تم تمويل هذا العمل من قبل المجلس الوطني للتنمية العلمية والتكنولوجية (CNPq ، البرازيل) [أرقام المنح 428048 / 2018-8 و 402556 / 2022-4] وجامعة برازيليا (البرازيل). يشكر المؤلف الدكتور دوارتي نونو كارفالهو والدكتورة إيفلين سانتوس (i3s ، بورتو ، البرتغال) على توفير الوصول إلى هواتفهم الذكية المستخدمة في هذا البحث.

1. إعداد كاشف فحص بروتين برادفورد
<ol><li>قم بإذابة 100 مجم من Coomassie Brilliant Blue G في 50 مل 95٪ (وزن / حجم) من الإيثانول. اخلطي حتى يذوب كوماسي بريليانت بلو جي تماما. تنبيه: الإيثانول قابل للاشتعال ويسبب تهيج العين. تجنب اللهب واستخدم النظارات الواقية.</li>
	<li>إلى المحلول السابق ، أضف 100 مل من 85٪ (وزن / حجم) حمض الفوسفوريك بعناية. تنبيه: حمض الفوسفوريك يسبب تآكل المعادن ويسبب تآكل الجلد وتلف العين الخطير والسمية الفموية الحادة. ارتداء القفازات والنظارات الواقية.</li>
	<li>أضف المحلول الذي يحتوي على Coomassie Brilliant Blue G والإيثانول وحمض الفوسفوريك ببطء إلى 600 مل من الماء منزوع الأيونات.</li>
	<li>خفف المحلول إلى حجم نهائي قدره 1000 مل. قم بالتوسع لأعلى أو لأسفل وفقا لعدد العينات المراد تحليلها. كما هو موضح في الطريقة الأصلية7 ، يجب أن تكون التركيزات النهائية في كاشف برادفورد العامل 0.01٪ (وزن / حجم) Coomassie Brilliant Blue G ، 4.7٪ (وزن / حجم) إيثانول ، و 8.5٪ (وزن / حجم) حمض الفوسفوريك.</li>
	<li>قم بإزالة أي ترشيح للمواد غير القابلة للذوبان من خلال ورق الترشيح (ورق Whatman # 1 أو ما يعادله).</li>
	<li>الكاشف مستقر لعدة أسابيع عند تخزينه في درجة حرارة الغرفة (RT) ومحمي من الضوء. قم بالتصفية حسب الضرورة لأن الرواسب قد تتشكل بمرور الوقت. ملاحظة: بدلا من ذلك ، تتوفر كواشف برادفورد الجاهزة للتخفيف والاستخدام تجاريا. اتبع تعليمات الشركة المصنعة لإعداد الكاشف وانتقل إلى الخطوة التالية.</li>
</ol>2. إعداد حلول البروتين القياسية
<ol><li>قم بإعداد محلول مخزون (راجع الخطوة 2.4) من بروتين معزول لاستخدامه كمعيار. بروتين ميسور التكلفة وشائع الاستخدام هو ألبومين مصل الأبقار (BSA). الخيارات الأخرى هي البولينالين البيضاوي وجلوبيولين جاما البقري.</li>
	<li>إذا كانت الامتصاصية المولية للبروتين المستخدم كمعيار معروفة ، فتحقق من تركيز محلول المخزون في مقياس الطيف.</li>
	<li>بالنسبة ل BSA ، الصيغة شائعة الاستخدام هي BSA (mg / mL) = (A280 / 6.6) × 10 ، حيث A280 هو الامتصاص عند 280 نانومتر بطول مسار 1 سم مقروء مقابل فراغ مناسب (أيε 2801٪ = 6.6)7. على سبيل المثال ، 0.8 مجم / مل BSA لديه امتصاص 0.528 عند 280 نانومتر.</li>
	<li>لتوليد المنحنى القياسي ، قم بإعداد العديد من التخفيفات من BSA في حدود 0.025 مجم / مل و 1.0 مجم / مل. سيؤدي ذلك إلى 0.25-10 ميكروغرام من BSA لكل بئر بعد إضافة حجم عينة يبلغ 10 ميكرولتر لكل بئر. ملاحظة: يجب تحضير المحاليل القياسية للبروتين في وسط بنفس التركيب (التركيز النهائي) للوسط المستخدم في تحضير العينات.</li>
</ol>3. الفحص
<ol><li>قم بتخفيف العينات لتحقيق تركيز البروتين ضمن نطاق المنحنى القياسي من 0.025-1.0 مجم / مل. لديك العديد من التخفيفات (3 على الأقل) عينة داخل النطاق. ملاحظة: يمكن تخفيف العينات باستخدام محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) أو أي تركيبة وسيطة / عازلة أخرى متوافقة مع كاشف برادفورد. يجب ألا يختلف التركيز النهائي للمكونات المتوسطة بين المعيار والعينات.</li>
	<li>أضف 10 ميكرولتر من كل محلول قياسي للبروتين إلى ثلاثة آبار (أي في ثلاث نسخ) من صفيحة دقيقة 96 بئرا. بالنسبة لنقطة البروتين 0 (صفر) ، أضف 10 ميكرولتر من المخزن المؤقت / الوسيط المستخدم لإعداد المحاليل القياسية وتخفيفات العينة.</li>
