أثناء تسجيل تصوير الكالسيوم ، تتحرك الخلايا في جميع الاتجاهات. تم تطوير العديد من الأدوات لتصحيح حركة X و Y ، ولكن الحركة على المحور Z تحتاج أيضا إلى تشخيص وتصحيح صريح. TACI هو مكون إضافي J سهل الاستخدام مفتوح المصدر.
يتحقق من الانجراف Z ويحلل تصوير الكالسيوم 3D مع الحركة في جميع الاتجاهات. بعد تحضير يرقات الذبابة ، اشطفها في برنامج تلفزيوني ثلاث مرات. ماصة 75 ميكرولتر من PBS على وسط شريحة زجاجية.
ضع يرقة واحدة أو اثنتين في برنامج تلفزيوني وضع ميكروبروب الحرارية بالقرب من اليرقات. قم بتغطية اليرقات والمسبار الدقيق الحراري بغطاء زجاجي وختمه بطلاء الأظافر. ضع الشريحة على مرحلة المجهر.
ابحث عن التركيز باستخدام هدف 25 مرة وضع المبرد الكهربائي الحراري على الشريحة. في البرامج البؤرية ، ركز على خلايا الفلورسنت ذات الأهمية. اضبط طاقة الليزر لتجنب التشبع الزائد واضبط مواضع الشريحة الأولى والأخيرة في إعداد مكدس Z.
في نفس الوقت ، ابدأ مسح مكدس Z وتسجيل درجة الحرارة. تحكم في مصدر الطاقة الذي يشغل بلتيير لتغيير درجة حرارة سطح بلتيير. بعد ذلك ، أوقف مسح مكدس Z وتسجيل درجة الحرارة.
بعد تنزيل جرة نقطة تصوير الكالسيوم TACI ، قم بتثبيت المكون الإضافي في فيجي بالنقر فوق المكونات الإضافية في شريط القائمة ، متبوعا بالتثبيت في القائمة المنسدلة. ثم أعد تشغيل فيجي وقم بتشغيل المكون الإضافي بالنقر فوق المكونات الإضافية واختيار تصوير الكالسيوم TACI. اختر وظيفة إعادة التسمية لتحويل أسماء ملفات TIFF إلى البنية المطلوبة.
اختر المجلد الذي تحتاج صور TIFF إلى إعادة تسميته بالنقر فوق استعراض المجلدات وانتظر حتى يتم ملء اسم الملف تلقائيا باستخدام اسم المجلد. تحقق من الحد الأقصى لموضع T والحد الأقصى لموضع Z. تأكد من أن قيم المعلمات لموضع T الأقصى وموضع Z الأقصى تتضمن جميع الأرقام.
أدخل موضع كل معلمة بالترتيب. إذا لم تتضمن أسماء ملفات TIFF العبارة والقناة ، فاترك قيمة المعلمة المقابلة فارغة واختر NA بالترتيب. إذا كان هناك أي نص حاشي، فستتم إضافته إلى معلمة النص اللاحق.
انقر فوق إعادة تسمية لإنشاء مجلد بنفس الاسم ، متبوعا بشرطة سفلية R.لاحظ أنه تمت إعادة هيكلة أسماء ملفات TIFF في المجلد لتكون متوافقة مع وظيفة التنظيم. بعد ذلك ، استخدم وظيفة التنظيم لحفظ صور TIFF في نفس موضع Z في مجلد واحد. اختر المجلد الذي تحتاج فيه صور T إلى التنظيم بالنقر فوق استعراض المجلدات.
إذا كان ملف المعلمة CSV موجودا ، فانتظر حتى يتم ملء قيم المعلمات تلقائيا. إذا لم يكن ملف CSV للمعلمة موجودا، فقم بتعبئة قيم المعلمات يدويا. تأكد من أن قيم المعلمات للطور والقناة تتضمن أحرف إن وجدت ، بينما يجب أن تكون قيم المعلمات لموضع T وموضع Z أكبر عدد من المواضع T و Z.
إذا كانت أسماء ملفات الصور لا تتضمن المرحلة أو القناة، فأدخل NA. ثم قم بإنشاء صور TIFF ذات مقياس رمادي عند الحاجة عن طريق التأكد من عدم تحديد المربع R صور رمادية. انقر فوق تنظيم لإنشاء مجلد بنفس الاسم متبوعا بتسطير سفلي رمادي مكدس، ولإنشاء مجلدات بنفس الاسم متبوعا بشرطة سفلية ورقم موضع Z في المجلد. ثم لاحظ أن ملفات TIFF يتم فرزها في مجلدات مقابلة حسب مواضع Z ، وأنه يتم إنشاء ملف يسمى param dot CSV حيث يمكن العثور على المعلمات وقيمها.
الآن استخدم trackmate في فيجي لاستخراج شدة مضان الخلايا ذات الاهتمام من كل موضع Z. افتح صور TIFF في مجلد موضع Z بواسطة فيجي وقم بتشغيل TRACKMATE بالنقر فوق المكونات الإضافية وتحديد التتبع ، متبوعا ب Trackmate. اضبط المعلمات باستخدام كاشفات DOG أو LOG.
