تكمن أهمية البروتوكول في ملاءمته في الوقت القصير اللازم لإنجازه. وهذا يتيح إنتاجية عالية وتركيزا عاليا ودرجة عالية من عزل trichomes المطاردة واللاطئة. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي استقامتها.
خلال هذه التقنية ، يجب على المرء مراعاة كثافة trichome لمصدر النبات وفحص درجة العزل في كل خطوة عبر المجهر أثناء إجراء البروتوكول لأول مرة. ومن بين هذه التقنية نوريت شاليف، الخبيرة في القنب من مركز فولكاني. ابدأ بسحق كتلة ثلج جافة إلى رقائق صغيرة ودقيقة باستخدام مطرقة وجسم صلب مسطح في حاوية بلاستيكية سعة خمسة لترات.
استخدم مصفاة كبيرة ، وقم بغربلة رقائق الثلج الجاف الناعم من الثلج الجاف غير المسحوق في حاوية بلاستيكية أخرى سعة خمسة لترات. صب حوالي 200 سم مكعب من رقائق الثلج الجافة في دورق زجاجي مستقيم سعة لتر واحد. أضف ما يصل إلى 10 غرامات من نورات القنب ساتيفا المجمدة على الطبقة الأولى من الثلج الجاف المسحوق ، وقم بتغطيتها بطبقة إضافية من 200 سم مكعب من الثلج الجاف المسحوق جيدا.
ثم قم بتغطية فتحة الدورق الزجاجي سعة لتر واحد بطبقتين إلى ثلاث طبقات من ناموسية باب الشاشة ملليمتر واحد ، وقم بتثبيتها بأشرطة مطاطية. بعد ذلك ، صب النيتروجين السائل في وعاء كبير من الفولاذ المقاوم للصدأ مستدير القاع. أدخل شبكة 350 ميكرومتر في منخل الدقيق أو مصفاة غربال لتغطية شبكة غربال الدقيق من الأسفل.
ضع منخل الدقيق هذا فوق الحاوية الكبيرة المستديرة السفلية المصنوعة من الفولاذ المقاوم للصدأ المملوءة بالنيتروجين السائل. لتقليل فقد الكتلة المنخل ، تأكد من أن عرض الحاوية يتجاوز عرض منخل الدقيق. افصل trichomes عن المواد النباتية عن طريق هز الزجاج سعة لتر واحد مع توجيه فتحته لأسفل نحو غربال الدقيق.
ضع الدورق جانبا كل دقيقتين إلى ثلاث دقائق ، مما يسمح بغربلة الثلج الجاف المسحوق والمواد النباتية المتراكمة على غربال الدقيق. نخل غربال الدقيق أفقيا لتسهيل مرور المادة النباتية إلى النيتروجين السائل في حاوية الفولاذ المقاوم للصدأ ذات القاع المستدير الموضوعة أدناه. بعد ذلك ، أضف النيتروجين السائل إلى حاوية الفولاذ المقاوم للصدأ والثلج الجاف المسحوق إلى الدورق الزجاجي سعة لتر واحد عندما تنخفض مستوياته.
عندما تنفد المادة النباتية الموجودة على غربال الدقيق ، أعد ملء المواد النباتية المستخدمة في الدورق الزجاجي ب 10 جرامات إضافية من المواد النباتية الطازجة ، وكرر عملية الغربلة حتى يتم جمع كمية كافية من trichomes المخصب في الحاوية. تحقق من وجود مادة تشبه المسحوق الأبيض في قاع حاوية الفولاذ المقاوم للصدأ مغمورة في النيتروجين السائل قبل مراقبة المجهر لتأكيد جمع ما يكفي من trichomes. أضف كمية صغيرة من النيتروجين السائل إلى وعاء نظيف وصغير من الفولاذ المقاوم للصدأ مستدير القاع.
ثم قم بطي منخل دقيق 40 × 40 سم بحجم شبكة 150 ميكرومتر مرتين للحصول على طية 20 × 20 سم ، وافتحه في شكل مخروطي. ثبت مخروط الشبكة على حافة الحاوية المستديرة السفلية المصنوعة من الفولاذ المقاوم للصدأ باستخدام واحد أو اثنين من مشابك الغسيل بحيث يكون الجزء المفتوح من المخروط في وضع مستقيم ، ويتم غمر الجزء المدبب جزئيا في النيتروجين السائل. بمجرد الانتهاء من ذلك ، صب برفق النيتروجين السائل الذي يحتوي على المادة الشبيهة بالمسحوق الأبيض التي تم الحصول عليها مسبقا في مخروط الغربال الدقيق.