	<li>إلى مجموعة أخرى من الآبار ، أضف 10 ميكرولتر من كل تخفيف عينة إلى ثلاثة آبار (أي في ثلاث نسخ) من نفس الصفيحة الدقيقة المكونة من 96 بئرا. تتمثل إحدى الطرق في إضافة أحجام مختلفة من العينة وإكمالها بوسط يصل إلى 10 ميكرولتر لكل بئر (على سبيل المثال ، 0.5 ميكرولتر ، 1 ميكرولتر ، 2 ميكرولتر ، 4 ميكرولتر ، و 8 ميكرولتر من العينة بالإضافة إلى 9.5 ميكرولتر و 9 ميكرولتر و 8 ميكرولتر و 6 ميكرولتر و 2 ميكرولتر من الوسط).</li>
	<li>أضف 250 ميكرولتر من كاشف فحص بروتين برادفورد إلى جميع الآبار. يظهر إعداد صفيحة مجهرية نموذجي في الشكل 2. في هذا المثال ، تم تضمين مجموعة من الآبار الفارغة التي تحتوي على 260 ميكرولتر (الحجم النهائي لكل بئر) من الماء لتكون فارغة في قارئ الصفائح الدقيقة (الخطوة 4.5). هذا مطلوب فقط إذا تم جمع بيانات الامتصاص أيضا. ملاحظة: قم بإعداد منحنى قياسي في نفس الصفيحة الدقيقة للعينات في كل مرة يتم فيها إجراء الفحص. بمعنى آخر ، إذا كان عدد العينات يتطلب لوحة أخرى ، فقم بإعداد منحنى قياسي آخر في اللوحة الثانية ، وهكذا.</li>
	<li>سجل النتائج (القسم 4) في غضون 5-15 دقيقة.</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65547/65547fig02v2.jpg"> الشكل 2: تخطيط لوحة نموذجي لمقايسة بروتين برادفورد. يشير الفراغ إلى ثلاثة آبار تحتوي على 260 ميكرولتر من الماء لاستخدامها فارغة في قارئ الصفائح الدقيقة. الأمراض المنقولة جنسيا يشير إلى معايير البروتين. S1-S6 هي ست عينات مختلفة. SX_1-SX_4 أربعة تخفيفات مختلفة للعينة لكل عينة. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65547/65547fig02large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
4. تسجيل النتائج
<ol><li>في غرفة مضاءة جيدا ، أمسك الصفيحة الدقيقة الموازية للمقعد على خلفية بيضاء موحدة (على سبيل المثال ، ورقة ورقية) بيد واحدة. تأكد من المحاذاة الدقيقة عن طريق وضع مستوى الفقاعة على اللوحة.</li>
	<li>من ناحية أخرى ، أمسك الهاتف الذكي بالتوازي (تشير بعض تطبيقات الكاميرا بشكل مفيد إلى ميل الجهاز) إلى المقعد والصفيحة الدقيقة والتقط صورة واحدة أو عدة صور للصفيحة الدقيقة بأكملها (الشكل 3). في أجهزة iOS ، قم بتشغيل مؤشر مستوى الكاميرا في إعدادات الكاميرا عن طريق تمكين خيار الشبكة. في أجهزة Android ، قم بتشغيل مؤشر مستوى الكاميرا في إعدادات الكاميرا من خلال تمكين تلميحات الإطار.</li>
	<li>لا يلزم وجود جهاز إضاءة خاص ، ولكن احرص على تجنب الظلال والانعكاسات. على سبيل المثال ، تجنب تظليل اللوحة أو الخلفية بالهاتف الذكي وتجنب تظليل الخلفية باستخدام الصفيحة الدقيقة. الانعكاسات الصغيرة في حواف منطقة البئر ليست مشكلة ؛ يمكن استخراج بيانات اللون من منطقة صغيرة جدا في وسط كل بئر.</li>
	<li>تحقق لفترة وجيزة من الصورة لمعرفة تناسق الخلفية والظلال والانعكاسات. أيضا ، ألق نظرة على زاوية الآبار ؛ يجب أن يكون مركز كل بئر مرئيا مباشرة (أي ليس خلف جدران البئر).</li>
	<li>إذا كانت المقارنة بين قراءات امتصاص الصفيحة الدقيقة وبيانات لون الصورة مطلوبة ، فاقرأ الصفيحة الدقيقة عند 590 نانومتر و 450 نانومتر في قارئ الصفيحة الدقيقة21.</li>
</ol><img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65547/65547fig03v2.jpg"> الشكل 3: التقاط نتائج فحص بروتين برادفورد. في غرفة مضاءة جيدا ، يتم وضع الصفيحة الدقيقة بالتوازي مع المقعد على خلفية موحدة بيد واحدة. من ناحية أخرى ، يتم تثبيت الهاتف الذكي بالتوازي مع المقعد والصفيحة الدقيقة. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65547/65547fig03large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
5. استخراج بيانات اللون تلقائيا
