يتيح هذا البروتوكول تحديد شركاء ربط البروتين لتسلسل الحمض النووي الريبي المعروف عن طريق سحبهم لأسفل من المستخلص الخلوي باستخدام قليل النيوكليوتيدات الحمض النووي الريبي البيوتينيل. بالمقارنة مع الطرق التي تتطلب المنظفات أو درجات الحرارة المرتفعة لفصل البروتينات عن الحمض النووي الريبي ، تستخدم هذه البروتوكولات بدلا من ذلك ظروفا خفيفة جدا تسمح أيضا بالحفاظ على مجمعات البروتين المحتملة. سيوضح الإجراء جاكوب روبرت ، طالب دكتوراه بموجب مقدمتي.
ابدأ حصاد البروتين الكلي عن طريق إزالة الوسط من آبار لوحة خلية HEK 293T ، وغسل آبار ألواح الآبار الستة بمليلتر واحد من PBS. تخلص من PBS وانقل الألواح إلى الجليد ، قبل إضافة 200 ميكرولتر من محلول التحلل إلى كل بئر. افصل الخلايا وكسرها باستخدام مكشطة الخلايا قبل نقل مستخلص الخلية المشتق من بئرين إلى نفس الأنبوب سعة 1.5 ملليلتر.
بعد 30 دقيقة من الحضانة على الجليد والطرد المركزي ، انقل المادة الطافية إلى أنبوب مبرد مسبقا. بعد ذلك ، احسب حجم مستخلص البروتين المقابل ل 1.5 ملليغرام من البروتينات. ثم أحضر جميع العينات إلى الحجم النهائي البالغ 600 ميكرولتر باستخدام مخزن مؤقت للتحلل.
احتفظ بالعينات على الثلج حتى الاستخدام. لتحضير الخرزات ، امزجها في المخزن المؤقت للتخزين عن طريق تحريك الأنبوب. بعد حساب 100 ميكرولتر من وسط الملاط لكل عينة ، ضع الحجم المحسوب للملاط في رف مغناطيسي.
لغسل الخرز ، قم بإزالة محلول التخزين ، واغسل الخرزات بإضافة ملليلتر واحد من المخزن المؤقت للتحلل وقلبه يدويا. ثم قم بإزالة المخزن المؤقت باستخدام الرف المغناطيسي وكرر خطوة الغسيل. إلى الخرز ، أضف حجما من محلول التحلل يساوي الحجم الأولي لوسط الملاط ، واخلطه عن طريق تحريك الأنبوب قبل توزيع الوسط بشكل موحد في أكبر عدد ممكن من الأنابيب سعة 1.5 ملليلتر كعينات.
لحجب الخرزة ، قم بإزالة المخزن المؤقت باستخدام الرف المغناطيسي وأضف 600 ميكرولتر من 0.25 ملليغرام لكل ملليلتر من محلول الخميرة TRNA المحضر في محلول التحلل. احتضانها لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة على عجلة دوارة. قم بإزالة محلول TRNA باستخدام الرف المغناطيسي قبل إضافة 600 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتحلل ، واغسله عن طريق الخلط يدويا.
كرر خطوة الغسيل وتخلص من المخزن المؤقت. لكل أنبوب يحتوي على 100 ميكرولتر أولي من وسط الملاط ، قم بإعداد 200 ميكروغرام من قليل النوكليوتيد RNA في 600 ميكرولتر من محلول التحلل. أضف oligo إلى الخرز واحتضانه لمدة ساعة في درجة حرارة الغرفة أثناء الدوران.
أخرج المحلول من الخرز واغسله مرتين ب 600 ميكرولتر من محلول التحلل عن طريق تدوير الأنابيب لمدة خمس دقائق لكل منها في درجة حرارة الغرفة. تجاهل المخزن المؤقت. لربط البروتين على الخرز ، افصل 5٪ أو 30 ميكرولترا من الحجم عن محلول البروتين 600 ميكرولتر واحتفظ به كمدخل أو IN لمزيد من التحليل.
