يود المؤلفون أن يشكروا ArrayJet على مشورة الخبراء فيما يتعلق بروبوتات microarray . تود SS و JS الاعتراف بالدعم المقدم من الصندوق الأساسي 2022 (FF65 / 004) ، جامعة شيانغ ماي.

توضيح بنية الجليكان وحدوثه باستخدام تنميط بوليمر ميكروأري

يعلن أصحاب البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح.

تقنية MAPP الموصوفة هنا هي الآن طريقة راسخة لتحليل الجليكان. تم وصف المبادئ الأساسية لأول مرة في 200711 ، لكن التقنية خضعت للتطوير المستمر من أجل الاستفادة من أحدث الابتكارات في تقنية microarray ، وتطوير المسبار الجزيئي ، والتقدم في فهمنا للكيمياء الحيوية للجليكان. بشكل عام ، يعد تحليل الجليكان ، وخاصة السكريات ، أكثر صعوبة من البروتينات والنيوكليوتيدات بسبب تعقيدها الهيكلي وعدم تجانسها45 ، فضلا عن حقيقة أنه لا يمكن تسلسلها أو تصنيعها بسهولة1. في كثير من الحالات ، لا يمكن لتقنية واحدة فك تشفير تعقيد الجليكان بشكل قاطع. وبالتالي ، غالبا ما يتم استخدام MAPP مع طرق أخرى. هذا هو أحد أسباب اختيار إعداد AIR عادة كنقطة انطلاق ل MAPP ، نظرا لأن AIR متوافق مع معظم طرق تحليل glycan الأخرى34 ، مما يسهل المقارنة اللاحقة لمجموعات البيانات.
بسبب تجانس العينة قبل إعداد AIR ، يتم فقدان بعض المعلومات المكانية دائما. ومع ذلك ، نظرا لأن السكريات يتم إطلاقها بالتتابع من العينات ، فإن وجود الحواتم في الكسور التي تم الحصول عليها يوفر معلومات حول البنية الجزيئية وتكوين تلك العينة17. وبالتالي ، فإن اختيار نظام استخراج مناسب أمر بالغ الأهمية لنجاح الطريقة. تحدد المعلمات المتعددة مدى ملاءمة طريقة الاستخراج: التركيب الخلوي ، والوقت ، ودرجة الحرارة ، ودرجة الحموضة ، والضغط ، والقوة الأيونية للمذيب ، ودقة عينة الجسيمات الصلبة49. يوصى باستخدام مجموعة من المذيبات الأكثر عدوانية بشكل متزايد لزيادة احتمالية استخراج الجليكان المكون بنجاح وبناء صورة تركيبية تمثيلية للعينة. بالنسبة لمعظم العينات ، تكون CDTA و NaOH و cellulase كافية لإزالة التخزين المشتق من النبات والسكريات ذات الجدار الخلوي33،50،51،52. بالنسبة لبعض عينات الأنسجة ، ثبت أن نظام الاستخراج الهجين الذي يتضمن أيضا CaCl2 و HCl و Na2CO3 ناجح53 ، بينما قد تتطلب عينات الطحالب الدقيقة البحرية إضافة حمض الإيثيلين ديامينيترايتيك (EDTA) 10.
يجب أن تتضمن المصفوفات الدقيقة مجموعة من معايير الجليكان النقية والمحددة لاستخدامها كعناصر تحكم إيجابية5. يجب تعديل المعايير المدرجة وفقا لطبيعة العينة. بمجرد طباعتها ، يجب اختيار GRMPs المناسبة. إن توليد الورم الهجين mAbs إلى هياكل السكاريد يمثل تحديا54. يصعب رفع الأجسام المضادة المرتبطة بالجليكان ويمكن أن يكون لها تقارب منخفض55. لحسن الحظ ، يمكن الحصول على معلومات تسلسل الجينات ل CBMs بسهولة نسبية للتعبير المؤتلف4 وهندسة خصائص ارتباطها56,57. في حين تم تطوير كتالوج مثير للإعجاب من GRMPs ، مع توفر معظمها الآن من مصادر تجارية ، بالنسبة لتنوع هياكل الجليكان الموجودة في الطبيعة ، تم إنتاج نسبة صغيرة فقط وتميزها بنجاح58. هذا يمكن أن يحد من القدرة على اكتشاف والتمييز بين هياكل معينة. ينصح بإجراء تجربة فحص أولية باستخدام واحد أو اثنين من المجسات الممثلة لكل بنية جليكان رئيسية من المتوقع أن تكون موجودة ، والتي تتميز خصوصية الارتباط بها بشكل جيد. في تجارب التحقيق اللاحقة ، يمكن توسيع قائمة المسبار لتغطية مجموعة أوسع من الجليكان والتعمق في الهياكل الدقيقة.
على الرغم من كونها عادية ، إلا أن ضمان غسل المصفوفات الدقيقة جيدا بعد كل خطوة حضانة أمر أساسي لنجاح إجراء الفحص. من المحتمل أن تؤدي الإزالة غير الفعالة للمجسات غير المرتبطة على وجه التحديد إلى حجب النتيجة عن طريق التسبب في إشارة خلفية عالية بعد تطور اللون. في هذه الحالة ، من الضروري تكرار إجراء الفحص ، بدءا من مصفوفة دقيقة جديدة. علاوة على ذلك ، يجب لمس المصفوفات باعتدال وفقط عن طريق إمساك الحواف بالملقط ؛ غشاء النيتروسليلوز هش ويتلف بسهولة. يتجمع حل تطوير الألوان في الشقوق والتجاعيد ، مما يتسبب في التشبع الزائد ، مما يعيق تحليل المصفوفة.
MAPP سريع وقابل للتكيف ومريح. تتوافق هذه الطريقة مع الجليكان الحيواني أو الميكروبي أو النباتي المشتق من أي نظام بيولوجي أو صناعي ، طالما يمكن استخراجها وشل حركتها على النيتروسليلوز ، والتي يمتلك المرء مجسات جزيئية مناسبة لها. توفر البيانات التي تم إنشاؤها رؤية تفصيلية وشبه كمية وتركيبية ، والتي لا يمكن الحصول عليها بسهولة عبر طرق تحليل الجليكان الأخرى.