<ol><li>قم بتنزيل ImageJ و ReadPlate22 ، يتوفر مكون إضافي ImageJ في https://imagej.nih.gov/ij/plugins/readplate/index.html (هذا ملف .txt).</li>
	<li>افتح ImageJ ، وانقر فوق المكونات الإضافية > التثبيت وحدد الملف الذي تم تنزيله في الخطوة 6.1.</li>
	<li>اضبط معلمات القياس بالنقر فوق تحليل > تعيين القياسات وتحقق من الخيارات التالية: منطقة؛ الانحراف المعياري الحد الأدنى والحد الأقصى للقيمة الرمادية ؛ يعني القيمة الرمادية ؛ قيمة رمادية مشروطة. في أسفل النافذة، اضبط إعادة التوجيه إلى: بلا والمنازل العشرية (0-9): 3.</li>
	<li>انتقل إلى ملف > فتح وحدد صورة الصفيحة الدقيقة التي تم التقاطها في الخطوة 4.</li>
	<li>انتقل إلى المكونات الإضافية > ReadPlate. اقرأ الإرشادات ثم انقر فوق موافق.</li>
	<li>حدد عدد الآبار: 96.</li>
	<li>باستخدام أداة التحديد المستطيل التي يتم تحميلها تلقائيا بواسطة المكون الإضافي ، قم بعمل مستطيل يبدأ في وسط البئر A1 وينتهي في وسط البئر H12. ثم انقر فوق موافق.</li>
	<li>حدد القناة الزرقاء وانقر فوق موافق.</li>
	<li>قم بتأكيد المعلمات الافتراضية بالنقر فوق موافق.</li>
	<li>تحقق مما إذا كان البرنامج قد حدد منطقة داخل كل بئر وما إذا كانت المناطق المحددة لا تغطي مناطق ذات ظلال أو انعكاس غير طبيعي. انقر فوق موافق.</li>
	<li>احفظ النتائج وكرر الخطوات من 5.8 إلى 5.10 للقناة الخضراء.</li>
	<li>احسب نسبة الأزرق إلى الأخضر باستخدام الوضع لكل لون. ملاحظة: يمكن إجراء الحساب يدويا أو باستخدام برنامج تفضيلات القارئ ، مثل R أو Microsoft Excel أو GraphPad Prism.</li>
</ol>6. استخراج بيانات اللون يدويا
<ol><li>قم بتنزيل Inkscape ، محرر رسومات مجاني ومفتوح المصدر. ملاحظة: يمكن استخدام أي برنامج مزود بأداة منتقي الألوان (عادة ما يتم تصويره على أنه قطارة عين) لتحديد اللون واستخراج بيانات RGB.</li>
	<li>افتح Inkscape ، انتقل إلى ملف > فتح. حدد صورة الصفيحة الدقيقة التي تم التقاطها في الخطوة 4.</li>
	<li>اختر أداة تحديد وتحويل الكائنات (S) ، والتي يتم تصويرها كسهم في أعلى الجانب الأيسر ، وانقر فوق الصورة. سيشير حد الخط المتقطع إلى التحديد.</li>
	<li>حدد أداة انتقاء الألوان من الصورة (D)، والتي يتم تصويرها على هيئة شافطة عين على الجانب الأيسر.</li>
	<li>انقر في وسط البئر. سيتغير اللون الموجود على اللوحة السفلية ("تعبئة:") وفقا لذلك. انقر فوق اللون وستظهر علامة التبويب Fill and Stroke على الجانب الأيمن.</li>
	<li>قم بتغيير القائمة المنسدلة Flat Color إلى RGB. سجل القيم المعروضة للقنوات الزرقاء والخضراء لكل بئر.</li>
	<li>احسب نسبة الأزرق إلى الأخضر باستخدام القيم المسجلة. ملاحظة: يمكن إجراء الحساب يدويا أو باستخدام برنامج تفضيلات القارئ ، مثل R أو Microsoft Excel أو GraphPad Prism.</li>
</ol>7. بناء منحنيات قياسية واستقراء المجهول
<ol><li>ارسم متوسط نسبة الكثافة الخضراء إلى الزرقاء كدالة للتركيز القياسي للبروتين. ملاحظة: ارسم البيانات يدويا أو باستخدام برنامج تفضيلات القارئ ، مثل R أو Microsoft Excel أو GraphPad Prism.</li>
	<li>احسب متوسط نسبة الشدة من الأخضر إلى الأزرق لكل عينة والتخفيف.</li>
	<li>تحقق مما إذا كانت الإشارة التي تم الحصول عليها للعينة تقع ضمن النطاق الخطي لمعيار البروتين.</li>
	<li>تجاهل أي قيمة أقل أو أعلى من القيم الدنيا أو القصوى للمنحنى القياسي.</li>
	<li>استخدم المعادلة الخطية التي تصف المنحنى القياسي لاستقراء كمية البروتين في العينة. اضرب القيم المحسوبة في عامل التخفيف وفقا لذلك.</li>
</ol>

الهاتف الذكي كجهاز تحليلي لقياس البروتين باستخدام مقايسة برادفورد

<ol>