باستخدام فرشاة عريضة ، قم بجمع ونقل أي مواد نباتية متبقية من الحاوية الأولى إلى مخروط شبكي 150 ميكرومتر. بعد ذلك ، افصل مشابك الغسيل بعناية عن غطاء الحاوية ، وافتح مخروط المنخل الصغير لتحديد موقع trichomes في منتصف المنخل الصغير المفتوح. امسك جميع الزوايا الأربع للمنخل الصغير معا ، واغمر الجزء الأوسط الذي يحتوي على trichomes في النيتروجين السائل.
تراجع بلطف ويهز المجهر في النيتروجين السائل لمدة دقيقة واحدة. باستخدام إبرة معقمة ، قم بعمل ثقوب صغيرة في غطاء أنبوب اختبار سعة 50 ملليلتر لتجنب بناء الضغط. اغرف بقايا النبات غير المنخل ، والثلج الجاف ، والترايكهومات الأكبر حجما الملفوفة في وسط المنخل الصغير في أنبوب اختبار سعة 50 ملليلتر ، وقم بتخزينه عند 80 درجة مئوية تحت الصفر للاستخدام في المستقبل.
نقل trichomes المنخل المغمورة في النيتروجين السائل بالتتابع من خلال microsieves ، مع انخفاض أحجام صب من 105 إلى 80 إلى 65 ، ثم إلى 50 ميكرومتر. بعد كل عملية نقل ، اجمع الترايكهومات ذات الأحجام المختلفة المتبقية على المنخل الصغير بشكل منفصل ، وقم بتسميتها. اصنع ثقوبا صغيرة في غطاء الأنبوب باستخدام إبرة معقمة.
انقل الترايكهومات المرغوبة المغمورة في النيتروجين السائل وملفوفة في منخل دقيق 50 ميكرومتر إلى طبق نظيف باستخدام ملعقة مبردة مسبقا. ثم انقل بسرعة trichomes الشبيهة بالمسحوق إلى أنبوب 1.5 ملليلتر مبرد مسبقا باستخدام ملعقة مبردة مسبقا ، وقم بتخزين الأنابيب على الفور عند 80 درجة مئوية تحت الصفر لمزيد من الدراسات. في المرحلة الأولى من عملية العزل ، كانت قطع أنسجة الأوراق سائدة في الجزء المعزول ، على عكس منتج العزل النهائي ، الذي كان يتكون بالكامل من ترايكهومات معزولة غير ملوثة.
لوحظت جودة الرؤوس الحبيبية المعزولة المطاردة والثلاثية اللاطئة في خطوة العزل النهائية. كانت نقاء trichomes المعزولة باستخدام هذه الطريقة قابلة للمقارنة مع البروتوكول التقليدي. تم الاحتفاظ بهيكل رأس trichome المطارد الدقيق ، وكانت الرؤوس الكاملة لل trichome المطاردة المعزولة مرئية ، على عكس الطريقة التقليدية ، حيث كان هيكل رأس trichome الكامل مفقودا ، وكانت خلايا القرص فقط موجودة.
أشار استخراج الحمض النووي الريبي وتقدير سلامة الحمض النووي الريبي للترايكهومات المعزولة إلى ارتفاع عدد سلامة الحمض النووي الريبي أو قيم RIN من 9.4 إلى 10 ، وأشار كروماتوغرافيا الهلام إلى سلامة عالية للحمض النووي الريبي. قم بإجراء حركة التسريب الشبيهة بكيس T بعناية للعزل المجهري من 150 إلى 50. يمكن أن توفر هذه الطريقة نظرة ثاقبة للتركيب النسخي وربما البروتيني للترايكهوم من القنب و trichomes من الأنواع النباتية الأخرى.
بعد هذا الإجراء ، يمكن إجراء توصيفات التمثيل الغذائي والنسخ. يمكن أن تساعد هذه الطرق الإضافية في فهم مستويات التعبير عن الجينات في trichomes المعزولة وخصائصها الأيضية. وقد مكنت هذه التقنية من التوصيف النسخي للترايكهومات الغدية من أنواع مختلفة من القنب.