الجليكان منتشر في كل مكان في جميع مجالات الحياة ويظهر تنوعا لا مثيل له في البنية والوظيفة مقارنة بالجزيئات الكبيرة الأخرى1. ومع ذلك ، نظرا لتعقيدها ، والتباين في التخليق الحيوي والروابط الجليكوسيدية ، وندرة الطرق المناسبة لتشريح هياكل الجليكان ، فإن فهمنا لهذا التنوع في الهياكل والوظائف محدود نسبيا2.
العديد من تقنيات تحليل الجليكان مدمرة وتتطلب تكسير الجليكان إلى السكريات الأحادية المكونة لها ، والتي يمكن أن تحجب السياقات ثلاثية الأبعاد والبيولوجية ذات الصلة3. على العكس من ذلك ، فإن الأجسام المضادة وحيدة النسيلة (mAbs) ، ووحدات ربط الكربوهيدرات (CBMs) ، والمحاضرات ، والغلوتينين الفيروسي ، والالتصاقات الميكروبية ، والمعروفة مجتمعة باسم المجسات الجزيئية التي تتعرف على الجليكان (GRMPs)4 ، تتعرف على حوامل محددة وترتبط بها ويمكن استخدامها كأدوات للكشف والتمييز بين الجليكان داخل مصفوفات معقدة متعددة الجليكان 5,6.
هنا ، نقدم تنميط بوليمر microarray (MAPP) ، وهي طريقة سريعة ومتعددة الاستخدامات وغير مدمرة لتحليل الجليكان والتي تنطبق على مجموعة واسعة من العينات البيولوجية. تهدف الطريقة إلى توفير تقنية قوية وعالية الإنتاجية لتحليل الجليكان من أنظمة بيولوجية وصناعية / تجارية متنوعة. يوحد MAPP خصوصية التعرف على المجسات الجزيئية الموجهة بالجليكان مع تقنية فحص microarray القابلة للتكرار وعالية الأداء للسماح بآلاف التفاعلات الجزيئية بالتوازي. ناتج هذا النهج هو نظرة تشخيصية حول التركيب والوفرة النسبية للجليكان داخل عينة أو نسيج مهم.
يمكن استخدام MAPP كطريقة مستقلة قائمة بذاتها ، أو بالاقتران مع تقنيات كيميائية حيوية أخرى ، مثل الفحص المجهري المناعي7،8،9 والسكريات الأحادية أو تحليل الارتباط10،11. يمكن أيضا استخدام هذه التقنية لرسم خريطة لخصائص الخاتمة ل GRMPs الجديدة ، باستخدام المصفوفات المطبوعة بمعايير قليلة السكاريد النقية والمحددة جيدامن الناحية الهيكلية 12. الميزة الرئيسية ل MAPP على الطرق الأخرى ، مثل مقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA) ، هي توافقها مع أحجام العينات الصغيرة13,14. علاوة على ذلك ، يقدم MAPP تحليلا عالي الإنتاجية15 ويوفر شكلا فعالا لحفظ العينات ، حيث تكون العينات المطبوعة جافة ومستقرة عند تجميدها على النيتروسليلوز16.
يعتمد ربط GRMPs بشكل عام على وجود عدد من بقايا السكر المتجاورة التي تشكل مجتمعة موقع ربط (حاتم) فريد لفئة معينة من عديد السكاريد (زيلان ، مانان ، زيلوجلوكان ، إلخ.) 17. في المقابل ، يمكن أن تكون بقايا السكر الفردية (الزيلوز ، المانوز ، الجلوكوز) التي يتم قياسها كميا باستخدام معظم التقنيات الكيميائية الحيوية ، على سبيل المثال تكوين السكريات الأحادية أو تحليل المثيلة ، مكونات لفئات متعددة من السكريات وبالتالي يصعب تعيينها18.
تم تطوير MAPP استجابة لفجوة تقنية ، وهي القدرة على التحليل السريع لجليكان متعدد من مجموعة متنوعة من المصادر باستخدام كميات صغيرة من المواد. تستفيد MAPP من الذخيرة الواسعة من GRMPs التي تم تطويرها وتميزها على مدى العقود الثلاثة الماضية12،19،20،21،22،23،24،25،26،27،28،29،30،31،32. كان تطوير MAPP عملية تكرارية ، حيث يتم تحسين التقنية وتحسينها بشكل مطرد. يوجد الآن مجموعة كبيرة من الأدبيات التي تصف تطبيق MAPP على مختلف الأنظمة الطبيعية والصناعية حيث تلعب الجليكان أدوارا مركزية 5،6،9،10،21،33،34،35،36،37،38،39. هنا ، نصف الحالة الراهنة لفن MAPP.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,3:1,4-&#946;-D-Glucan, Lichenan (icelandic moss)</td>
			<td>Megazyme</td>
			<td>P-LICHN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,4-&#946;-D-Mannan</td>
			<td>Megazyme</td>
			<td>P-MANCB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384-well microtiter plate</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>M1686</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate (BCIP)</td>
			<td>Melford</td>
			<td>B74100-1.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>270725</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alkaline Phosphatase AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>115-055-003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alkaline Phosphatase AffiniPure Goat Anti-Rat IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>112-055-003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alkaline Phosphatase AffiniPure Rabbit Anti-His Tag</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>300-055-240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arabinoxylan (wheat)</td>
			<td>Megazyme</td>
			<td>P-WAXYL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Array-Pro Analyzer Software</td>
			<td>Media Cybernetics</td>
			<td>Version 6.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacillus sp. Cellulase 5A (BCel5A)</td>
			<td>NZYTech</td>
			<td>CZ0564</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BAM antibodies</td>
			<td>SeaProbes</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Black drawing ink (indian ink)</td>
			<td>Winsor &#38; Newton</td>
			<td>GWD030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbohydrate binding modules</td>
			<td>NZYTech</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCRC antibodies</td>
			<td>CarboSource</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>319945</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>PHR1552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>1.11727</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Galactan (potato)</td>
			<td>Megazyme</td>
			<td>P-GALPOT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Galactomannan (carob)</td>
			<td>Megazyme</td>
			<td>P-GALML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>49781-5L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gum tragacanth (legumes)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G1128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>INCh antibodies</td>
			<td>INRA</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LM and JIM antibodies</td>
			<td>PlantProbes</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Marathon Argus Microarray Printer</td>
			<td>ArrayJet</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>34860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal antibodies</td>
			<td>Biosupplies Australia</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaBH4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>452882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitro-blue tetrazolium (NBT)</td>
			<td>Melford</td>
			<td>N66000-1.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrocellulose membrane</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>88018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pectin (degree of methyl esterification 46%)</td>
			<td>Danisco</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProClin 200</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>48171-U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhamnogalacturonan (soybean pectic fibre)</td>
			<td>Megazyme</td>
			<td>P-RHAGN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotating mixer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>88-861-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotating/rocking Shaker</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Skimmed milk powder</td>
			<td>Marvel</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spin filter</td>
			<td>Costar Spin-X</td>
			<td>8160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel beads</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>69989</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TissueLyser II</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>85300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>93362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8787-250ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9416-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylan (beechwood)</td>
			<td>Megazyme</td>
			<td>P-XYLNBE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xyloglucan (tamarind)</td>
			<td>Megazyme</td>
			<td>P-XYGLN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-Glucan (oat)</td>
			<td>Megazyme</td>
			<td>P-BGOM</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microarray polymer profiling (mapp) for high-throughput glycan analysis

