يود المؤلفون أن يشكروا التعاون في علم الوراثة الذرة ، ومشروع جينوم خلايا الذرة ، وديف جاكسون (مختبر كولد سبرينج هاربور ، نيويورك) ، وآن دبليو سيلفستر (المختبر البيولوجي البحري ، جامعة شيكاغو ، إلينوي) ، وأندريا جالافوتي (جامعة روتجرز ، نيوجيرسي) ، وكارولين جي راسموسن (جامعة كاليفورنيا ، ريفرسايد) لتوفير المخزونات الطافرة والمحورة وراثيا ، وكذلك روبرت ف. بيكر وألكسندر جوركيفيتش من مركز المجهر الضوئي المتقدم في جامعة ميسوري كولومبيا لمساعدتهم في الفحص المجهري متحد البؤر. تم دعم JMR من قبل زمالة J. William Fulbright ، وصندوق Diane P. و Robert E. Sharp ، وبرنامج أبحاث الجينوم النباتي التابع لمؤسسة العلوم الوطنية (IOS-1546873) إلى PM. يتم دعم CDTC و CMRV و EDCDP و RJRR من قبل برنامج المنح الدراسية في كلية أتينيو. يتم دعم CDTC و EDCDP و RJRR من خلال منحة DOST-SEI S &T الجامعية. يتم دعم DODL من قبل منحة الأب توماس شتاينبوغلر SJ الأكاديمية. يتم دعم RJRR من قبل Aiducation International - Pathways to Higher Education Scholarship. تم دعم هذا العمل من قبل كلية العلوم والهندسة ومكتبة ريزال ، جامعة أتينيو دي مانيلا.

طرق محسنة لتصوير أوراق الذرة الأولية

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للكشف عنه.

نقدم طريقتين لإعداد بريمورديا أوراق الذرة للتصوير الخلوي. تسمح الطريقة الأولى (قسم البروتوكول 2) بقياس البدائية لتحليل المقطع العرضي ، بينما تتيح الطريقة الثانية (قسم البروتوكول 3) فتح وتسطيح البدائية لتحليل التركيب الكامل. تسهل هذه الطرق التصوير الخلوي ل FPs في أوراق الذرة الأولية24 (كما هو موضح في الشكل 4 والشكل 5) وتوفر حلولا بسيطة لتحديات تصوير أوراق الذرة النامية. يقلل قسم البروتوكول 2 من وقت التشريح ويحسن دقة أخذ العينات عن طريق قياس البدائية قبل التقسيم بدلا من الاعتماد فقط على معلمات التدريج 9,16. مع شريط نانو متاح تجاريا ، يحل قسم البروتوكول 3 المشكلة طويلة الأمد المتمثلة في تصوير البدائية ذات الأوراق الكاملة في الذرة. يحسن هذا البروتوكول الطريقة السابقة ، التي تستخدم أنابيب غسيل الكلى 31 ، وهو بديل أرخص بكثير للتصوير المقطعي المحوسب والتصوير بالرنين المغناطيسي11،32،33. ومع ذلك ، عندما يتعلق الأمر بتصور السمات التشريحية للأوراق وتحقيق أفضل النتائج ، فإن كلا البروتوكولين لهما بعض القيود ، الموضحة في الجدول 2 وتتم مناقشتها بمزيد من التفصيل أدناه.
في قسم البروتوكول 2 ، واجهنا صعوبة في تصور الخطوط العريضة للخلايا في أقسام عرضية سميكة من البدائية للأوراق ، ولم يقدم التلطيخ المضاد بأصباغ الفلورسنت المرتبطة بجدار الخلية أو غشاء البلازما نتائج مرضية. على سبيل المثال ، أنتجت FM 4-64 نتائج دون المستوى الأمثل مقارنة بعلامة FP لغشاء البلازما ، p Zm PIP2-1::ZmPIP2-1:CFP39 (PIP2-1-CFP; الشكل 3 أ - د). للتغلب على هذا القيد ، نوصي باستخدام اهتزاز لإنتاج أقسام أنسجة أرق (~ 0.1 مم)58 والتي ستسمح بتصوير مجال مشرق حيوي لمخططات الخلايا أو تحسين بروتوكول التلوينالمضاد 47,59.
في قسم البروتوكول 3 ، يتمثل القيد الرئيسي في صعوبة تركيب الورقة دون تمزق أو تلف أو فقاعات هواء ، كما هو مفصل في خطوات البروتوكول 3.2.5-3.2.6 (الشكل 3E-K). نظرا لأن ورقة الذرة متناظرة ثنائيا ، فقد يكون حامل نصف ورقة بدلا من حامل ورقة كاملة كافيا للتصور9. للقيام بذلك ، يمكن قطع البدائية بشفرة حلاقة على طول المحور الطولي بعد فكها حتى الوسط ، مما يسمح بتركيب نصف الورقة فقط. هناك قيد آخر لقسم البروتوكول 3 وهو أن سمك الورقة يمكن أن يحد من الدقة البصرية لإشارة الفلوروفور أثناء التصوير العميق. لمعالجة هذه المشكلة ، من الممكن استخدام تقنية إزالة الأنسجة60. ومع ذلك ، وجدنا أن ClearSee61 ، وهو كاشف إزالة شائع الاستخدام لتصوير الأنسجة النباتية ، غير متوافق مع البروتوكول لأنه يتسبب في انفصال العينة والغطاء عن الشريط النانوي. يمكن أن يكون الحل المحتمل لهذه المشكلة هو تطبيق غشاء شبه منفذ31 على عينة الورقة ، مما يسمح بمعالجتها بمحلول المقاصة أثناء تثبيتها في مكانها بواسطة الشريط النانوي. يمكن أيضا استخدام مثل هذه الطريقة التي تسمح بتطبيق المحاليل السائلة على الورقة غير الملفوفة في تقنيات التهجين الكامل للحمض النووي الريبي في الموقع وتقنيات التوطين المناعي ، والتي تم تحسينها سابقا لتطوير نورات الذرة ولكن ليس للأوراق الكاملةالبدائية 62,63.
وصفنا بروتوكولات الذرة ، التي تحتوي على أوراق بريمورديا كبيرة حتى في مرحلة الشتلات. قد تتطلب أنواع الحشائش الأخرى ذات الأوراق الأولية الأصغر بكثير ، مثل الأرز والشعير والقمح و Setaria و Brachypodium16،23،64،65،66 ، استخدام أدوات دقيقة إضافية لتطبيق هذه البروتوكولات بشكل فعال. علاوة على ذلك ، لم تكن هذه البروتوكولات مخصصة لتصوير الخلايا الحية ، والتي تلتقط العمليات الديناميكية في الوقت الفعلي لتكوين الأنسجة والاستجابات الخلوية. ومع ذلك ، مع استمرار تقدم مجسات الفلورسنت وتقنيات التصوير وقدرات الحوسبة في تصوير الخلايا الحية للنباتات67 ، يمكن أن تبني الأبحاث المستقبلية على هذه البروتوكولات لتطوير استراتيجيات تصوير الخلايا الحية المصممة خصيصا للميزات الفريدة لأوراق العشب البدائية.

