تم دعم هذه الدراسة بمنحة من JSPS KAKENHI (المنحة رقم 23390072 و 19K07335) و AMED (المنحة رقم A-149).

طريقة حقن بطيئة طفيفة التوغل لتقليل إصابة الأنسجة

<ol>
	<li>Chavkin, N. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cell+surface+receptors+Ror1/2+control+cardiac+myofibroblast+differentiation.">The cell surface receptors Ror1/2 control cardiac myofibroblast differentiation.</a> Journal of the American Heart Association. 10 (13), e019904 (2021).</li><li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cell+membrane+repair+protein+MG53+modulates+transcription+factor+NF-&#954;B+signaling+to+control+kidney+fibrosis.">The cell membrane repair protein MG53 modulates transcription factor NF-&#954;B signaling to control kidney fibrosis.</a> Kidney International. 101 (1), 119-130 (2022).</li><li>Liu, X., Liu, Y., Khodeiry, M. M., Lee, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+monocytes+in+optic+nerve+injury.">The role of monocytes in optic nerve injury.</a> Neural Regeneration Research. 18 (8), 1666-1671 (2023).</li><li>Weber, F., Treeck, O., Mester, P., Buechler, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+and+function+of+BMP+and+activin+membrane-bound+inhibitor+(BAMBI)+in+chronic+liver+diseases+and+hepatocellular+carcinoma.">Expression and function of BMP and activin membrane-bound inhibitor (BAMBI) in chronic liver diseases and hepatocellular carcinoma.</a> International Journal of Molecular Sciences. 24 (4), 3473 (2023).</li><li>Tohyama, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+metabolic+flow+enables+large-scale+purification+of+mouse+and+human+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes.">Distinct metabolic flow enables large-scale purification of mouse and human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Cell Stem Cell. 12 (1), 127-137 (2013).</li><li>Hattori, F., Fukuda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+for+replacing+myocytes+with+induced+pluripotent+stem+in+clinical+protocols.">Strategies for replacing myocytes with induced pluripotent stem in clinical protocols.</a> Transplantation Reviews. 26 (3), 223-232 (2012).</li><li>Hattori, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nongenetic+method+for+purifying+stem+cell-derived+cardiomyocytes.">Nongenetic method for purifying stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Nature Methods. 7 (1), 61-66 (2010).</li><li>Fernandes, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+embryonic+stem+cell-derived+cardiomyocytes+engraft+but+do+not+alter+cardiac+remodeling+after+chronic+infarction+in+rats.">Human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes engraft but do not alter cardiac remodeling after chronic infarction in rats.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 49 (6), 941-949 (2010).</li><li>Shiba, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allogeneic+transplantation+of+iPS+cell-derived+cardiomyocytes+regenerates+primate+hearts.">Allogeneic transplantation of iPS cell-derived cardiomyocytes regenerates primate hearts.</a> Nature. 538 (7625), 388-391 (2016).</li><li>Wendel, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+effects+of+a+tissue-engineered+cardiac+patch+from+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+in+a+rat+infarct+model.">Functional effects of a tissue-engineered cardiac patch from human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes in a rat infarct model.</a> Stem Cells Translational Medicine. 4 (11), 1324-1332 (2015).</li><li>Hattori, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Technology+Platforms+for+Heart+Regenerative+Therapy+Using+Pluripotent+Stem+Cells.">Technology Platforms for Heart Regenerative Therapy Using Pluripotent Stem Cells.</a> Stem Cells and Cancer Stem Cells, Volume 7: Therapeutic Applications in Disease and Injury. , 33-45 (2012).</li><li>Tao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ablation+lesion+characterization+in+scarred+substrate+assessed+using+cardiac+magnetic+resonance.">Ablation lesion characterization in scarred substrate assessed using cardiac magnetic resonance.</a> JACC: Clinical Electrophysiology. 5 (1), 91-100 (2019).</li><li>Rutkowski, J. M., Swartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+driving+force+for+change:+interstitial+flow+as+a+morphoregulator.">A driving force for change: interstitial flow as a morphoregulator.</a> Trends in Cell Biology. 17 (1), 44-50 (2007).</li><li>Hattori, F., Fukuda, K., Yuasa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+purify+cardiomyocytes+for+research+and+therapeutic+purposes.">How to purify cardiomyocytes for research and therapeutic purposes.</a> Cardiac Regeneration using Stem Cells. , (2013).</li><li>Li, M., Tian, X., Zhu, N., Schreyer, D. J., Chen, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+process-induced+cell+damage+in+the+biodispensing+process.">Modeling process-induced cell damage in the biodispensing process.</a> Tissue Engineering. Part C, Methods. 16 (3), 533-542 (2010).</li></ol>

ليس لدى المؤلف ما يكشف عنه.