التنميط البوليمر Microarray (MAPP) هو نهج قوي وقابل للتكرار لتحديد التركيب والوفرة النسبية للجليكان والجليكوكونتيورات بشكل منهجي ضمن مجموعة متنوعة من العينات البيولوجية ، بما في ذلك الأنسجة النباتية والطحالب والمواد الغذائية والعينات البشرية والحيوانية والميكروبية. تدعم تقنية Microarray فعالية هذه الطريقة من خلال توفير منصة فحص مصغرة وعالية الإنتاجية ، مما يسمح بآلاف التفاعلات بين الجليكان والمجسات الجزيئية الموجهة للجليكان المحددة للغاية ليتم توصيفها بشكل متزامن ، باستخدام كميات صغيرة فقط من التحليلات. يتم تجزئة الجليكان المكون كيميائيا وإنزيميا ، قبل استخلاصه بالتتابع من العينة وتجميده مباشرة على أغشية النيتروسليلوز. يتم تحديد تركيبة الجليكان من خلال ربط مجسات جزيئية محددة تتعرف على الجليكان بالجزيئات المبتزة والمطبوعة. MAPP مكمل لتقنيات تحليل الجليكان التقليدية ، مثل السكاريد الأحادي وتحليل الارتباط وقياس الطيف الكتلي. ومع ذلك ، توفر المجسات الجزيئية التي تتعرف على الجليكان نظرة ثاقبة للتكوينات الهيكلية للجليكان ، والتي يمكن أن تساعد في توضيح التفاعلات البيولوجية والأدوار الوظيفية.