تعد المحاصيل العشبية مصدرا رئيسيا للغذاء والوقود الحيوي لسكان العالم1 ، وتحسين تشريح الأوراق لديه القدرة على زيادة إنتاجيتها 2,3. ومع ذلك ، فإن فهمنا الحالي لكيفية تنظيم تشريح الأوراق في الأعشاب محدود4 ويتطلب تحليل الأوراق البدائية ، حيث يتم تحديد العديد من السمات التشريحية والفسيولوجية للورقة مسبقا في وقت مبكر من التطور5،6،7. لا غنى عن تقنيات التصوير الخلوي ، مثل التألق والتصوير متحد البؤر ، لدراسة تشريح أوراق العشب والسمات الخلوية ، ولكن من الصعب تطبيق هذه التقنيات على بريمورديا أوراق العشب لأنها مغلفة بعمق وملفوفة داخل دوامة الأوراق. لقد عالجنا هذه المشكلة من خلال تطوير طرق لإعداد المقاطع المستعرضة وحوامل الأوراق الكاملة غير الملفوفة للتألق والتحليل البؤري لأوراق الذرة البدائية ، وهو نظام نموذجي لدراسة تشريح أوراق العشب وتطورها2،8.
تتكون ورقة الذرة ، مثل جميع أوراق العشب ، من شفرة تشبه الشريط مع غمد يلتف حول الساق ويتطور في الساق 9،10،11،12،13. تتطور الأوراق من المرستيم القمي للساق (SAM) في نمط distichous ، حيث تبدأ كل ورقة جديدة في الموضع المعاكس للورقة السابقة ، مما ينتج عنه رتبتان من الأوراق على طول المحور الرأسي (الشكل 1 أ) 14 . يتم تحديد المرحلة التنموية لكل ورقة بريمورديوم من خلال موقعها بالنسبة إلى SAM ، مع تعيين أقرب بريمورديوم على أنه plastochron1 (P1) والبريمورديا التالية المعينة على أنها P2 و P3 وما إلى ذلك (الشكل 1B ، C) 2. أثناء التطور (الشكل 1D) ، تظهر ورقة البدائية أولا كدعامة على شكل هلال حول قاعدة SAM (P1) ، ثم تنمو لتصبح بريمورديوم على شكل غطاء يمتد فوق meristem (P2) 9،10،11. ثم تتوسع الحواف القاعدية للغطاء بشكل جانبي وتتداخل مع بعضها البعض مع نمو الطرف لأعلى ، مكونا بدائيا مخروطي الشكل (P3-P5) 10. ثم ينمو طول البدائية بسرعة ، وتصبح حدود شفرة الغمد في القاعدة أكثر بروزا مع تكوين الرباط ، وهو الإسقاط الشبيه بالهامش على الجانب المحوري للورقة (P6 / P7). أخيرا ، تنفتح الورقة عند خروجها من الزهرة أثناء نمو الحالة المستقرة ، حيث يتم تقييد الخلايا المنقسمة داخل المنطقة القاعدية الصغيرة للشفرة ، وتشكيل تدرج مع خلايا متوسعة ومميزة على طول المحور القريب البعيد (P7 / P8) 15. تحتوي قمة تبادل لشتلة الذرة على العديد من البدائيات في مراحل مختلفة من التطور ، مما يجعلها نموذجا ممتازا لدراسة نمو الأوراق8.
يتطلب التحليل الدقيق لتطور الأوراق المبكر التدريج أو استخدام معايير موحدة لتحديد مراحل متميزة من تطور البدائية فيما يتعلق بالنمو أو المعلمات المورفولوجية الأخرى. نظرا لأن ورقة البدائية مخفية داخل ساق العشب ، يستخدم الباحثون عادة معلمات مثل عمر النبات أو حجم الأوراق الناشئة كتنبؤات لمراحل وأحجام ورقة البدائية 9,16. في الذرة ، يتم تحديد العمر الزمني للنبات إما بعدد الأيام بعد الزراعة أو الإنبات (DAP / DAG)17,18. يتم تحديد المرحلة الخضرية (المرحلة V) من خلال الورقة العلوية ذات الياقة المرئية ، وخط شاحب على الجانب المحوري بين النصل والغمد يتوافق مع موضع الرباط والأذنين ، وزوج من المناطق على شكل إسفين عند قاعدة النصل (الشكل 1 أ ، ب)17,19 . بين 20 و 25 DAG ، ينتقل SAM إلى مرستيم الإزهار ويتوقف عن إنتاج أوراق جديدة20. يمكن أن تختلف معدلات نمو نبات الذرة البدائية اعتمادا على البيئة والنمط الوراثي للنبات. لهذا السبب ، لا يمكن لعمر النبات وحجم الأوراق الناشئة التنبؤ بدقة بأحجام الأوراق البدائية ؛ ومع ذلك ، يمكن أن يساعد استخدام هذه المعلمات في التنبؤ بنطاق مراحل وأحجام Primordia للأغراض التجريبية.
يعد تحليل المقطع المستعرض طريقة شائعة لفحص تشريح الأوراق وتطورها في الذرة والأعشاب الأخرى لأنه يسمح بأخذ عينات من البلاستوكرونات المتعددة في قسم واحد عبر الساق21،22،23. هذه الطريقة ملائمة أيضا للتصوير الخلوي للعينات الطازجة ، حيث تعمل الأوراق المحيطة كسقالة تحافظ على بدائية الأوراق في مكانها أثناء التقسيم والتركيب24. ومع ذلك ، فإن عيب هذه الطريقة هو أنه قد يكون من الصعب تحديد موقع البلاستوكرون المستهدف والمنطقة بدقة داخل البدائية عند التقسيم من لقطة سليمة. علاوة على ذلك ، نظرا لأن نمو الأوراق يختلف عبر البلاستوكرون وعلى طول المحور القريبالبعيد 2,5 ، فقد يؤدي أخذ العينات غير الدقيق إلى تفسير غير صحيح لمرحلة نمو ومنطقة البدائية في قسم معين. لذلك ، فإن تطوير طريقة لأخذ عينات دقيقة من المقطع المستعرض أمر بالغ الأهمية لضمان دقة وتكرار التحليلات التشريحية والتنموية لأوراق العشب البدائية.
يتيح تحليل جبل الورقة الكاملة التحقيق الشامل والتكاملي للأنسجة والعمليات الخلوية التي تحدث على نطاق العضو بالكامل ، مثل النمو التكاثري25 ونمط الوريد26،27،28. توفر الطريقة نظرة عامة على الورقة ، مما يسمح باكتشاف عمليات وأنماط مميزة يصعب اكتشافها باستخدام تحليل المقطع العرضي24،27. على عكس أرابيدوبسيس ، حيث توجد بالفعل طرق راسخة لتصوير حوامل الأوراق الكاملة29,30 ، لا توجد حاليا طريقة قياسية لتصوير حوامل الأوراق الكاملة غير المطوية في الأعشاب. تضمن بروتوكول سابق لفك أوراق الذرة المعزولة مواد غير شائعة ولم يكن مناسبا للتصوير الخلوي31. يمكن لتقنيات التصوير المتقدمة ، مثل التصوير المقطعي المحوسب (CT) والتصوير بالرنين المغناطيسي (MRI) ، الحصول على معلومات تشريحية ثلاثية الأبعاد دون عزل وفتح البدائية11،32،33 ، لكنها باهظة الثمن وتتطلب معدات متخصصة. إن تطوير تقنية للتغلب على القيود التي يفرضها التشكل المدلفن والمخروطي للأوراق البدائية في الذرة والأعشاب الأخرى من شأنه أن يعزز التحقيقات في سماتها التشريحية والتنموية.