	<li>Zaguri, M., Kandel, S., Rinehart, S. A., Torsekar, V. R., Hawlena, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+quantification+in+ecological+studies:+A+literature+review+and+empirical+comparisons+of+standard+methodologies.">Protein quantification in ecological studies: A literature review and empirical comparisons of standard methodologies.</a> Methods in Ecology and Evolution. 12 (7), 1240-1251 (2021).</li><li>Koga, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mild+electrical+stimulation+and+heat+shock+ameliorates+progressive+proteinuria+and+renal+inflammation+in+mouse+model+of+Alport+syndrome.">Mild electrical stimulation and heat shock ameliorates progressive proteinuria and renal inflammation in mouse model of Alport syndrome.</a> PLoS One. 7 (8), e43852 (2012).</li><li>Peterson, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+total+protein.">Determination of total protein.</a> Methods in Enzymology. 91, 95-119 (1983).</li><li>Goldfarb, A. R., Saidel, L. J., Mosovich, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ultraviolet+absorption+spectra+of+proteins.">The ultraviolet absorption spectra of proteins.</a> The Journal of Biological Chemistry. 193 (1), 397-404 (1951).</li><li>Lowry, O. H., Rosebrough, N. J., Farr, A. L., Randall, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+measurement+with+the+Folin+phenol+reagent.">Protein measurement with the Folin phenol reagent.</a> The Journal of Biological Chemistry. 193 (1), 265-275 (1951).</li><li>Smith, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+protein+using+bicinchoninic+acid.">Measurement of protein using bicinchoninic acid.</a> Analytical Biochemistry. 150 (1), 76-85 (1985).</li><li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding.">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Analytical Biochemistry. 72 (1-2), 248-254 (1976).</li><li>Datki, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+BisANS+fluorescent+dye+for+developing+a+novel+protein+assay.">Application of BisANS fluorescent dye for developing a novel protein assay.</a> PLoS One. 14 (4), e0215863 (2019).</li><li>Van Noorden, R., Maher, B., Nuzzo, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+top+100+papers.">The top 100 papers.</a> Nature. 514 (7524), 550-553 (2014).</li><li>. Scopus Available from: <a target="_blank" href="https://www.scopus.com/">https://www.scopus.com/</a> (2022)</li><li>Compton, S. J., Jones, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+dye+response+and+interference+in+the+Bradford+protein+assay.">Mechanism of dye response and interference in the Bradford protein assay.</a> Analytical Biochemistry. 151 (2), 369-374 (1985).</li><li>Chial, H. J., Thompson, H. B., Splittgerber, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+spectral+study+of+the+charge+forms+of+Coomassie+Blue+G.">A spectral study of the charge forms of Coomassie Blue G.</a> Analytical Biochemistry. 209 (2), 258-266 (1993).</li><li>Pande, S. V., Murthy, M. S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modified+micro-Bradford+procedure+for+elimination+of+interference+from+sodium+dodecyl+sulfate,+other+detergents,+and+lipids.">A modified micro-Bradford procedure for elimination of interference from sodium dodecyl sulfate, other detergents, and lipids.</a> Analytical Biochemistry. 