Glycans are ubiquitous in all domains of life and exhibit unparalleled diversity in structure and function compared to other macromolecules1. However, due to their complexity, variability in biosynthesis and glycosidic linkages, and the paucity of appropriate methods for dissecting glycan structures, our understanding of this diversity in structures and functions is relatively limited2.
Many glycan analysis techniques are destructive and necessitate the breakdown of glycans into their constituent monosaccharides, which can obscure relevant three-dimensional and biological contexts3. Conversely, monoclonal antibodies (mAbs), carbohydrate binding modules (CBMs), lectins, viral agglutinins, and microbial adhesins, known collectively as glycan-recognizing molecular probes (GRMPs)4, recognize and bind to specific epitopes and can be used as tools to detect and discriminate between glycans within complex multi-glycan matrices5,6.
Here, we present microarray polymer profiling (MAPP), a rapid, versatile, and nondestructive method for glycan analysis that is applicable to a broad spectrum of biological samples. The method aims to provide a robust and high-throughput technology for analyzing glycans from diverse biological and industrial/commercial systems. MAPP unites the recognition specificity of glycan-directed molecular probes with reproducible, high-performance microarray screening technology to allow thousands of molecular interactions to be profiled in parallel. The output of this approach is diagnostic insight into the composition and relative abundance of glycans within a sample or tissue of interest.
MAPP can be used as an independent, stand-alone method, or in conjunction with other biochemical techniques, such as immunofluorescence microscopy7,8,9 and monosaccharide or linkage analysis10,11. The technique can also be used to map epitope specificities of novel GRMPs, using arrays printed with pure and structurally well-defined oligosaccharide standards12. A major advantage of MAPP over other methods, such as enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), is its compatibility with small sample volumes13,14. Moreover, MAPP offers significantly higher-throughput analysis15 and provides an effective form of sample preservation, as printed samples are dry and stable when immobilized onto nitrocellulose16.
The binding of GRMPs is generally dependent on the presence of a number of contiguous sugar residues that collectively form a binding site (epitope) that is unique to a particular polysaccharide class (xylan, mannan, xyloglucan, etc.)17. In contrast, the individual sugar residues (xylose, mannose, glucose) that are quantified using most biochemical techniques, for example monosaccharide composition or methylation analysis, can be components of multiple polysaccharide classes and thus difficult to assign18.
MAPP has been developed in response to a technology gap, namely the ability to rapidly analyze multiple glycans from a variety of sources using small amounts of material. MAPP capitalizes on the extensive repertoire of GRMPs that have been developed and characterized over the last three decades12,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32. The development of MAPP has been an iterative process, with the technique being steadily refined and optimized. There is now a substantial body of literature describing the application of MAPP to various natural and industrial systems where glycans play central roles 5,6,9,10,21,33,34,35,36,37,38,39. Here, we describe the current state of the art for MAPP.

تسليط الضوء على المؤلف: بروتوكول MAPP - تطوير تحليل الجليكان 

التنميط الدقيق للبوليمر (MAPP) لتحليل الجليكان عالي الإنتاجية

Our research focuses on the occurrence functions and structures of complex glycans within diverse domestic, industrial, and commercial systems. Further refinements to non-contact microarray technology and our ability to rapidly access sequence information for carbohydrate binding modules is increasing our capacity to both print and interrogate glycan microarrays. Glycans are challenging to study due to their structural heterogeneity, complexity, and variability in biosynthesis.Many glycan analysis methods necessitate the breakdown of glycans into their constituent monosaccharides. MAPP offers a versatile glycan analysis platform which retains a lot of the important structural 3D information.