هنا ، نقدم طرقا لإعداد المقاطع المستعرضة وحوامل كاملة غير ملفوفة من أوراق الذرة البدائية للتألق والتصوير متحد البؤر. استخدمنا هذه الطرق لتحديد عدد الوريد ورسم خريطة لتوزيع الهرمونات المكانية والزمانية في أوراق الذرة البدائية مع البروتينات الفلورية (FPs)24. تتضمن الطريقة الأولى إزالة الجزء العلوي من الأوراق القديمة من شتلات الذرة باستخدام متجرد سلكي (الشكل 1E). من خلال تعريض طرف البدائية (P5-P7) ، يصبح من الممكن تحديد طوله دون الحاجة إلى إزالة الأوراق المحيطة القديمة تماما ، مما يتيح التقسيم السهل والدقيق. تتضمن الطريقة الثانية فك وتركيب بريمورديا كاملة الأوراق (P3-P7) بشريط نانو شفاف على الوجهين (الشكل 1F). هذه الطرق مناسبة لتصور مختلف FPs24 ولكنها تحتاج إلى تحسين لاستخدام الأصباغ الفلورية وكواشف الإزالة. بالإضافة إلى ذلك ، نوضح بعض الإجراءات لتسطيح مكدسات z ، وخياطة الصور ، ودمج القنوات في ImageJ / FIJI34 ، والتي تنطبق على الصور التي تنتجها الطريقتان. هذه الطرق مفيدة للتألق الروتيني أو التصوير البؤري لأوراق الذرة ، ولكن يمكن أيضا تكييفها مع أنواع العشب النموذجية الأخرى ، مثل الأرز و Setaria و Brachypodium.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65239/65239fig01.jpg"> الشكل 1: تنظيم ومورفولوجيا أوراق الذرة البدائية ونظرة عامة على الطرق . (أ) تمثيل تخطيطي لشتلة الذرة. الذرة لها سلالة ديستيكوس ، حيث تبدأ الورقة الجديدة في الموضع المعاكس للورقة السابقة. يشير رقم الورقة إلى الترتيب الزمني الذي ظهرت به الأوراق من الإنبات (أي الورقة الأولى ، L1 ؛ الورقة الثانية ، L2 ؛ الورقة الثالثة ، L3 ؛ إلخ). تحتوي كل ورقة على شفرة بعيدة وغمد قاعدي محدد بواسطة طوق يتوافق مع الرباط والأذن. تشير الورقة العلوية ذات الياقة المرئية إلى المرحلة الخضرية. الشتلات في هذا المثال في مرحلة V2 ، مع طوق L2 (رأس السهم) مرئية. يشير رمز المقص إلى الموقع في mesocotyl (أنا) حيث يجب قطع الشتلات من أجل جمعها. (ب) تمثيل تخطيطي للساق المقطعة يظهر L1 إلى L4 معزولا، مع عرض الورقة الأولية L5 إلى L9 كصورة مكبرة في (C). يشير رقم البلاستوكرون إلى موضع البدائية بالنسبة إلى SAM ، مع أصغر ورقة بريمورديوم (P1) الأقرب إلى SAM والأوراق الأقدم بريمورديا (P2 ، P3 ، P4 ، وهكذا) على التواليأبعد 2. (د) تمثيل تخطيطي لمورفولوجيا أوراق الذرة الأولية من P1 إلى P5. (ه) نظرة عامة تخطيطية لطريقة تحليل المقطع المستعرض لبدائية أوراق الذرة. (1) تقليم الأوراق القديمة باستخدام متجرد سلكي. (2) قياس البدائية وقسم تبادل لاطلاق النار. (3) قم بتركيب القسم على شريحة للتصوير والمعالجة (4 ، 5). (و) نظرة عامة تخطيطية لطريقة التحليل الكامل لأوراق الذرة البدائية. (1) قم بإزالة الأوراق المحيطة لاستخراج البدائية. (2) قص وفك البدائية المسطحة على شريط النانو. (3) تركيب العينة للتصوير والمعالجة (4 ، 5). الاختصارات: L = ورقة ؛ bl = شفرة ؛ ش = غمد ؛ ثاني أكسيد الكربون = طوق ؛ أنا = ميزوكوتيل. V = نباتي ؛ P = بلاستوكرون ؛ SAM = تبادل لاطلاق النار meristem القمي. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65239/65239fig01large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acrylic Gel Clear Double Sided Nano Tape 16.5 ft x 1.2 in, 2 mm thick</td>
			<td>EZlifego Store (Amazon)</td>
			<td>B07YB1ZXG6</td>
			<td>1 roll</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bellucci Pick Curved micro probe 16.8 cm, 6.6 in</td>
			<td>Bausch &#38; Lomb</td>
			<td>N1692 9</td>
			<td>1 pc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clayman guide microprobe Sinskey hook angled shaft, 11.6 cm, 4.6 in</td>
			<td>Storz Opthalmic Instruments</td>
			<td>E0542</td>
			<td>1 pc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dental Probe, Bent Needle, 14 cm (5.5 in)</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>13553</td>
			<td>1 pc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DOWELL 10-22 AWG Wire Stripper</td>
			<td>Dowell Store (Amazon)</td>
			<td>10-22 AWG</td>
			<td>1 pc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Feather Double Edge Carbon Steel Blades</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>121-9</td>
			<td>pkg/10; for fine sectioning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Frosted End Glass Microscope Slides, 75 mm x 25 mm x 1-1.2 mm</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>260442</td>
			<td>pkg/144</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GEM Single Edge, Stainless Steel Uncoated Blades</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>121-1</td>
			<td>box/200; for general cutting/sectioning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>PI17904</td>
			<td>1 liter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ/FIJI with EDF plugin (version 17.05.2021) and Grid/Collection Stitching plugin</td>
			<td>National Institutes of Health (NIH) USA</td>
			<td>version 2.9.0/1.54s</td>
			<td>The EDF plugin was developed by Alex Prudencio, Jesse Berent, and Daniel Sage for the Biomedical Imaging Group, &#201;cole Polytechnique F&#233;d&#233;rale de Lausanne (EPFL; http://bigwww.epfl.ch/demo/edf/). The grid/collection stitching software was developed by Stephan Preibisch for the Max Planck Institute of Molecular Cell Biology and Genetics (MPI-CBG).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes Ex-L Small 111.76 mm x 213.36 mm</td>
			<td>Kimtech Science</td>
			<td>34155</td>
			<td>box/280 ply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Cover Glasses, 22 mm x 22 mm x 0.13 - 0.16 mm thick</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>260140</td>
			<td>1 ounce</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PU Gel Clear Double Sided Nano Tape 29.5 ft x 1.18 in, 1 mm thick</td>
			<td>Yecaye Store (Amazon)</td>
			<td>L354 W1.18</td>
			<td>2 rolls</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superslip Cover Glasses, 24 mm x 50 mm x 0.13 - 0.16 mm thick</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>260166</td>
			<td>1 ounce</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superslip Cover Glasses, 24 mm x 60 mm x 0.13 - 0.16 mm thick</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>260168</td>
			<td>1 ounce</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tempered Glass Cutting Board</td>
			<td>Hacaroa (Amazon)</td>
			<td>B09XMXBT5S</td>
			<td>4 pc</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