قم بتغيير عتبة قطر النقطة والمرشح المتوسط. اضبط المرشحات لإزالة الإشارات غير ذات الصلة. اضبط المسافة القصوى للربط ، والمسافة القصوى لإغلاق الفجوة ، وفجوة الإطار القصوى لإغلاق الفجوة.
تصدير شدة التألق للمناطق المهمة إلى ملف CSV. لكل خلية عصبية ، قم بإنشاء مجلد وقم بتسميته باستخدام رقم الخلية العصبية. بدءا من الخلية العصبية صفر.
احفظ ملفات CSV التي تحتوي على معلومات مضان للخلية العصبية المقابلة في المجلد. قم بتسمية ملفات CSV كمتوسط كثافة Z رقم الموضع نقطة CSV وقم بتضمين عمودين على الأقل ، الموضع T ومتوسط الكثافة ، أو متوسط كثافة القناة الأولى. قم بإنشاء قائمة الشرطة السفلية الخلفية ملف CSV الذي يحتوي على معلومات جميع الخلايا العصبية بتنسيق معين ، بدءا من الخلايا العصبية صفر.
املأ أرقام الخلايا العصبية مثل الخلية العصبية صفر في الصف الأول. ثم قم بتوفير كثافة الخلفية لكل موضع Z تم تحليله. إذا تم تحليل أربعة مواضع Z للخلية العصبية صفر ، فاملأ أربع قيم لشدة الخلفية أسفل صفر الخلية العصبية.
احفظ ملف CSV النقطي لقائمة الخلفية التي تم إنشاؤها والمجلدات التي تحتوي على ملفات CSV لمعلومات التألق في مجلد واحد. افتح TACI واختر وظيفة الاستخراج. ثم اختر المجلد بالنقر فوق تصفح الملفات.
يتم ملء ملف الخلفية تلقائيا. املأ أكبر عدد من مواضع T لعدد مواضع T. انقر فوق استخراج لإنشاء مجلد نتائج يتضمن ملفات CSV ومؤامرات كل خلية عصبية.
تتضمن ملفات CSV أقصى كثافة مضان ، ودلتا F على دلتا صفر في كل موضع T. المخططات عبارة عن مخططات خطية لدلتا F على F صفر مقابل مواضع T. باستخدام دالة الدمج ، قم بحساب متوسط دلتا F على F صفر من جميع الخلايا العصبية.
احسب SEM وارسم متوسط دلتا F على F صفر على مواضع T. اختر مجلد النتائج الذي تم إنشاؤه بواسطة وظيفة الاستخراج بالنقر فوق تصفح الملفات. املأ عدد مواضع T بأكبر عدد من مواضع T.
انقر فوق دمج لإنشاء مجلد بيانات مدمج ، بما في ذلك ملف CSV للبيانات المدمجة التي تم تسطيرها ومتوسط الشرطة السفلية DF F صفر نقطة مخطط PNG. يتضمن ملف CSV متوسط و SEM دلتا F على F صفر المعلومات في كل موقف T. الرسم عبارة عن مخطط خطي لمتوسط دلتا F على F صفر على مواضع T.
تصوير الكالسيوم للخلايا الباردة ليرقات الذباب التي تعبر عن GCaMP ستة M بالكاد يظهر أي مضان في الحالة غير النشطة عند 27 درجة مئوية. ومع ذلك ، زادت مستويات الكالسيوم داخل الخلايا بسرعة عند 10 درجات مئوية. انخفضت مستويات الكالسيوم بسرعة عندما زادت درجة الحرارة.
أظهر تصوير الكالسيوم للخلايا العصبية في دماغ الذبابة التي تعبر عن GCaMP ستة F في الوقت 0.1 مضان في أربعة من الخلايا العصبية السبعة ، وانخفضت شدة هذه الخلايا العصبية بمرور الوقت. في وجود الثماني ، سطعت الخلايا العصبية المتعددة. زاد تألق 10 خلايا عصبية في وقت واحد عند النقطة الزمنية 92 ، مما يشير إلى أن هذه الخلايا العصبية الفطرية تستجيب لرائحة الأوكتينال.
يمكن ل TACI فصل الخلايا المتداخلة. في صورة الإسقاط القصوى هذه ، تم تحديد خليتين عصبيتين متداخلتين. تم فصل هذه الخلايا العصبية في عرض orthro ، مما يشير إلى أن هذه الخلايا العصبية ظهرت في مواقع Z مختلفة.
أظهرت الخلية البرتقالية أقوى إشارة على Z سبعة بينما كان للخلية الزرقاء أقوى إشارة على Z 10. التغيير في مضان هاتين الخليتين وكشف عن التنشيط المتأخر ولكن القوي للخلية البرتقالية. أثناء الاستخراج ، يتم استخدام الحد الأقصى لقيمة التألق من جميع المواضع Z التي تظهر فيها الخلية العصبية لتمثيل شدة الخلية العصبية عند الترسب المقابل.
في حالة استخدام TACI لتحليل عدد كبير من الخلايا العصبية ، يجب تضمين بعض التسجيل عبر مواضع Z في وظيفة جديدة يتم تطويرها منظمة بمعلومات مضانة. يوفر TACI نهجا حسابيا سهل الاستخدام ومفتوح المصدر لتحليل تصوير الكبسولة 3D للتحقق من حركة الخلية على المحور Z عندما تظهر الخلايا الفردية في مواضع Z متعددة.