تتمثل إحدى النقاط الحرجة في الأداء الناجح لطريقة الحقن البطيء في إعداد نظام حقن فعال باستخدام مضخة حقنة قوية وأنبوب نقل ضغط قوي. مطلوب نظام ضغط عالي لدفع الجل من طرف إبرة دقيقة. النقطة الحرجة الثانية هي استقرار القلب. يمكن أن يؤدي نبض القلب ضد إبرة الحقن المتقدمة في عضلة القلب إلى إصابة الأنسجة. في هذه الدراسة ، تم إجراء حقن موجه بالصدى لتجنب تعرض الحيوانات لإصابة ثانية في الصدر المفتوح ولإدارة حقن الخلايا في قلب مستقر مع تضخم الرئتين. علاوة على ذلك ، في بعض التطبيقات للحيوانات الكبيرة أو البشر ، يجب اعتبار بعض أجهزة الحقن المتصلة بالقلب جزءا من التصميم الاستراتيجي للتطبيق. لحقن الصدر المفتوح في قلوب الحيوانات الصغيرة ، يوصى باستخدام إبرة طويلة ومرنة نظرا لارتفاع معدل ضربات القلب.
في هذا العمل ، زادت طريقة الحقن البطيئة بشكل كبير من حجم خلايا عضلة القلب الباقية مقارنة بطريقة الحقن العادية. الحقن الطبيعي يسبب تلف الخلايا عن طريق إجهاد القص15. في المقابل ، لا تسبب طريقة الحقن البطيء مثل هذا الإجهاد نظريا لأنها تستخدم محلولا غير نيوتوني بالإضافة إلى الحقن البطيء.
من حيث التليف الموضعي ، أظهر الفضاء الخلالي حول خلايا عضلة القلب الباقية على قيد الحياة التي يتم حقنها بشكل طبيعي ترسبا قويا وواسع النطاق للكولاجين من النوع الأول. في المقابل ، كانت إشارات الكولاجين من النوع الأول حول خلايا عضلة القلب المطعمة باستخدام طريقة الحقن البطيء أضعف بكثير وأكثر محدودية. هذا يشير إلى أن طريقة الحقن البطيئة تسببت في ضرر أقل بكثير. أدى الحقن البطيء لخلايا عضلة القلب الوليدية في عضلة القلب البالغة إلى تحسن كبير في وظيفة انقباض القلب المحتشى. أشارت التحليلات النسيجية إلى أن تطعيم الخلايا العضلية القلبية باستخدام طريقة الحقن البطيء أدى إلى اتصالات مباشرة واقتران وظيفي مع خلايا عضلة القلب المضيفة. تشرح هذه الظاهرة آلية الانتعاش الوظيفي لعضلة القلب المضيفة. على حد علمنا ، هذا هو التقرير الأول لخلايا عضلة القلب لحديثي الولادة المطعمة مع اتصالات سلسة واسعة النطاق بخلايا عضلة القلب البالغة المضيفة. قد تؤدي الوصلات الوظيفية مع عضلة القلب المضيفة عبر الاقتران الكهربائي والميكانيكي إلى نضج خلايا عضلة القلب المطعمة والسماح لها بالعمل كخلايا عضلية وظيفية تساهم في وظيفة القلب المضيف. تعد تفاعلات القوة البدنية طويلة المدى بين المضيف وخلايا عضلة القلب الكسب غير المشروع ضرورية للنضج الكامل. لذلك ، قد تكون هناك حاجة إلى 2 أشهر بعد الحقن لاستعادة وظيفية للقلب احتشاء. قد يكون التعافي المعتمد على الوقت لوظيفة قلب المريض ظاهرة متوقعة في التطبيقات العلاجية ، ويمكن أن يكون هذا سمة مميزة للنجاح في إنشاء اقتران وظيفي جديد والتكامل بين المضيف وخلايا عضلة القلب المطعمة.
يمكن إجراء طريقة الحقن البطيء أثناء جراحة الصدر المفتوح. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن تطبيق هذه الطريقة على الفئران. بالنسبة للتطبيقات المستقبلية في العلاج البشري ، ما زلنا بحاجة إلى حل العديد من المشكلات. يجب تحسين سرعة الحقن من خلال النظر في سعة المخزن المؤقت لتدفق السائل الخلالي في كل عضو مستهدف بشري. يجب استخدام مواد خالية من Xeno ، مثل الجيلاتين البشري أو المواد الاصطناعية القابلة للتحلل. يجب تطوير جهاز الحقن البطيء من الدرجة السريرية GMP ، مثل الأدوات المدمجة التي يمكن التخلص منها الخاصة بالأعضاء أو جهاز قابل لإعادة الاستخدام قابل لإعادة الاستخدام.