improved methods for preparing transverse sections and unrolled whole mounts of maize leaf primordia for fluorescence and confocal imaging

في الذرة (Zea mays) والأعشاب الأخرى (Poaceae) ، تغلف الأوراق البدائية بعمق وتدحرجت داخل دوامة الأوراق ، مما يجعل من الصعب دراسة نمو الأوراق المبكر. هنا ، نصف طرق تحضير المقاطع المستعرضة وحوامل كاملة غير ملفوفة من أوراق الذرة البدائية للتصوير الفلوري والتصوير متحد البؤر. تستخدم الطريقة الأولى متجردا سلكيا لإزالة الأجزاء العلوية من الأوراق القديمة ، مما يعرض طرف الورقة الأولية ويسمح بقياسها لأخذ عينات أكثر دقة من المقطع العرضي. تستخدم الطريقة الثانية شريطا نانويا واضحا على الوجهين لفتح وتركيب بريمورديا كاملة الأوراق للتصوير. نعرض فائدة الطريقتين في تصور وتحليل مراسلي البروتين الفلوري في الذرة. توفر هذه الطرق حلا للتحديات التي يطرحها التشكل المميز لأوراق الذرة البدائية وستكون مفيدة لتصور وقياس السمات التشريحية والتنموية للأوراق في الذرة وأنواع العشب الأخرى.