220 (2), 424-426 (1994).</li><li>Gogstad, G. O., Krutnes, M. -. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+protein+in+cell+suspensions+using+the+Commassie+brilliant+blue+dye-binding+assay.">Measurement of protein in cell suspensions using the Commassie brilliant blue dye-binding assay.</a> Analytical Biochemistry. 126 (2), 355-359 (1982).</li><li>Friedenauer, S., Berlet, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensitivity+and+variability+of+the+Bradford+protein+assay+in+the+presence+of+detergents.">Sensitivity and variability of the Bradford protein assay in the presence of detergents.</a> Analytical Biochemistry. 178 (2), 263-268 (1989).</li><li>Stoscheck, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+uniformity+in+the+response+of+the+Coomassie+blue+G+protein+assay+to+different+proteins.">Increased uniformity in the response of the Coomassie blue G protein assay to different proteins.</a> Analytical Biochemistry. 184 (1), 111-116 (1990).</li><li>Zor, T., Selinger, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linearization+of+the+Bradford+protein+assay+increases+its+sensitivity:+Theoretical+and+experimental+studies.">Linearization of the Bradford protein assay increases its sensitivity: Theoretical and experimental studies.</a> Analytical Biochemistry. 236 (2), 302-308 (1996).</li><li>Gee, C. T., Kehoe, E., Pomerantz, W. C. K., Penn, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+protein+concentrations+using+smartphone+colorimetry:+A+new+method+for+an+established+test.">Quantifying protein concentrations using smartphone colorimetry: A new method for an established test.</a> Journal of Chemical Education. 94 (7), 941-945 (2017).</li><li>de Camargo, C., Vicentini, M., Gobbi, A., Martinez, D., Lima, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Smartphone+for+point-of-care+quantification+of+protein+by+Bradford+assay.">Smartphone for point-of-care quantification of protein by Bradford assay.</a> Journal of the Brazilian Chemical Society. 28 (4), 689-693 (2016).</li><li>Moreira, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RGBradford:+Accurate+measurement+of+protein+concentration+using+a+smartphone+camera+and+the+blue+to+green+intensity+ratio.">RGBradford: Accurate measurement of protein concentration using a smartphone camera and the blue to green intensity ratio.</a> Analytical Biochemistry. 655, 114839 (2022).</li><li>Ernst, O., Zor, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linearization+of+the+Bradford+Protein+Assay.">Linearization of the Bradford Protein Assay.</a> Journal of Visualized Experiments. (38), 1918 (2010).</li><li>Angelani, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+metabolic+control+analysis+approach+to+introduce+the+study+of+systems+in+biochemistry:+the+glycolytic+pathway+in+the+red+blood+cell:+Metabolic+control+analysis+and+the+glycolytic+pathway.">A metabolic control analysis approach to introduce the study of systems in biochemistry: the glycolytic pathway in the red blood cell: Metabolic control analysis and the glycolytic pathway.</a> Biochemistry and Molecular Biology Education. 46 (5), 502-515 (2018).</li></ol>

ليس لدى صاحب البلاغ أي تضارب في المصالح للإعلان.