تعد إدارة الخلايا واستبدالها استراتيجيات علاجية جديدة واعدة للأعضاء التالفة بشدة. من بين هذه الاستراتيجيات العلاجية الجديدة ، اجتذب الطب التجديدي للقلب اهتماما كبيرا. ومع ذلك ، فإن الالتهاب الناجم عن الإصابات يتوسط في تكوين ندبة في العديد من الأعضاء1،2،3،4. يتكون قلب الإنسان من حوالي 1010 خلايا عضلية قلبية. لذلك ، من الناحية النظرية 5,6 ، يجب أن تعامل مع أكثر من 109 خلايا عضلية القلب. قد يؤدي إعطاء عدد كبير من خلايا عضلة القلب عن طريق طرق الحقن التقليدية إلى إصابات كبيرة في الأنسجة7. توفر هذه الطريقة طريقة جديدة لحقن الخلايا مع الحد الأدنى من غزو الأنسجة.
يتطلب إعطاء الخلايا في حمة العضو حقنة (حقن). ومع ذلك ، يوجد تناقض في أن الحقن نفسه قد يؤدي إلى إصابة الأنسجة. تسبب إصابة الأنسجة التهابا موضعيا وتندبا غير قابل للشفاء في الأعضاء والأنسجة ، فضلا عن ضعف القدرة على التجدد8،9،10. قلب الثدييات لديه ميل كبير للغاية لتطوير الندوب بدلا من التجدد لأنه يتطلب إصلاحا فوريا للإصابة من أجل تحمل ارتفاع ضغط الدم الناجم عن وظيفة الضخ المستمرة11. يستخدم العلاج بالاستئصال هذا الميل العالي نحو تكوين الندبة ويمنع الدائرة التي من المحتمل أن تخضع لتشكيل ندبة باستخدام عدم انتظام ضربات القلب12. في دراسة سابقة ، لوحظ أن النسيج الندبي عزل خلايا عضلة القلب المحقونة في عضلة القلب المضيفة. وبالتالي ، فإن هذا يمثل القضية المستهدفة التالية التي يجب التغلب عليها للحصول على فعالية علاجية محسنة في الطب التجديدي للقلب.
يلعب تدفق السائل الخلالي النسيجي دورا حيويا في نقل الأكسجين والمواد المغذية إلى الخلايا وإزالة الفضلات المفرزة من الخلايا. تختلف السرعة الفسيولوجية لتدفق السائل الخلالي في كل نسيج / عضو (النطاق هو 0.01-10 ميكرومتر / ثانية)13. على حد علم المؤلف ، لا توجد بيانات تتعلق بقدرة الأنسجة / الأعضاء الفردية على دعم كميات إضافية من السوائل دون وذمة مرضية. ومع ذلك ، تحاول هذه التجربة استخدام سرعة حقن بطيئة لتقليل إصابة الأنسجة ، ويمكن استخدام النتائج لتحديد التطبيق العملي لهذا المفهوم.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>18-gauge needle &#38; tuberculin, 1 mL</td>
			<td>Terumo&#160;</td>
			<td>NN1838R, SS-01T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>29-gauge 50 mm-long needle</td>
			<td>Ito Corporation, Tokyo, Japan</td>
			<td>14903 Type-A&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A copper tube</td>
			<td>General Suppliers</td>
			<td></td>
			<td>outer diameter, 1 mm; inner diameter, 0.3 mm; thickness, 0.35 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ads Buffer</td>
			<td>Each ingredient was purchased from Fuji Film Wako Chemical Inc., Miyazaki, Japan</td>
			<td></td>
			<td>Hand made, Composition: 116 mM NaCl, 20 mM HEPES, 12.5 mM NaH2PO4, 5.6 mM glucose, 5.4 mM KCl, 0.8 mM MgSO4, pH 7.35</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>alpha-MEM</td>
			<td>Fuji Film Wako Chemical Inc., Miyazaki, Japan</td>
			<td>051-07615</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-collagen type I rabbit polyclonal antibody (H+L)</td>
			<td>Proteintech</td>
			<td>14695-1-AP</td>
			<td>using dilution 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Connexin-43 rabbit polyclonal antibody (H+L)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C6219</td>
			<td>using dilution 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-rabbit IgG (H+L) donley polyclonal antibody-AlexaFluo488&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A21206</td>
			<td>using dilution 1:300</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>blocking solution (Blocking One)</td>
			<td>Nacalai Tesque, Kyoto, Japan</td>
			<td>03953-95&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>collagenase</td>
			<td>Fuji Film Wako Chemical Inc., Miyazaki, Japan</td>
			<td>034-22363</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>confocal laser microscope</td>
			<td>Carl Zeiss Inc., Oberkochen, Germany</td>
			<td>LSM510 META</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DN25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS Aria III</td>
			<td>Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fetal bovine serum</td>
			<td>BioWest, FL, USA</td>
			<td>S1820-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fine movement device (Micromanipulator)</td>
			<td>Narishige Co., Ltd., Tokyo, Japan</td>
			<td>M-44</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fluorescence microscope</td>
			<td>&#160;Nikon Instruments, Tokyo, Japan</td>
			<td>Eclipse Ti2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gelatin from bovine skin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G9382</td>
			<td>dissolving in PBS (-) to 10%, and autoclaving it</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neonatal Sprague-Dawley (SD) rats</td>
			<td>Japan SLC Inc., Shizuoka, Japan</td>
			<td></td>
			<td>0&#8211;2 d after birth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>non-adhesive 96-well plates (spheloid plate)</td>
			<td>Sumitomo Bakelite, Tokyo, Japan</td>
			<td>MS-0096S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optimal Cutting Temperature (OCT) Compound&#160;</td>
			<td>Sakura Finetek USA, Inc., CA, USA</td>
			<td>Tissue-Tek OCT compound</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>peristaltic pump (for cooling system)</td>
			<td>As One Co., Osaka, Japan</td>
			<td>SMP-23AS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PKH26</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>PKH26GL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stir Bar, Micro, Magnetic, PTFE, Length x Dia. in mm: 5 x 2</td>
			<td>Chemglass life sciences LLC, NJ, USA</td>
			<td>CG-2003-120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>syringe&#160;</td>
			<td>Ito Corporation, Tokyo, Japan</td>
			<td>MS-N25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>syringe pump with remote controller</td>
			<td>As One Co., Osaka, Japan</td>
			<td>MR-1, CT-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tetramethylrhodamine methyl ester</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td>T668</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>trypsin</td>
			<td>DIFCO, Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA</td>
			<td>215240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Fuji Film Wako Chemical Inc., Miyazaki, Japan</td>
			<td>167-11515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>veterinarian ointment</td>
			<td>&#160;Fujita Pharmaceutical Co., Ltd.</td>
			<td>Hibikusu ointment&#160; #WAK-95832</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vevo 2100 Imaging System</td>
			<td>Fujifilm VisualSonics, Inc., Toronto, Canada</td>
			<td>Vevo 2100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vevo 2100 Imaging System software version 1.0.0</td>
			<td>Fujifilm VisualSonics, Inc., Toronto, Canada</td>
			<td>Vevo 2100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weakly curved needle with ophthalmic thread</td>
			<td>Natsume Seisakusho Co., Ltd., Tokyo, Japan</td>
			<td>C7-70</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a novel cell injection method with minimum invasion