تم تطبيق MAPP لتحديد تكوين الجليكان لنفايات الكتلة الحيوية الزراعية ، والتي تضم قشور المانجو من العديد من الأصناف التايلاندية الشمالية ، ولب الكرز Coffea arabica ونفايات معالجة حبوب البن ، وأنسجة الجذر والساق والأوراق من الثوم الأسود التايلاندي ، Allium sativum var. ophioscorodon. تستخدم العديد من السكريات المشتقة من النباتات في صناعة المواد الغذائية كمكونات وظيفية42,43. وبالتالي ، كان الهدف من هذه التجربة هو استنتاج ما إذا كانت مواد النفايات الزراعية الصناعية الوفيرة وغير المستغلة حاليا قد توفر مصدرا للسكريات النقية ذات القيمة المضافة.
يتم استخدام مادة AIR بشكل روتيني لإعداد العينات المخصصة لتحليل الجليكان44. هناك العديد من المزايا لاستخدام AIR. تعمل المعالجة بالمذيبات على إزالة CAZymes الداخلية والمستقلبات والسكريات الصغيرة والدهون والأصباغ بشكل فعال ، مما ينتج عنه عينات غنية بالسكريات والبروتينات الهيكلية34. علاوة على ذلك ، يعد إنتاج AIR طريقة سريعة وفعالة لزيادة طول عمر العينة ، حيث إنه قابل للحرارة ويمكن تخزينه لعدة سنوات.
تم استخراج ثلاثة أجزاء مختلطة من الجليكان المكون بالتتابع من مادة AIR النباتية باستخدام CDTA و NaOH والسليولاز. مخلب CDTA أيونات الكالسيوم2+ ، والتي تسمح بإزالة البكتين المتشابك Ca2+ من جدران الخلايا النباتية45. تسمح الظروف القلوية بإطلاق الهيميسيلولوز في الغالب ، مثل المنان والزيلان و β جلوكان ، بسبب اضطراب الترابط الهيدروجيني وتصبن روابط الإستر بين الألياف الدقيقة السليلوز والهيميسيلولوز ، واللجنين والهيميسيلولوز ، على التوالي46. تم استخدام endo-1،4-β-glucanase المؤتلف من Bacillus spp. لتحلل المناطق غير المتبلورة من الألياف الدقيقة السليلوز الهيكلية ، وإطلاق الجليكان المتبقي المرتبط بالسليلوز داخل جدران الخلايا47. على الرغم من أن هذه الطريقة تفصل الجليكان بشكل فعال إلى هذه المجموعات الثلاث الواسعة ، تجدر الإشارة إلى أن العينات ليست نقية. بحكم طبيعة طريقة الاستخراج ، فإن الهيميسيلولوز ، إذا كان موجودا في العينة ، سيتم استخراجه حتما واكتشافه لاحقا بدرجات متفاوتة في كسور CDTA والسليولاز. وبالمثل ، سيتم اكتشاف بعض البكتين في استخراج NaOH إذا كان موجودا في العينة.
تم استخدام روبوت طباعة ميكروأري غير متصل وكهرضغطية لشل حركة أجزاء الجليكان المستخرجة على النيتروسليلوز عبر المرفق غير التساهمي11 ، لتشكيل 300 مصفوفة دقيقة متطابقة. كما تم تضمين معايير الجليكان المحددة (الجدول 1) في المصفوفات الدقيقة المطبوعة كعناصر تحكم موجبة (الشكل 5). يتوافق ملف تعريف ربط MAPP الذي تم الحصول عليه لمعايير الجليكان المحددة مع خصوصيات الخاتمة التي تم الإبلاغ عنها مسبقا. على سبيل المثال ، أظهر LM21 ارتباطا قويا بمتعددات السكاريد متعددة (galactomannan و glucomannan) ، بينما أظهر LM22 ارتباطا ضعيفا فقط بالجالاكتومانان25. وبالمثل ، فإن LM19 مرتبط بشكل تفضيلي ب homogalacturonan48 منزوع الأسترة و LM15 مرتبط ببذور التمر الهندي xyloglucan23.
تم الكشف عن الوفرة النسبية ل 16 حاتمة ، تشخيص عديد السكاريد ذات جدار الخلية النباتية غير السليلوزية ، من خلال ارتباط الأجسام المضادة وحيدة النسيلة الموجهة بالجليكان (الجدول 2) بالمستخلصات المطبوعة (الشكل 6). تم الكشف عن غالبية الجليكان المستخرج ضمن جزء NaOH القلوي. تم تسجيل إشارات ربط قوية ل mAbs LM10 و LM11 ، تمثل زيلان / أرابينوكسيلان ، داخل قشور جميع أصناف المانجو التي تم اختبارها. ضمن عينات الثوم ، يرتبط LM10 و LM11 بشكل تفضيلي بمستخلص أنسجة الجذر (Garlic R) ويظهران ارتباطا ضعيفا فقط بمستخلص أنسجة الأوراق (Garlic L). LM19 ، الذي يمثل جزئيا ميثيل أسترة أو غير أسترة homogalacturonan ، مرتبط بقوة ببعض مستخلصات أصناف المانجو (Aokrong و Talabnak) ، ولكنه مرتبط بشكل ضعيف فقط ، أو كان ارتباطه غير قابل للكشف ، في أصناف أخرى (Chokanan ، Mamkamdang ، Mahachanok ، و Nga). بالإضافة إلى ذلك ، يرتبط LM19 فقط بكسور لب البن ولا يرتبط بمواد نفايات معالجة حبوب البن ، التي كان يعتقد سابقا أنها تتكون من بكتين البن شبه المنقى (بيانات غير منشورة).