تصف هذه الورقة RGBradford ، وهي طريقة تستخدم كاميرا الهاتف الذكي لتسجيل البيانات من فحص بروتين برادفورد ، واستخراج بيانات الألوان ، وتحديد مستويات البروتين بدقة في العينات البيولوجية كما هو موضح في الأصلمؤخرا 20. أحد الاختلافات عن طريقة RGBradford الأصلية هو أنه تم استخدام إجراء للحصو?...

بغض النظر عن الاستخدام النهائي (على سبيل المثال ، ELISA ، حركية الإنزيم ، النشاف الغربي ، تنقية البروتين ، وقياس الطيف الكتلي) ، فإن القياس الكمي للبروتين أمر بالغ الأهمية للتحليل الدقيق في مختبرات علوم الحياة. بالإضافة إلى استخدامها كقراءات ثانوية (أي لحساب المستويات النسبية للتحليلات لكل كتلة من البروتين) ، يمكن أن تكون مستويات البروتين في العينة هي المخرجات المطلوبة نفسها. على سبيل المثال ، يمكن للمرء أن يهتم بمستويات البروتين في الموارد الغذائية1 أو في البول2. هناك العديد من الطرق المتاحة لقياس تركيز البروتين في العينات3 ، بما في ذلك قراءات امتصاص الأشعة فوق البنفسجية المباشرة4 ، واستخلاب البروتين والنحاس 5,6 ، والمقايسات اللونية لربط صبغة البروتين7 ، ومقايسات الفلورسنت المرتبطة بصبغة البروتين8. تتجلى أهمية كمية البروتين من خلال وجود ورقتين تصفان طرق قياس البروتين 5,7 في أعلى 3 من الأدبيات الأكثر استشهادا 9,10. على الرغم من حقيقة أن العديد من المؤلفين يهملون استشهادهم الفعلي من خلال الاستشهاد بمراجع غير أساسية أو عدم الاستشهاد بأي شيء على الإطلاق ، فإن الأوراق الأصلية التي تصف مقايسة بروتين لوري ومقايسة بروتين برادفورد تبلغ 200000 >اقتباس لكلمنها 10.
تنبع شعبية اختبار برادفورد من قدرته على تحمل التكاليف وبساطته وسرعته وحساسيته. يعتمد الفحص على التفاعل بين البروتينات وصبغة Coomassie Brilliant Blue G في ظل الظروف الحمضية. في ظل ظروف الفحص (أي انخفاض درجة الحموضة) ، توجد الصبغة في ثلاثة أشكال: شكل كاتيوني أحمر مع λmax عند 470 نانومتر. شكل محايد أخضر مع λmax عند 650 نانومتر ؛ وشكل أنيوني أزرق مع λmax عند 590 نانومتر11,12 (الشكل 1). يسود الشكل الكاتيوني في غياب البروتينات. عندما تتفاعل البروتينات مع الصبغة ، فإنها تعمل على استقرار الشكل الأنيوني الأزرق ، مما يتسبب في تغيير ملحوظ في لون المحلول ، من البني إلى الأزرق. عادة ، يتم قياس التغير في تركيز الشكل الأزرق للصبغة طيفيا ، حيث يتناسب امتصاصه عند 590-595 نانومتر مع كمية البروتين في الفحص.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65547/65547fig01v2.jpg"> الشكل 1: أطياف امتصاص G الزرقاء الرائعة في كوماسي تحت ظروف فحص برادفورد. تم تمييز القمم الرئيسية الثلاث بأسهم تشير إلى λmax لأشكال الصبغة الحمراء (470 نانومتر) والأخضر (650 نانومتر) والأزرق (590 نانومتر). تم تسجيل الأطياف في غياب البروتين (الخط الأصفر) وفي وجود 3 ميكروغرام (الخط الرمادي) و 10 ميكروغرام (الخط الأزرق) من ألبومين مصل الأبقار. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65547/65547fig01large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
أدى الاستخدام الواسع النطاق لمقايسة برادفورد إلى تحديد العديد من القيود (على سبيل المثال ، الاستجابات المتغيرة للبروتينات المختلفة11 ، والتداخل بواسطة الدهون13 والمنظفات7) وتطوير تعديلات لتحسين أدائها (على سبيل المثال ، إضافة المنظفات14،15 ، القلوية14،16 واستخدام نسبة الامتصاص17). بالإضافة إلى التعديلات في الفحص نفسه ، تم أيضا وصف استخدام الأجهزة البديلة ، مثل الهواتف الذكية أو الكاميرات ، لالتقاط الإشارات التحليلية18،19،20. في الواقع ، كان تطوير الأساليب التي تستخدم الهواتف الذكية كأجهزة تحليل كيميائية محمولة مجالا نشطا للبحث. ينبع الدافع لاستخدام الهواتف الذكية من القدرة على تحمل التكاليف وقابلية النقل وسهولة الاستخدام والتوافر الواسع لهذه الأجهزة.