حقن الخلايا مباشرة في الأنسجة هو عملية ضرورية في إدارة الخلايا و / أو العلاج البديل. يتطلب حقن الخلية كمية كافية من محلول التعليق للسماح للخلايا بدخول الأنسجة. يؤثر حجم محلول التعليق على الأنسجة ، وهذا يمكن أن يسبب إصابة غازية كبيرة نتيجة لحقن الخلية. تقدم هذه الورقة تقريرا عن طريقة جديدة لحقن الخلايا ، تسمى الحقن البطيء ، والتي تهدف إلى تجنب هذه الإصابة. ومع ذلك ، فإن دفع الخلايا من طرف الإبرة يتطلب سرعة حقن عالية بما فيه الكفاية وفقا لقانون نيوتن لقوة القص. لحل التناقض أعلاه ، تم استخدام سائل غير نيوتوني ، مثل محلول الجيلاتين ، كمحلول تعليق الخلية في هذا العمل. محلول الجيلاتين له حساسية لدرجة الحرارة ، حيث يتغير شكله من هلام إلى سول عند حوالي 20 درجة مئوية. لذلك ، للحفاظ على محلول تعليق الخلية في شكل هلام ، تم تبريد المحقنة في هذا البروتوكول ؛ ومع ذلك ، بمجرد حقن المحلول في الجسم ، حولته درجة حرارة الجسم إلى سول. يمكن أن يمتص تدفق سائل الأنسجة الخلالي المحلول الزائد. في هذا العمل ، سمحت تقنية الحقن البطيء لكرات عضلة القلب بدخول عضلة القلب المضيفة والنقش دون التليف المحيط. استخدمت هذه الدراسة طريقة حقن بطيئة لحقن خلايا عضلة القلب للفئران حديثي الولادة المنقاة والمشكلة على شكل كرة في منطقة نائية من احتشاء عضلة القلب في قلب الفئران البالغة. في 2 أشهر بعد الحقن ، أظهرت قلوب المجموعات المزروعة وظيفة انقباض محسنة بشكل ملحوظ. علاوة على ذلك ، كشفت التحليلات النسيجية للقلوب البطيئة الحقن عن روابط سلسة بين المضيف وخلايا عضلة القلب الطعم عبر أقراص مقحمة تحتوي على وصلات تقاطع الفجوة. يمكن أن تساهم هذه الطريقة في علاجات الخلايا من الجيل التالي ، لا سيما في الطب التجديدي للقلب.