Grass crops are a major source of food and biofuel for the global population1, and improving leaf anatomy has the potential to increase their productivity2,3. However, our current understanding of how leaf anatomy is regulated in grasses is limited4 and requires the analysis of leaf primordia, as many anatomical and physiological traits of the leaf are predetermined early in development5,6,7. Cellular imaging techniques, such as fluorescence and confocal imaging, are indispensable for studying grass leaf anatomy and cellular traits, but these techniques are difficult to apply to grass leaf primordia because they are deeply ensheathed and rolled within the leaf whorl. We addressed this issue by developing methods for preparing transverse sections and unrolled whole-leaf mounts for fluorescence and confocal analysis of maize leaf primordia, a model system for studying grass leaf anatomy and development2,8.
The maize leaf, like all grass leaves, consists of a strap-like blade with a sheath that wraps around the stem and developing shoot9,10,11,12,13. The leaves develop from the shoot apical meristem (SAM) in a distichous pattern, where each new leaf initiates in the opposite position of the previous leaf, resulting in two ranks of leaves along the vertical axis&#160;(Figure 1A)14 . The developmental stage of each leaf primordium is identified by its position relative to the SAM, with the closest primordium designated as plastochron1 (P1) and the following primordia designated as P2, P3, and so on (Figure 1B,C)2. During development (Figure 1D), the leaf primordium first appears as a crescent-shaped buttress around the base of the SAM (P1), and then grows into a hood-shaped primordium that extends over the meristem (P2)9,10,11. The basal margins of the hood then expand laterally and overlap each other as the tip grows upward, forming a cone-shaped primordium (P3-P5)10. The primordium then rapidly grows in length, and the sheath-blade boundary at the base becomes more prominent with the formation of the ligule, the fringe-like projection on the adaxial side of the leaf (P6/P7). Finally, the leaf unrolls as it emerges from the whorl during steady-state growth, in which the dividing cells are restricted within the small basal region of the blade, forming a gradient with expanding and differentiating cells along the proximal-distal axis (P7/P8)15. The shoot apex of a maize seedling contains multiple primordia at different stages of development, making it an excellent model for studying leaf development8.
Accurate analysis of early leaf development requires staging or the use of standardized criteria to define distinct stages of primordium development in relation to other growth or morphological parameters. Because the leaf primordia are hidden within the grass shoot, investigators typically use parameters such as the age of the plant or the size of the emerging leaves as predictors for the stages and sizes of the leaf primordia9,16. In maize, the chronological age of the plant is determined either by the number of days after planting or germination (DAP/DAG)17,18. The vegetative stage (V stage) is determined by the uppermost leaf with a visible collar, a pale line on the abaxial side between the blade and the sheath that corresponds to the position of the ligule and auricles, a pair of wedge-shaped regions at the base of the blade&#160;(Figure 1A,B)17,19 . Between 20 and 25 DAG, the SAM transitions into an inflorescence meristem and ceases to produce new leaves20. The growth rates of maize leaf primordia can vary depending on the environment and the genotype of the plant. For this reason, plant age and the size of the emerging leaves cannot accurately predict the sizes of leaf primordia; however, using these parameters can help predict the range of primordia stages and sizes for experimental purposes.
Transverse section analysis is a popular method for examining leaf anatomy and development in maize and other grasses because it allows for the sampling of multiple plastochrons in a single section across the shoot21,22,23. This method is also convenient for cellular imaging of fresh samples, as the surrounding leaves serve as a scaffold&#160;that keeps the leaf primordia in place during sectioning and mounting24. However, a disadvantage of this method is that it can be challenging to precisely locate the target plastochron and region within the primordium when sectioning from an intact shoot. Furthermore, because leaf growth varies across plastochrons and along the proximal-distal axis2,5, imprecise sampling could result in an incorrect interpretation of the developmental stage and region of the primordium in a given section. Therefore, developing a method for precise transverse section sampling is critical for ensuring the accuracy and reproducibility of anatomical and developmental analyses of grass leaf primordia.
Whole-leaf mount analysis enables the comprehensive and integrative investigation of tissue and cellular processes that occur at the whole-organ scale, such as proliferative growth25 and vein patterning26,27,28. The method provides a paradermal overview of the leaf, allowing the discovery of distinct processes and patterns that would otherwise be difficult to detect using transverse section analysis24,27. Unlike in Arabidopsis, where there are already established methods for imaging whole-leaf mounts29,30, there is currently no standard method for imaging unrolled whole-leaf mounts in grasses. A previous protocol for unrolling isolated maize leaf primordia involved uncommon materials and was not suitable for cellular imaging31. Advanced imaging techniques, such as computed tomography (CT) and magnetic resonance imaging (MRI), can acquire 3D anatomical information without isolating and unrolling the primordia11,32,33, but they are expensive and require specialized equipment. Developing a technique to overcome the constraints imposed by the rolled and conical morphology of leaf primordia in maize and other grasses would advance investigations into their anatomical and developmental traits.
Here, we present methods for preparing transverse sections and unrolled whole mounts of maize leaf primordia for fluorescence and confocal imaging. We used these methods to quantify vein number and map the spatial-temporal hormone distribution in maize leaf primordia with fluorescent proteins (FPs)24. The first method involves removing the upper portion of older leaves from maize seedlings with a wire stripper (Figure 1E). By exposing the tip of the primordium (P5-P7), it becomes possible to determine its length without having to completely remove the older surrounding leaves, thus enabling easy and accurate sectioning. The second method involves unrolling and mounting whole-leaf primordia (P3-P7) with clear, double-sided nano tape (Figure 1F). These methods are suitable for visualizing various FPs24&#160;but need optimization for using fluorescent dyes and clearing reagents. In addition, we outline some procedures for flattening z-stacks, stitching images, and merging channels in ImageJ/FIJI34, which apply to the images produced by the two methods. These methods are useful for routine fluorescence or confocal imaging of maize leaves, but they can also be adapted for other model grass species, such as rice, Setaria, and Brachypodium.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65239/65239fig01.jpg" /> 
Figure 1: Organization and morphology of maize leaf primordia and overview of the methods. (A) Schematic representation of a maize seedling. Maize has a distichous phyllotaxy, with the new leaf initiating at the opposite position of the previous leaf. The leaf number indicates the chronological order in which the leaves emerged from germination (i.e., first leaf, L1; second leaf, L2; third leaf, L3; etc.). Each leaf has a distal blade and a basal sheath delineated by a collar that corresponds to the ligule and auricle. The uppermost leaf with the collar visible denotes the vegetative stage. The seedling in this example is at the V2 stage, with the L2 collar (arrowhead) visible. The scissors icon indicates the location at the mesocotyl (me) where the seedling must be cut in order to be collected. (B) Schematic representation of the dissected shoot showing isolated L1 to L4, with the leaf primordia L5 to L9 shown as an enlarged image in (C). The plastochron number indicates the position of the primordium relative to the SAM, with the youngest leaf primordium (P1) closest to the SAM and the older leaf primordia (P2, P3, P4, and so on) successively farther away2. (D) Schematic representation of the morphology of maize leaf primordia from P1 to P5. (E) Schematic overview of the method for transverse section analysis of the maize leaf primordia. (1) Trim the older leaves with a wire stripper. (2) Measure the primordium and section the shoot. (3) Mount the section on a slide for imaging and processing (4, 5). (F) Schematic overview of the method for whole-mount analysis of the maize leaf primordia. (1) Remove the surrounding leaves to extract the primordium. (2) Cut and unroll the primordium flat on the nano tape. (3) Mount the sample for imaging and processing (4, 5). Abbreviations: L = leaf; bl = blade; sh = sheath; co = collar; me = mesocotyl; V = vegetative; P = plastochron; SAM = shoot apical meristem. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65239/65239fig01large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>

تسليط الضوء على المؤلف: طرق محسنة لإعداد المقاطع المستعرضة وحوامل كاملة غير ملفوفة من أوراق الذرة الأولية للتصوير الفلوري والبؤري  

طرق محسنة لإعداد المقاطع المستعرضة وحوامل كاملة غير ملفوفة من أوراق الذرة الأولية للتصوير الفلوري والبؤري

Grasses like maize have leaf primordia grow within the shoot, making them difficult to study. We address this problem with improved protocols for preparing maize leaf transverse sections and whole mounts for fluorescence and confocal imaging. The first protocol uses a wire stripper to cut the older leaves, allowing the measurement of the primordium prior to sectioning.The second protocol uses clear, double-sided nano tape to unroll whole leaf primordium. These protocols improve the accuracy of transverse sectioning and enable unrolling of the leaf primordia, which have been very difficult to achieve due to their rolled, conical morphology. These methods will be useful for visualizing and quantifying leaf anatomical and developmental traits in maize and other grasses.Based on these methods, we plan to develop live cell imaging strategies to address questions in grass leaf development.