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65443/65443fig01.jpg"> الشكل 1: الخطوات التجريبية الرئيسية في طريقة MAPP. (أ) تجانس العينات لتكوين مساحيق دقيقة. (ب) تعالج العينات المتجانسة لعزل AIRs الخاصة بها. (ج) يتم استخلاص الجليكان المكون بالتتابع باستخدام نظام استخلاص مخصص. (د) تنقل كسور الجليكان المستخرجة والحبر وGSB إلى 384 صفيحة بئر، وفقا لتخطيط اللوحة، لطباعتها على النيتروسليلوز. (ه) يتم فحص المصفوفات الدقيقة المطبوعة باستخدام GRMPs مختارة. (F) يتم تحديد ارتباط GRMP بكسور الجليكان المطبوعة وتحليلها قبل تقديم البيانات كخريطة حرارية. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65443/65443fig01large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65443/65443fig02.jpg"> الشكل 2: مثال على تخطيط لوحة 384 بئرا لتحميل العينة والحبر و GSB مع أربعة تخفيفات لكل عينة / معيار جليكان مستخرج. تشير الألوان المختلفة إلى العينات الناشئة عن كواشف الاستخراج المختلفة ، بينما تمثل الظلال المختلفة التخفيفات التسلسلية. يمثل الرقم الأول في الكود رقم العينة ، بينما يمثل رقم النهاية رقم التخفيف (يشير D1 إلى التخفيف واحد ، ويشير D2 إلى التخفيف اثنين ، وهكذا). على سبيل المثال ، يمثل المسمى جيدا "12D3" عينة الجليكان 12 ، والتخفيف ثلاثة. يجب تقسيم لوحات البئر إلى ثمانية أقسام متطابقة تتكون من ستة أعمدة وثمانية صفوف. يجب أن يحتوي القسم الأول من اللوحة الأولى على الحبر والمخزن المؤقت فقط ويشبه تخطيط اللوحة المثالي. يمكن بعد ذلك تحميل عينات الجليكان المستخرجة في أقسام اللوحة اللاحقة وفقا لتخطيط اللوحة. لا ينبغي تحميل كواشف الاستخراج المختلفة في نفس قسم اللوحة. إذا لم تكن هناك عينات كافية لملء قسم كامل ، فقم بملء جميع الآبار المتبقية في هذا القسم بمخزن مؤقت ؛ لا تترك أي آبار فارغة. إذا كانت هناك حاجة إلى لوحات متعددة ، فيجب أن يحتوي القسم التالي بعد تحميل جميع العينات على ثلاثة أعمدة متناوبة من الحبر و GSB - قد لا يكون هذا هو القسم الثامن ، اعتمادا على عدد العينات التي تتم طباعتها. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65443/65443fig02large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65443/65443fig03.jpg"> الشكل 3: تمثيل تخطيطي لتصميم المصفوفات الدقيقة المطبوعة. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65443/65443fig03large.jpg" target="_blank">الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65443/65443fig04.jpg"> الشكل 4: المصفوفات الدقيقة التمثيلية. (أ) غير ملزم. ( ب) إشارة الربط محجوبة بإشارة خلفية عالية. (ج) تلطيخ أزرق / أرجواني معمم بسبب التشبع الزائد مع NBT / BCIP. د: الفحص المعيب بسبب ارتفاع تركيز الركيزة. ( ه) الطباعة المعيبة بسبب رأس الطباعة غير النظيف. (و) ملزمة قوية لعدد قليل من العينات. (ز) ملزمة قوية للعديد من العينات. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65443/65443fig04large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65443/65443fig05.jpg"> الشكل 5: ارتباط الأجسام المضادة وحيدة النسيلة بمعايير الجليكان المحددة ، مضمن للتحقق من صحة عملية الطباعة والفحص. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65443/65443fig05large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65443/65443fig06.jpg"> الشكل 6: MAPP من الجليكان المستخرج من نفايات الكتلة الحيوية الزراعية. تشمل العينات نفايات لب البن (لب البن وبكتين البن) ، وقشور المانجو من عدة أصناف تايلاندية (AO ، Aokrong. كو ، كام ؛ RD ، راد ؛ CH ، تشوكانان. ماجستير ، مامكامدانغ ؛ TL ، تالابناك ؛ MH ، ماهاتشانوك ؛ NG ، Nga) وأوراق الثوم الأسود (الثوم L) ، الساق (الثوم S) ، البصلة (الثوم BG) ، والجذور (الثوم R) ، باستخدام CDTA ، هيدروكسيد الصوديوم ، والسليولاز (Bacillus spp. cellulase 5A). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65443/65443fig06large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
الجدول 1: معايير عديد السكاريد التجارية المحددة المستخدمة في تحليل MAPP كضوابط إيجابية. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65443/65443_Table%201.xlsx" target="_blank">الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.</a>
الجدول 2: الأجسام المضادة وحيدة النسيلة الموجهة للجليكان المختارة لاستجواب المصفوفات الدقيقة للجليكان النباتية المستخرجة. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65443/65443_Table%202.xlsx" target="_blank">الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.</a>