Cell administration and replacement are promising novel therapeutic strategies for heavily damaged organs. Among these novel therapeutic strategies, cardiac regenerative medicine has attracted considerable attention. However, the inflammation caused by injuries mediates scar formation in several organs1,2,3,4. The human heart consists of approximately 1010 cardiomyocytes; therefore, theoretically5,6, it must be treated with more than 109 cardiomyocytes. Administering a large number of cardiomyocytes via traditional injection methods may lead to significant tissue injuries7. This method provides a novel cell injection method with minimal tissue invasion.
Cell administration into the organ parenchyma requires injection(s). However, a discrepancy exists in that the injection itself may lead to tissue injury. Tissue injury causes local inflammation and incurable scarring in organs and tissues, as well as impaired regenerative ability8,9,10. The mammalian heart has an extremely high propensity to develop scars instead of regenerating because it requires immediate injury repair in order to endure the high blood pressure caused by its continuous pumping function11. Ablation therapy utilizes this high propensity toward scar formation and blocks the circuit likely to undergo scar formation using arrhythmia12. In a previous study, it was observed that the scar tissue isolated the injected cardiomyocytes in the host myocardium. Thus, this represents the next target issue that needs to be overcome to obtain improved therapeutic efficacy in cardiac regenerative medicine.
Tissue interstitial fluid flow plays a vital role in conveying oxygen and nutrients to cells and removing the excreted waste from cells. The physiological speed of interstitial fluid flow in each tissue/organ is different (the range is 0.01-10 &#181;m/s)13. To the best of the author&#39;s knowledge, there are no data regarding the capacity of individual tissues/organs to support extra amounts of fluid without pathological edema; however, this experiment attempts to use a slow injection speed to possibly reduce tissue injury, and the results can be used to determine the practicality of this concept.

تسليط الضوء على المؤلف: طريقة حقن خلية جديدة مع الحد الأدنى من الغزو  

طريقة جديدة لحقن الخلايا مع الحد الأدنى من الغزو

In this work, the purpose is to improve the efficacy of regenerative medicines, especially heart regenerative medicine using induced pluripotent stem cells. Heart regenerative medicine is our most contributed research field. My significant findings include a metabolic selection of cardiomyocytes, i.e.a simple and mass purification mass way for cardiomyocytes with cultural condition of withdrawn glucose and added lactate. Another finding includes the efficient engraftment method for cardiomyocytes by publication of cardiomyocyte poles. This transplantation method with cardiomyocyte poles confirmed the enhanced engraftments of cardiomyocyte poles.However, the lack of direct interaction between the host and graft cardiomyocytes was found. This technique offers fewer invasions to the tissues receiving the cell injections. As a result of this, direct interaction between the host and graft cardiomyocytes was facilitated.This technology can diminish injuries, inflammatory responses, and eventually fibrosis, i.e. scar formation. Hopefully, this technology will be applied to the next generation of regenerative medicines, including heart regenerative medicine using pluripotent stem cells.We have already found several ways to bring significant merit to heart regenerative medicine. These studies will be continued in the future.