تحليل المقطع المستعرض لأوراق الذرة البدائية استخدمنا قسم البروتوكول 2 لتحديد عدد الوريد وتوصيف أنماط الاستجابة الهرمونية في المقاطع المستعرضة لأوراق الذرة الأولية مع FPs (الشكل 4) 24. لتقييم دور هرمون الأوكسين النباتي في نمو الأوراق وتكوين الوريد، حددنا عدد الأوردة في الورقة البدائية لطافرة الذرة التي تعاني من نقص الأوكسين، والتي تتلاشى شرابة254. في البلاستوكرونات المبكرة ، تظهر الأوردة النامية خلوية مميزة في طبقة الخلايا المتوسطة لأوراق الذرة البدائية21,22. ومع ذلك ، فإن تحديد الأوردة وعدها باستخدام التقنيات النسيجية التقليدية22 يمكن أن يكون كثيف العمالة ويستغرق وقتا طويلا. وهكذا، لتحديد كمية الأوردة، استخدمنا علامة بروتين تدفق أوكسين الذرة p Zm PIN1a::ZmPIN1a:YFP41 (PIN1a-YFP فيما بعد)، والتي تشير إلى الأوردة النامية والخيوط الشفافة (PCSs; الشكل 4 أ). باستخدام قسم البروتوكول 2 ، تمكنا من توحيد أخذ عينات المقطع المستعرض عن طريق قياس البدائية قبل التقسيم (الشكل 4B ، C). اكتشفنا اتجاها يحتوي فيه vt2 على بدائية أوسع وأوردة أكثر من المعتاد (الشكل 4D ، E) 24 ، وهو ما يتوافق مع البيانات من الأوراق الموسعة بالكامل55 ، مما يشير إلى أن العيب في vt2 بدأ في وقت مبكر من تطور الأوراق. باستخدام قسم البروتوكول 2 ، تمكنا أيضا من فحص أنماط التعبير عن مراسلي FP للاستجابة الهرمونية بشكل منهجي في ورقة البدائية (انظر أمثلة الصور في الشكل 4F-I). من خلال مخطط موحد لأخذ عينات المقطع المستعرض ، قمنا بتعيين توزيع استجابات الأوكسين والسيتوكينين (CK) وحمض الجبريليك (GA) عبر البلاستوكرونات والمناطق المختلفة من الأوراق البدائية ، واكتشفنا أنماط استجابة جديدة نفترض أن لها آثارا على نمو الأوراق وتكوين الوريد24. لذلك ، توضح هذه النتائج التمثيلية فائدة قسم البروتوكول 2 لتحليل المقطع العرضي لأوراق الذرة البدائية.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65239/65239fig04.jpg"> الشكل 4: النتائج التمثيلية لتحليل المقطع العرضي لأوراق الذرة البدائية. (A-E) القياس الكمي لعدد الوريد وعرض البدائيات في ورقة البدائية للشرابة العادية والمتلاشية2 باستخدام علامة بروتين تدفق الأوكسين PIN1a-YFP. (أ) صور مضان تمثيلية للمقاطع المستعرضة من P5 إلى P7 التي تعبر عن PIN1a-YFP في الأوردة النامية والخيوط المفصلية. تم تصوير المقاطع المستعرضة باستخدام مجهر التألق باستخدام مرشح FITC (إثارة 495-519 نانومتر). تم تحديد عدد الأوردة وعرض البدائية باستخدام أدوات الخط متعدد النقاط والخط الحر في FIJI / ImageJ ، على التوالي. (ب) شتلة ذرة مع إزالة زهور الورقة العلوية بمتجرد سلكي لكشف قمة الورقة الرابعة (L4). يمتد القوس على طول البدائية المتوقع ، مع الخط المتقطع الذي يشير إلى منتصف الطول. (ج) رسم تخطيطي لأشكال البدائية المختلفة من P5 إلى P7 ، يوضح كيف يمكن أن يختلف عدد الوريد وعرض البدائية عند الطول المتوسط (الخط الأفقي المتقطع) اعتمادا على مرحلة تطور البدائية. (د، ه) قياس عرض البدائية (D) ورقم الوريد (E) في قسم منتصف الطول من L4 العادي و vt2. يمثل خط الاتجاه متوسطات التدحرج 10 مم للقياسات ± الخطأ القياسي للمتوسط (SEM). (واو-ط) صور تمثيلية متحدة البؤر لمقاطع عرضية من أوراق البدائية التي تعبر عن مجموعات من PIN1a-YFP ، مراسل استجابة الأوكسين ، DR5-RFP ، مراسل استجابة السيتوكينين ، TCS-Tomato ، علامة استجابة حمض الجبريليك ، GAR2-YFP ، و mDII-Venus ، نسخة متحولة من مراسل إدخال إشارات الأوكسين DII-Venus. يتم تثبيت قنوات FP على قناة المجال الساطع في كل صورة. شريط المقياس = 200 ميكرومتر (أ) ؛ 10 مم (ب) ؛ 100 ميكرومتر (F-I). تم تعديل هذا الرقم واستنساخه بإذن من Robil و McSteen24. الاختصارات: DAG = أيام بعد الإنبات ؛ P = بلاستوكرون ؛ vt2 = شرابة التلاشي 2 ؛ PCS = حبلا بروكاميال ؛ YFP = بروتين الفلورسنت الأصفر ؛ FITC = فلوريسئين إيزوثيوسيانات ؛ RFP = بروتين الفلورسنت الأحمر ؛ PIN1a-YFP = p Zm PIN1a::ZmPIN1a:YFP; DR5-RFP = DR5rev::mRFPer; TCS-الطماطم = TCSv2::NLS-tdالطماطم; GAR2-YFP = p Zm GAR2::ZmGAR2:YFP; mDII-فينوس = pzmUbi:mDII:YFP-NLS. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65239/65239fig04large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
