستهدفة بواسطة الأجسام المضادة ل PrP تحدث على شكل تلطيخ منفصل داخل الخلايا العصبية الدقيقة ، وخيوط خطية دقيقة غير منتظمة من البقع في neuropil ، ووضع العلامات غير الجسيمية المنتشرة في بعض مناطق المادة الرمادية والبيضاء ، ووضع العلامات السيتوبلازمية المنتشرة للخلايا العصبية.
يلخص الجدول وصف أنواع بروتين البريون غير الطبيعي المسمى بالمناعة الذي لوحظ في اعتلال الدماغ الإسفنجي البقري ، والسكرابي الكلاسيكي وغير النمطي ، ومرض الهزال المزمن لعنق الرحم من أجل التشخيص الإيجابي والمعايير المحددة للنتائج السلبية وغير الحاسمة وغير المناسبة. جميع الخطوات مهمة جدا. يعد الرقم الهيدروجيني للمحاليل ودرجة حرارة الغرفة من الميزات المهمة لنجاح هذه التقنية.
يمكن أن يؤدي تطوير الكيمياء الهيستولوجية المناعية للكشف عن كل من سكرابي PrP ونوع الخلايا إلى إعطاء معلومات حول كل خلية تشارك في التسبب في المرض الرئيسي.