توفر هذه الورقة بروتوكولا لقياس كمية البروتين باستخدام اختبار RGBradford20 ، والذي يستخدم الهاتف الذكي كجهاز تحليلي. على عكس منشور RGBradford الأصلي20 ، هنا ، تم تقديم إجراء يبسط عملية استخراج الألوان. إنه ينطوي على استخدام تطبيق برمجي متاح مجانا لاستخراج معلومات الألوان من كل بئر من صورة الصفيحة الدقيقة تلقائيا ، مما يوفر وقتا وجهدا كبيرين. هذا بديل للطريقة السابقة للحصول يدويا على بيانات الألوان من كل بئر واحدا تلو الآخر باستخدام تطبيق برنامج محرر الرسومات20. في النهاية ، يمكن قياس مستويات البروتين في العينات باستخدام بيانات الألوان المستخرجة من صورة صفيحة دقيقة تم التقاطها بهاتف ذكي.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>96-well flat-bottom polystyrene microtiter plates&#160;</td>
			<td>Jet Biofil, Guangzhou, China</td>
			<td>TCP011096</td>
			<td>Any flat-bottom microplate compativle with optical reading will suffice.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>A2153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie Brilliant Blue G</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>B0770</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl alcohol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iPhone 11</td>
			<td>Apple</td>
			<td>MWM02BR/A</td>
			<td>Can be substituted with other smartphone equiped with a camera</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iPhone 14 Pro</td>
			<td>Apple</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphoric acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>695017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Redmi Note 9 Pro</td>
			<td>XIAOMI&#160;</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S22 Ultra</td>
			<td>Samsung&#160;</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpectraMax 384 Plus. Microplate reader.</td>
			<td>Molecular Devices, San Jose, CA</td>
			<td>PLUS 384</td>
			<td>Any microplate reader capable of reading at 450 nm and 590 nm will work. This is optional. The method was actually created to dismiss the need of a microplate reader.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rgbradford: protein quantitation with a smartphone camera

كمية البروتين هو إجراء أساسي في أبحاث علوم الحياة. من بين العديد من الطرق الأخرى ، يعد اختبار برادفورد أحد أكثر الطرق استخداما. بسبب انتشاره على نطاق واسع ، تم الإبلاغ عن قيود ومزايا اختبار برادفورد بشكل شامل ، بما في ذلك العديد من التعديلات على الطريقة الأصلية لتحسين أدائها. أحد تعديلات الطريقة الأصلية هو استخدام كاميرا الهاتف الذكي كأداة تحليلية. بالاستفادة من الأشكال الثلاثة لصبغة Coomassie Brilliant Blue الموجودة في ظروف فحص برادفورد ، تصف هذه الورقة كيفية تحديد كمية البروتين بدقة في العينات باستخدام بيانات الألوان المستخرجة من صورة واحدة للصفيحة الدقيقة. بعد إجراء الفحص في لوحة دقيقة ، يتم التقاط صورة باستخدام كاميرا الهاتف الذكي ، ويتم استخراج بيانات ألوان RGB من الصورة باستخدام تطبيق برمجي مجاني ومفتوح المصدر لتحليل الصور. بعد ذلك ، يتم استخدام نسبة الكثافة الزرقاء إلى الخضراء (في مقياس RGB) للعينات ذات التركيزات غير المعروفة من البروتين لحساب محتوى البروتين بناء على منحنى قياسي. لم يلاحظ فرق كبير بين القيم المحسوبة باستخدام بيانات ألوان RGB وتلك المحسوبة باستخدام بيانات الامتصاص التقليدية.