تحليل كامل لأوراق الذرة البدائية اتبعنا قسم البروتوكول 3 لتصور وتحليل تعبير FP في حوامل الأوراق الكاملة لأوراق الذرة البدائية (الشكل 5). من خلال تصور أنماط الوريد باستخدام PIN1a-YFP ، وجدنا أن تكوين الأوردة يحدث في البدائية بأكملها خلال البلاستوكرونات المبكرة ، لكن هذه العملية تصبح مقيدة في المناطق القريبة لاحقا في التطور (الشكل 5 أ)24. استكمالا لتحليلات المقطع العرضي ، كشفت تحليلات جبل الورقة الكاملة عن أنماط خاصة بالأنسجة والمرحلة لاستجابة الهرمونات أثناء تكوين الوريد24. أحد الأمثلة على ذلك هو نمط التعبير لمراسل استجابة CK TCSv2::NLS-tdTomato37 (TCS-Tomato) ، بالنسبة إلى تعبير PIN1a-YFP (الشكل 5B)24. باتباع قسم البروتوكول 3 ، تمكنا من إجراء تحليلات نوعية وكمية لتعبير FP في ورقة البدائية (الشكل 5D-F ؛ بيانات غير منشورة). قمنا بفحص أنماط التعبير لمراسل استجابة الأوكسين ، DR5rev :: mRFPer41 (DR5-RFP) ، وعلامة استجابة GA ، p Zm GAR2::ZmGAR2: YFP39 (GAR2-YFP) ، في حوامل كاملة الأوراق من طفرات مفردة ومزدوجة من vt2 والنبات القزم 3 (d3) ، طافر ناقصGA 56 (الشكل 5D). قارنا أيضا المستويات النسبية لتكاثر الخلايا بين البدائية العادية وأوراق vt2 باستخدام p Zm Cyclin-D2B::ZmCyclin-D2B:YFP42 (Cyclin-D2B-YFP) ، وهي علامة على انتقال G1 / S في دورة الخلية 57 (الشكل 5E ، F). في حين لم يكن هناك فرق كبير بين الطبيعي و vt2 ، كان تعبير Cyclin-D2B-YFP متسقا مع ملف تكاثر الخلايا المعروف للبلاستوكروناتالمبكرة 31. نستنتج أن قسم البروتوكول 3 هو طريقة فعالة لتحليل حوامل كاملة من أوراق الذرة البدائية ، والتي يصعب تصويرها بسبب مورفولوجيتها الملفوفة.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65239/65239fig05.jpg"> الشكل 5: النتائج التمثيلية للتحليل الكامل لأوراق الذرة البدائية. (أ) صور مضان تمثيلية للأوراق البدائية ل 7 شتلة ذرة من DAG تظهر الأوردة النامية والخيوط البروكمبيالية ، كما هو موضح بعلامة بروتين تدفق الأوكسين PIN1a-YFP. تم استئصال P3-P6 primordia من القاعدة ، وفكها ، وتسويتها مع الجانب المحوري لأعلى. تظهر الأجزاء الداخلية لقطات مقربة ل P3 و P4. في P5 و P6 ، تحدد الخطوط المتقطعة النهاية البعيدة للمناطق التكاثرية ، حيث لا تزال غالبية الخيوط الاستباقية تتطور وتمتد. (ب، ج) صور تمثيلية متحدة البؤر تظهر تعبير PIN1a-YFP ومراسل استجابة السيتوكينين ، TCS-Tomato ، في المنطقة الهامشية القريبة من بدائية P5. (د) صور مضان تمثيلية ل P4 primordia تظهر تعبير مراسل استجابة الأوكسين ، DR5-RFP ، وعلامة استجابة حمض الجبريليك ، GAR2-YFP في الطفرات العادية والمفردة والمزدوجة للشرابة المتلاشية 2 والنبات القزم 3. (ه) صور تمثيلية متحدة البؤر ل P3 و / أو P4 تظهر تعبير Cyclin-D2B-YFP ، مراسل انتقال G1 / S في دورة الخلية. (F) الكميات النسبية لتكاثر الخلايا في ورقة P3 / P4 الأولية العادية و vt2 ، محددة كميا عن طريق قياس الكثافة المتكاملة لإشارة Cyclin-D2B-YFP فوق منطقة البدائية باستخدام ImageJ / FIJI. تمثل الأشرطة متوسط القياسات ± الخطأ المعياري للمتوسط. شريط المقياس = 500 ميكرومتر (A ، D ، E) ؛ 200 ميكرومتر (ب) ؛ 100 ميكرومتر (C). تم تعديل الشكل 4A-C واستنساخه بإذن من Robil و McSteen24 ، في حين أن الشكل 4D-F هو بيانات غير منشورة من المؤلفين. الاختصارات: DAG = أيام بعد الإنبات ؛ P = بلاستوكرون ؛ vt2 = شرابة التلاشي 2 ؛ d3 = نبات قزم 3 ؛ YFP = بروتين الفلورسنت الأصفر ؛ RFP = بروتين الفلورسنت الأحمر ؛ PIN1a-YFP = p Zm PIN1a::ZmPIN1a:YFP; TCS-الطماطم = TCSv2::NLS-tdالطماطم; DR5-RFP = DR5rev::mRFPer; GAR2-YFP = p Zm GAR2::ZmGAR2:YFP; سيكلين-D2B-YFP = p Zm سيكلين-D2B::Zmسيكلين-D2B:YFP; ns = لا يوجد فرق كبير ؛ au = وحدة تعسفية. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65239/65239fig05large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
الملف التكميلي 1: أمثلة على مراحل تطور الأوراق في شتلات الذرة. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65239/65239_S_File_1_Leaf_staging_maize_seedling_Fall2019%20(1).xlsx" target="_blank">الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.</a>
الشكل التكميلي S1: العينات النباتية والمواد المستخدمة في البروتوكولات. (أ، ب) شتلة الذرة 7-8 DAG مع إزالة دوامة الورقة العلوية باستخدام متجرد سلكي. (ب) يظهر الجزء الداخلي لقطة مقربة للساق باستخدام بدائية P6 المكشوفة. (ج-ز) براعم شتلات الذرة مع إزالة الزهرات العلوية لتحليل المقطع العرضي (C ، D) وإزالة الأوراق المحيطة بالكامل لتحليل التركيب الكامل (E-G). (H) لفافة من هلام البولي يوريثين شريط نانوي شفاف على الوجهين. (ط، ي) P6 ورقة primordium (I) والمنطقة القريبة من ورقة P8 (J) غير ملفوفة ومثبتة على شرائح زجاجية بشريط نانو. (ك) شريحة زجاجية ذات ورقة بريمورديوم غير ملفوفة مثبتة على مرحلة مجهر فوق التألق. اختصار: DAG = أيام بعد الإنبات. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65239/S_FIGURE_1.pdf" target="_blank">الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Improved Methods for Preparing Transverse Sections and Unrolled Whole Mounts of Maize Leaf Primordia for Fluorescence and Confocal Imaging at JoVE.com