آثار الحقن البطيء على بقاء الخلايا وترسب الكولاجين تم حقن كرات عضلة القلب للفئران حديثي الولادة الموسومة ب PKH26 في عضلة القلب العادية للفئران العارية باستخدام طريقة الحقن العادية أو البطيئة. أظهرت النتائج أن طريقة الحقن البطيئة زادت بشكل كبير من حجم الخلايا المطعمة (الشكل 3 أ) وخفضت بشكل كبير ترسب الكولاجين من النوع الأول في الموقع (الشكل 3 ب).
آثار الحقن البطيء على فعالية العلاج في نموذج احتشاء الفئران تم استخدام طريقة الحقن البطيء الموجه بتخطيط صدى القلب لحقن كرات خلايا عضلة القلب للفئران حديثي الولادة أو PBS (-) في القلوب المحتشدة للفئران النموذجية. أظهرت المجموعة المحقونة بالخلايا وحدها تحسنا كبيرا في وظيفة تقلص القلب بعد شهرين (الشكل 4 أ). كشفت التحليلات الكيميائية النسيجية المناعية عن وجود اتصال سلس بين الخلايا المطعمة والخلايا العضلية المضيفة عبر أقراص مقحمة تحتوي على تقاطعات فجوة (الشكل 4 ب).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65260/65260fig01.jpg"> الشكل 1: رسم تخطيطي لنظام الحقن بأكمله . (أ) جهاز الحقن الرئيسي. (ب) نظام تبريد المحاقن بالحقن. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65260/65260fig01large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65260/65260fig02.jpg"> الشكل 2: الحقن البطيء عن طريق الجلد الموجه بتخطيط صدى القلب . (أ) إعداد الحيوان ومسبار الصدى وجهاز الحقن. ب: تصوير صدى القلب للمحقنة المحقنة والقلب المحقون. لاحظ أن الصورتين اليسرى واليمنى متماثلتان ، ولكن تمت إضافة خط أصفر للإشارة إلى موضع الإبرة. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65260/65260fig02large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65260/65260fig03.jpg"> الشكل 3: تأثير طريقة الحقن البطيء على حجم الخلية المطعمة وترسب الكولاجين. (أ) حسبت أحجام الخلايا المطعمة (N = 3) من مقاطع تسلسلية. تشير أشرطة الخطأ إلى الانحرافات المعيارية. * P < 0.01 في اختبار t غير المقترن. ب: التلوين المناعي الكيميائي للكولاجين من النوع الأول. يشير شريط المقياس إلى 200 ميكرومتر. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65260/65260fig03large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65260/65260fig04.jpg"> الشكل 4: تحسينات في وظائف القلب والتكامل النسيجي مع كرات الخلايا العضلية القلبية المطعمة بطريقة الحقن البطيء . (أ) طرق عرض تمثيلية لمخطط صدى القلب M. يوضح الرسم البياني انتقال تقصير الكسور في المجموعة المزروعة بالكرة القلبية (خط أحمر متصل; N = 4) ومجموعة السيارة (محلول تعليق الخلية لطريقة الحقن البطيء) (الخط الأزرق المنقط ؛ ن = 3). الاختصارات: MI = احتشاء عضلة القلب. Cx43 = كونيكسين 43 ؛ DAPI = 4 '، 6-دياميدينو -2-فينيليندول ؛ PKH26 = ملصق غشاء الخلية الفلورية الأحمر. تشير أشرطة الخطأ إلى الانحرافات المعيارية. * P < 0.01 في اختبار t المقترن. ب: التحليلات الكيميائية الهيستولوجية المناعية للعلاقة بين كرات الخلايا العضلية القلبية المطعمة والخلايا العضلية القلبية المضيفة. يتم عرض الملاحظات المجهرية الليزرية التقليدية باستخدام عدسة موضوعية 2x في العمود الأيسر. يتم عرض الإصدارات المكبرة (باستخدام عدسة موضوعية 20x) لمنطقتين موضتين في المربع ، معنونة ب * و # ، أدناه. أشرطة المقياس: الصورة العلوية = 300 ميكرومتر ؛ * و # = 30 ميكرومتر. يتم عرض الصور المجهرية بالليزر متحدة البؤر باستخدام عدسة موضوعية 20x جنبا إلى جنب مع comaparison. يتم عرض ثلاثة مواضع. في الصور المدمجة ، تشير رؤوس الأسهم إلى وجود تقاطعات فجوة (Cx43) تربط مباشرة بين الكسب غير المشروع وخلايا عضلة القلب المضيفة. يشير شريط المقياس إلى 30 ميكرومتر. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65260/65260fig04large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
الفيديو التكميلي 1: طريقة الحقن البطيء الموجه بالصدى. يظهر مخطط صدى القلب في الوضع B في المنظر الأمامي طرف إبرة الحقن متقدما في عضلة القلب. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65260/Supplementary%20video.mp4" target="_blank">الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.</a>