Watch this Scientific Journal Video about MAPP Protocol – Advancing Glycan Analysis at JoVE.com

التنميط الدقيق للبوليمر (MAPP) هو تقنية عالية الإنتاجية للتحليل التركيبي للجليكان في العينات البيولوجية.

Microarray polymer profiling (MAPP) is a robust and reproducible approach to systematically determine the composition and relative abundance of glycans ...

يركز بحثنا على وظائف حدوث وهياكل الجليكان المعقدة داخل الأنظمة المنزلية والصناعية والتجارية المتنوعة. إن التحسينات الإضافية لتقنية microarray غير المتصلة وقدرتنا على الوصول السريع إلى معلومات التسلسل لوحدات ربط الكربوهيدرات تزيد من قدرتنا على طباعة واستجواب المصفوفات الدقيقة من الجليكان. من الصعب دراسة الجليكان بسبب عدم تجانسها الهيكلي وتعقيدها وتنوعها في التخليق الحيوي.تتطلب العديد من طرق تحليل الجليكان تكسير الجليكان إلى السكريات الأحادية المكونة لها. يقدم MAPP منصة تحليل جليكان متعددة الاستخدامات والتي تحتفظ بالكثير من معلومات 3D الهيكلية الهامة.

microarray-polymer-profiling-mapp-for-high-throughput-glycan-analysis

Research

JoVE Journal

Biology

Microarray Polymer Profiling (MAPP) for High-Throughput Glycan Analysis

1.0K Views.  Newcastle University. يركز بحثنا على وظائف حدوث وهياكل الجليكان المعقدة داخل الأنظمة المنزلية والصناعية والتجارية المتنوعة. إن التحسينات الإضافية لتقنية microarray غير المتصلة وقدرتنا على الوصول السريع إلى معلومات التسلسل لوحدات ربط الكربوهيدرات تزيد من قدرتنا على طباعة واستجواب المصفوفات الدقي...

Video: تسليط الضوء على المؤلف: بروتوكول MAPP - تطوير تحليل الجليكان 

Microarray polymer profiling (MAPP) is a robust and reproducible approach to systematically determine the composition and relative abundance of glycans and glycoconjugates within a variety of biological samples, including plant and algal tissues, food materials, and human, animal, and microbial samples. Microarray technology underpins the efficacy of this method by providing a miniaturized, high-throughput screening platform, allowing thousands of interactions between glycans and highly specific glycan-directed molecular probes to be characterized concomitantly, using only small amounts of analytes. Constituent glycans are chemically and enzymatically fractionated, before being sequentially extracted from the sample and directly immobilized onto nitrocellulose membranes. The glycan composition is determined by the attachment of specific glycan-recognizing molecular probes to the extorted and printed molecules. MAPP is complementary to conventional glycan analysis techniques, such as monosaccharide and linkage analysis and mass spectrometry. However, glycan-recognizing molecular probes provide insight into the structural configurations of glycans, which can aid in elucidating biological interactions and functional roles.