أوراق الذرة البدائية مغلفة بعمق وملفوفة ، مما يجعل من الصعب دراستها. هنا ، نقدم طرقا لإعداد المقاطع المستعرضة وحوامل كاملة غير ملفوفة من أوراق الذرة البدائية للتألق والتصوير متحد البؤر.

In maize (Zea mays) and other grasses (Poaceae), the leaf primordia are deeply ensheathed and rolled within the leaf whorl, making it difficult to study ...

الأعشاب مثل الذرة لها أوراق بريمورديا تنمو داخل الساق ، مما يجعل من الصعب دراستها. نعالج هذه المشكلة ببروتوكولات محسنة لإعداد المقاطع المستعرضة لأوراق الذرة وحوامل كاملة للتصوير الفلوري والتصوير متحد البؤر. يستخدم البروتوكول الأول متجردا سلكيا لقطع الأوراق القديمة ، مما يسمح بقياس البدائية قبل التقسيم.يستخدم البروتوكول الثاني شريطا نانويا واضحا على الوجهين لفتح ورقة بريمورديوم كاملة. تعمل هذه البروتوكولات على تحسين دقة التقسيم العرضي وتمكين فتح الأوراق البدائية ، والتي كان من الصعب جدا تحقيقها بسبب مورفولوجيتها المخروطية المدرفلة. ستكون هذه الطرق مفيدة لتصور وقياس السمات التشريحية والتنموية للأوراق في الذرة والأعشاب الأخرى.بناء على هذه الطرق ، نخطط لتطوير استراتيجيات تصوير الخلايا الحية لمعالجة الأسئلة المتعلقة بتطوير أوراق العشب.

improved-methods-for-preparing-transverse-sections-unrolled-whole

Research

JoVE Journal

Biology

Improved Methods for Preparing Transverse Sections and Unrolled Whole Mounts of Maize Leaf Primordia for Fluorescence and Confocal Imaging

1.9K Views.  Ateneo de Manila University. الأعشاب مثل الذرة لها أوراق بريمورديا تنمو داخل الساق ، مما يجعل من الصعب دراستها. نعالج هذه المشكلة ببروتوكولات محسنة لإعداد المقاطع المستعرضة لأوراق الذرة وحوامل كاملة للتصوير الفلوري والتصوير متحد البؤر. يستخدم البروتوكول الأول متجردا سلكيا لقطع الأوراق القديمة ، مما...

Video: تسليط الضوء على المؤلف: طرق محسنة لإعداد المقاطع المستعرضة وحوامل كاملة غير ملفوفة من أوراق الذرة الأولية للتصوير الفلوري والبؤري  

In maize (Zea mays) and other grasses (Poaceae), the leaf primordia are deeply ensheathed and rolled within the leaf whorl, making it difficult to study early leaf development. Here, we describe methods for preparing transverse sections and unrolled whole mounts of maize leaf primordia for fluorescence and confocal imaging. The first method uses a wire stripper to remove the upper portions of older leaves, exposing the tip of the leaf primordium and allowing its measurement for more accurate transverse section sampling. The second method uses clear, double-sided nano tape to unroll and mount whole-leaf primordia for imaging. We show the utility of the two methods in visualizing and analyzing fluorescent protein reporters in maize. These methods provide a solution to the challenges presented by the distinctive morphology of maize leaf primordia and will be useful for visualizing and quantifying leaf anatomical and developmental traits in maize and other grass species.

Maize leaf primordia are deeply ensheathed and rolled, making them difficult to study. Here, we present methods for preparing transverse sections and unrolled whole mounts of maize leaf primordia for fluorescence and confocal imaging.

﻿Imaging Transverse Sections of Maize Leaf Primordia

Imaging Transverse Sections of Maize Leaf Primordia  

Begin by cutting the desired aged maize seedling at the mesocotyl tissue using a small knife or pair of scissors. Clean the seedling with a paintbrush. Then hold the wire stripper with its jaws facing the chute.Position the chute to the selected hole and squeeze the stripper handles together. Slide the stripper away from the chute to trim the upper portion of the leaves. Use a ruler to measure the length from the primordium's tip to the chute's base.To begin the leaf primordium imaging, hold the chute steady on a smooth surface under a stereo microscope at around 0.8x magnification. Using a razor blade or scalpel, make an initial cut slightly above the target region to discard the distal portion of the chute. Then obtain around 0.25 to 0.8 millimeter thin sections at the desired points along the length of the primordium.Once done, mount the leaf section on a clean glass slide. Apply a few drops of water directly to the section using a pipette. And place a cover slip on top.Apply a few more drops through the edges of the cover slip if needed. Place the slide on the epifluorescence microscope's stage and adjust the settings to visualize the fluorophore. Using this method, chance resection sampling was standardized by measuring the primordia prior to sectioning.A trend was discovered showing that the vanishing tassel two had a wider primordia and more veins than normal, indicating that the defect in the mutant began early in the leaf development. This method also enabled the systematic examination of the expression patterns of hormone response fluorescent protein reporters in the leaf primordia.

تصوير المقاطع المستعرضة لأوراق الذرة الأولية

Imaging Unrolled Whole Mounts of Maize Leaf Primordia

Begin the preparation of the glass slide by cutting a rectangular piece of clear, double-sided nano tape and sticking it to the center of a clean glass slide without removing the protective plastic film on the top side of the tape. Next, dissect the chute by removing the upper portion of the older leaves with a wire stripper. Then hold the chute by the mesocaudal and carefully remove the surrounding leaves with a dental probe to extract the primordia of interest.For mounting the primordium, remove the protective film from the tape. Lay the exposed primordium on the tape. Cut the primordium at the base using a razor blade, discarding the basal stem and the hypocaudal.For smoother unrolling, lubricate the inner, or, adaxial leaf surface by dipping the needle tip into 100%glycerol. Unroll the primordium using a dental probe with a bent needle. Position the needle tip parallel to the surface and unfurl the outer basal margin by gently pressing it against the tape.With the outer margin adhering to the tape, align the needle tip parallel to the long axis of the leaf. Gently slide the needle sideways to unroll and flatten the leaf onto the tape. Apply a drop of water to the unrolled primordium.Immediately place a cover slip on the water drop and the primordium. Gently press down the edges of the cover slip so that they adhere to the tape. Once done, place the slide on the epifluorescence microscope stage to visualize the fluorophore.This method was followed to visualize and analyze the fluorescent protein expression in maize leaf primordia. Complementary to the transverse section analysis. The whole leaf mount analysis revealed tissue and stage-specific patterns of formal response during vein formation.Whole mount analysis method enabled qualitative and quantitative analyses of fluorescent protein expression in the maize leaf primordia, indicating the effectiveness of this method in examining the maize leaf primordia which are difficult to image due to their rolled morphology.