Watch this Scientific Journal Video about A Novel Cell Injection Method with Minimum Invasion at JoVE.com

تقضي هذه الطريقة على أي غزو كبير أثناء حقن الخلايا الناجم عن محلول تعليق الخلية.

Directly injecting cells into tissues is a necessary process in cell administration and/or replacement therapy. The cell injection requires a sufficient ...

في هذا العمل ، الغرض هو تحسين فعالية الأدوية التجديدية ، وخاصة الطب التجديدي للقلب باستخدام الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات. الطب التجديدي للقلب هو مجال البحث الأكثر مساهمة لدينا. تشمل النتائج المهمة التي توصلت إليها الاختيار الأيضي لخلايا عضلة القلب ، أيطريقة كتلة تنقية بسيطة وجماعية لخلايا عضلة القلب مع حالة ثقافية من الجلوكوز المسحوب واللاكتات المضافة. ومن النتائج الأخرى التي تم التوصل إليها طريقة التطعيم الفعالة لخلايا عضلة القلب عن طريق نشر أقطاب عضلة القلب. أكدت طريقة الزرع هذه مع أقطاب عضلة القلب التطعيمات المحسنة لأقطاب عضلة القلب.ومع ذلك ، تم العثور على عدم وجود تفاعل مباشر بين المضيف وخلايا عضلة القلب الكسب غير المشروع. تقدم هذه التقنية غزوات أقل للأنسجة التي تتلقى حقن الخلايا. نتيجة لذلك ، تم تسهيل التفاعل المباشر بين المضيف وخلايا عضلة القلب الكسب غير المشروع.يمكن لهذه التقنية أن تقلل من الإصابات والاستجابات الالتهابية والتليف في النهاية ، أي تكوين ندبة. نأمل أن يتم تطبيق هذه التكنولوجيا على الجيل القادم من الأدوية التجديدية ، بما في ذلك الطب التجديدي للقلب باستخدام الخلايا الجذعية متعددة القدرات.لقد وجدنا بالفعل عدة طرق لتحقيق ميزة كبيرة للطب التجديدي للقلب. وستستمر هذه الدراسات في المستقبل.

a-novel-cell-injection-method-with-minimum-invasion

Research

JoVE Journal

Bioengineering

A Novel Cell Injection Method with Minimum Invasion

852 Views.  Kansai Medical University. في هذا العمل ، الغرض هو تحسين فعالية الأدوية التجديدية ، وخاصة الطب التجديدي للقلب باستخدام الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات. الطب التجديدي للقلب هو مجال البحث الأكثر مساهمة لدينا. تشمل النتائج المهمة التي توصلت إليها الاختيار الأيضي لخلايا عضلة القلب ، أيطريق...