Microarray polymer profiling (MAPP) is a high-throughput technique for compositional analysis of glycans in biological samples.

Extraction of Glycan from Alcohol Insoluble Residue

To begin, use a mechanical TissueLyser to shake previously prepared AIR CDTA mixture at 27 hertz for two minutes, followed by 10 hertz for two hours. Next, centrifuge the mixture at 10, 000 G for 10 minutes at four degree Celsius. Transfer the supernatant to a sterile micro centrifuge tube.Finally, add sodium hydroxide and sodium borohydride mixture to the residual pellet. After shaking and centrifuging the pellet, wash the residual pellet two to three times with distilled water. Add 30 microliters per milligram of cellulase to the pellet, then incubate the tubes in a heat block at the enzyme's optimal temperature for 16 hours.Centrifuge the samples and store the supernatant on a rotary shaker. Centrifuge all stored extracts again at 10, 000 G for 10 minutes at four degrees Celsius.

استخراج الجليكان من بقايا الكحول غير القابلة للذوبان

Microarray Printing for Glycan Analysis

Begin by preparing a 1 to 20 dilution of black Indian ink and glycerol system buffer, then centrifuge for 10 minutes at 15, 000g at room temperature. Add 40 microliters of ink solution and glycerol system buffer to the first section of the 384 well plate. Now add 25 microliters of glycerol system buffer to all dilution one wells and 40 microliters to all dilution two, three, and four wells.Add 25 microliters of extracted glycan sample to the dilution one wells to dilute the samples in a one-to-one ratio. Serially dilute each sample four times by transferring 10 microliters from the dilution one to the dilution two well, then gently mix using a pipette. Repeat the process by transferring 10 microliters of the sample from the dilution two to the dilution three well.After repeating the process for the dilution four well, discard 10 microliters from it so that all wells have a final volume of 40 microliters. Add 40 microliters of ink solution and glycerol system buffer to the final plate. Then cover the plate with an adhesive cover before centrifuging it for 10 minutes at 3000g at room temperature.To print the samples on the nitrocellulose membrane, start by purging the print head and capillaries multiple times with glycerol system buffer. Initiate a test print run by loading a plate with the buffer alone. To configure the instrument to print directly from the clean buffer reservoir, click on File, followed by New, then choose Print Run.Choose the microplate type and change the slide settings accordingly. Next, change the mini array settings before editing the spot property settings. Click on the Overview tab to view the plate.Finally, under the Options tab, select Using buffer and calculate printing time before allocating file locations to save the file. After saving the location, press on Start Print Run to proceed with the run. While printing extracted glycan samples, program the system as before.Under the Options tab, click on Using source microplates. Finally, save the unique grid file generated for the printed microarray for downstream analysis. Defined glycan standards were also included in the printed microarrays as positive controls.The map binding profile obtained for the selected glycan standards corresponds to previously reported epitope specificities.

طباعة ميكروأري لتحليل الجليكان

Microarray Probing for Glycan Recognition

Begin by cutting out identical printed microarrays from the nitrocellulose membrane and placing them in a suitable vessel for probing. To reduce non-specific binding, add MP-TBST blocking buffer to the microarrays and incubate for one hour on a rotating shaker. After incubation, replace the buffer with fresh MP-TBST.Incubate the arrays with monoclonal antibodies and MP-TBST for two hours on a rotating shaker. After incubation, remove the molecular probe solution. Submerge the arrays fully in clean TBST.Immediately replace the buffer with a fresh volume to remove the residual probe solution. Place the arrays on a rotating shaker for five minutes. Replace the TBST with a fresh buffer volume and place the arrays on the shaker for another five minutes.Next, incubate the arrays with alkaline phosphatase conjugated antibodies for two hours on a rotating shaker. Once incubation is complete and the microarrays have been washed, cover them in nitro blue tetrazolium, and BCIP color development solution to chromogenically detect the antibody binding. Terminate the reaction by immersing the array in clean tap water.Then place the arrays to dry between blotting paper overnight at ambient temperature. The relative abundance of 16 epitopes diagnostic of non-cellulosic plant cell wall polysaccharides were detected by attaching glycan-directed monoclonal antibodies to printed extracts. Most of the extracted glycans were detected within the alkaline sodium hydroxide fraction.Strong binding signals were recorded for LM-10 and LM-11 representing xylan and arabinoxylan within the peels of all the mango varieties tested. LM-10 and LM-11 displayed preferential binding to the garlic root tissue extract, and weak binding to the leaf tissue extract. LM-19 representing partially methylesterified or unesterified homogalacturonan bound strongly to some mango variety extracts and only to the coffee pulp fractions.