أضف مزيج البروتين المتبقي إلى كل أنبوب من الخرز المحمل ، واحتضانه بدورات بطيئة طوال الليل عند أربع درجات مئوية. قم بإزالة جزء البروتين غير المنضم من الخرز باستخدام الرف المغناطيسي. وفر 5٪ أو 30 ميكرولترا من حجمه وقم بتسميته يتدفق من خلاله أو قدمه. أضف ملليلتر واحد من المخزن المؤقت للغسيل 1 إلى الخرز ، وقم بتدويره لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية.
تخلص من المخزن المؤقت وكرر هذا الغسيل مرة واحدة. أضف ملليلتر واحد من المخزن المؤقت للغسيل 2 إلى الخرز. وبعد الحضانة عند أربع درجات مئوية على المدور لمدة خمس دقائق ، تخلص من المادة الطافية.
لاستخلاص المجلدات المحددة ، أضف 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت للشطف 1 إلى الخرز. بعد الخلط يدويا عن طريق النقر ، احتضانه لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. ضع الأنابيب في خلاط حراري ورجها بقوة لمدة خمس دقائق عند 95 درجة مئوية.
ثم ضع الأنبوب في الرف المغناطيسي واجمع الجزء المستحث في أنبوب نظيف. بمجرد الانتهاء من ذلك ، قم بتدوير الخرز بسرعة باستخدام جهاز طرد مركزي على مقاعد البدلاء لتحقيق أقصى قدر من استعادة الإشطاف. ووفر 5٪ أو خمسة ميكرولتر من إجمالي حجم eluate أو EL لمزيد من التحليلات.
تم تحديد البروتينات المستخلصة بواسطة قياس الطيف الكتلي. كشف رسم البروتينات المخصبة بشكل كبير في مخطط بركان أن إجمالي محتوى البروتين والبروتينات المخصبة المستخلصة من الحمض النووي الريبي كانت أعلى بكثير من الحمض النووي الريبي ، مما يشير إلى أن الحمض النووي الريبي يمكنه إنشاء عدد أكبر من التفاعلات المحددة. كأمثلة على الاتفاق بين النتائج المتوقعة والتي تم الحصول عليها ، أظهرت درجات التفاعل ل زائد الحمض النووي الريبي وناقص الحمض النووي الريبي مع البروتينات من البروتين البشري أنه كان من المتوقع أن يرتبط HNRNPH3 بالإضافة إلى الحمض النووي الريبي بشكل انتقائي ، و PCBP2 للتفاعل على وجه التحديد مع الحمض النووي الريبي.
بالإضافة إلى ذلك ، كان من المتوقع أن يكون البروتين RBM41 منحلا لكل من قليل النيوكليوتيدات RNA. أكد تحليل التحليل الطيفي الكتلي لعينات مقايسة سحب البروتين وجود HNRNPH3 في الحمض النووي الريبي و PCBP2 في ناقص الحمض النووي الريبي. بينما تم العثور على RBM41 للتفاعل مع كليهما.
تم استخدام اللطخة الغربية للكشف عن وجود TDP-43 في النتائج وخطوات تحسين البروتوكول. في الحمض النووي الريبي ، لوحظ TDP-43 في عينة الإدخال والشطف ، مما يشير إلى وجوده منذ البداية. تم الاحتفاظ ب TDP-43 بواسطة الحمض النووي الريبي أثناء خطوات الغسيل وتم استخلاصه في النهاية بمحلول ملح مرتفع.
من خلال رسم خرائط تفاعلات الحمض النووي الريبي البروتيني ، يمكن لهذه الطريقة الكشف عن شبكات جزيئية كبيرة وراء العديد من المسارات الفسيولوجية. على سبيل المثال ، تنظيم النسخ أو الآليات المرضية بما في ذلك السرطان والتنكس العصبي.