Video: تسليط الضوء على المؤلف: طريقة حقن خلية جديدة مع الحد الأدنى من الغزو  

Directly injecting cells into tissues is a necessary process in cell administration and/or replacement therapy. The cell injection requires a sufficient amount of suspension solution to allow the cells to enter the tissue. The volume of the suspension solution affects the tissue, and this can cause major invasive injury as a result of the cell injection. This paper reports on a novel cell injection method, called slow injection, that aims to avoid this injury. However, pushing out the cells from the needle tip requires a sufficiently high injection speed according to Newton's law of shear force. To solve the above contradiction, a non-Newtonian fluid, such as gelatin solution, was used as the cell suspension solution in this work. Gelatins solution have temperature sensitivity, as their form changes from gel to sol at approximately 20 &#176;C. Therefore, to maintain the cell suspension solution in the gel form, the syringe was kept cooled in this protocol; however, once the solution was injected into the body, the body temperature converted it to a sol. The interstitial tissue fluid flow can absorb excess solution. In this work, the slow injection technique allowed cardiomyocyte balls to enter the host myocardium and engraft without surrounding fibrosis. This study employed a slow injection method to inject purified and ball-formed neonatal rat cardiomyocytes into a remote area of myocardial infarction in the adult rat heart. At 2 months following the injection, the hearts of the transplanted groups showed significantly improved contractile function. Furthermore, histological analyses of the slow-injected hearts revealed seamless connections between the host and graft cardiomyocytes via intercalated disks containing gap junction connections. This method could contribute to next-generation cell therapies, particularly in cardiac regenerative medicine.

This method eliminates any major invasion during cell injections caused by the cell suspension solution.

Preparation of the Neonatal Rat Cardiomyocyte Balls for the Slow Injection Method

Begin by measuring the neonatal Rat Ventricular Cardiomyocytes concentration using a hemocytometer. Dilute the cell suspension solution to 3, 000 cells per milliliter, with alpha MEM containing 10%heat inactivated FBS. Distribute 100 microliters of the diluted ventricular cardiomyocyte in each well of the cell's non-adhesive 96 well plates.Centrifuge the cells for five minutes at 100 G.And culture them for two to three days in the cell culture incubator, with 5%carbon dioxide at 37 degrees Celsius. After incubation, aspirate the culture medium from the Rat Cardiomyocyte balls seeded in the non-adhesive 96 well plate. Then, transfer the cardiomyocyte balls from each well to a 15 milliliter tube.Centrifuge the cardiomyocyte balls and aspirate the supernatant. Then, wash them using an ADS buffer. To facilitate the tracking of the cardiomyocyte cells in the Rat after engraftment, stain the cells with PKH26.Before centrifuging the cells, track the development of bidim cardiomyocyte balls by observing them under the microscope regularly after seeding. Begin preparing the main injection apparatus for a neonatal cardiomyocyte ball injection using a 29 gauge, 50 millimeter long needle equipped with a syringe. Connect an 18 gauge one milliliter power transfer syringe needle to a thin polypropylene tube with low lumen expandability.Aspirate the water using a syringe, and remove all the bubbles from the syringe and the connected tubes. Repeat it for another 18 gauge needle. Then, connect the other side of the power transfer tube to the 18 gauge needle of the same one milliliter syringe.Confirm the successful power transition by pushing one syringe plunger down, and another syringe plunger up. Once done, set the syringe in a syringe pump. Next, set up the cooling system by attaching the tightly coiled copper tube to the cell containing part of the cell injection syringe.Leaving 10 millimeter of excess pipe at both ends. Connect the copper tube to the flexible plastic tubing before connecting the other ends of the plastic tubing to an external pump. Fill the line with cooling water, and immerse the excess copper tube into crushed ice to cool the water.This cooling system maintains the cell suspension solution in the cylinder at approximately 2 degrees Celsius.

تحضير كرات عضلة القلب للفئران الوليدية لطريقة الحقن البطيء

Preparation of Cardiomyocytes and Setting-Up the Apparatus for the Slow Injection Method

Prepare the 10%gelatin stock solution by weighing and dissolving the gelatin in the ADS buffer, and autoclaving the solution. Rewarm the 10%gelatin stock at 37 degrees Celsius, until it becomes liquid. Then dilute the gelatin stock, using a prewarmed ADS buffer, to obtain the final injectable 5%gelatin solution.Suspend 96 cardiomyocyte balls in 100 microliters of prewarmed injection solution. Load the cardiomyocyte ball suspension into the cell injection syringe without aspirating the excess air. Next, hold the syringe vertically, with the needle facing upward, and tap the syringe to collect the bubbles at the upper ridge of the syringe.Also, observe the cardiomyocyte balls gradually settling onto the rubber seal of the plunger. Maintain the vertical position of the syringe, and slowly push the plunger to discard the bubbles and excess cell suspension solution, until 20 microliters of the cell suspension remain in the syringe, and the cardiomyocyte ball remains resting on the rubber seal of the plunger. Once done, immerse the capped syringe in an ice bath for five minutes, and fix the injection syringe apparatus on the animal stage before activating the main syringe pump during percutaneous cell transplantation in an anesthetized rat.