Regardless of the downstream use (e.g., ELISA, enzyme kinetics, western blotting, protein purification, and mass spectrometry), protein quantification is crucial for accurate analysis in life sciences laboratories. In addition to their use as secondary readouts (i.e., to calculate relative levels of analytes per mass of protein), protein levels in a sample can also be the desired output itself. For example, one can be interested in protein levels in food resources1 or in urine2. There are many methods available to measure protein concentration in samples3, including direct UV absorbance readings4, protein-copper chelation5,6, protein-dye binding colorimetric assays7, and protein-dye binding fluorescent assays8. The relevance of protein quantitation is evidenced by the presence of two papers describing protein measurement methods5,7 in the top-3 of the most cited literature9,10. Despite the fact that many authors neglect their actual citation by citing non-primary references or not citing anything at all, the original papers describing the Lowry protein assay and the Bradford protein assay amount &#62;200,000 citations each10.
The popularity of the Bradford assay stems from its affordability, simplicity, speed, and sensitivity. The assay is based on the interaction between proteins and the dye Coomassie Brilliant Blue G under acidic conditions. Under the conditions of the assay (i.e., low pH), the dye exists in three forms: a red cationic form with &#955;max at 470 nm; a green neutral form with &#955;max at 650 nm; and a blue anionic form with &#955;max at 590 nm11,12 (Figure 1). The cationic form predominates in the absence of proteins. As proteins interact with the dye, they stabilize the blue anionic form, causing a noticeable change in the color of the solution, from brownish to blue. Usually, the change in the concentration of the blue form of the dye is quantified spectrophotometrically, whose absorbance at 590-595 nm is proportional to the quantity of protein in the assay.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65547/65547fig01v2.jpg" /> 
Figure 1: Coomassie brilliant blue G absorption spectra under the conditions of the Bradford assay. The three main peaks are marked with arrows indicating the &#955;max of the red (470 nm), green (650 nm), and blue (590 nm) forms of the dye. Spectra were recorded in the absence of protein (yellow line) and in the presence of 3 &#181;g (gray line) and 10 &#181;g (blue line) of bovine serum albumin. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65547/65547fig01large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
The widespread use of the Bradford assay has led to the identification of several limitations (e.g., variable responses to different proteins11, and interference by lipids13 and detergents7) and the development of modifications to improve its performance (e.g., the addition of detergents14,15, alkalinization14,16 and use of the ratio of absorbances17). In addition to modifications in the assay itself, the use of alternative devices, such as smartphones or cameras, to capture analytical signals have also been described18,19,20. Indeed, the development of methods that make use of smartphones as portable chemical analyzers has been an active area of research. The motivation for the use of smartphones stems from the affordability, portability, ease of use, and widespread availability of these devices.
This paper provides a protocol for protein quantification using the RGBradford assay20, which uses a smartphone as an analytical device. In contrast to the original RGBradford publication20, here, a procedure that streamlines the color extraction process has been introduced. It involves the utilization of a freely available software application to extract color information from each well of a microplate picture automatically, saving significant time and effort. This is an alternative to the previous method of manually acquiring color data from each well one by one using a graphics editor software application20. Ultimately, protein levels in samples can be quantified using color data extracted from a picture of a microplate taken with a smartphone.

تسليط الضوء على المؤلف: نهج بديل لقياس كمية البروتين بواسطة مقايسة برادفورد باستخدام الهاتف الذكي 

RGBradford: كمية البروتين مع كاميرا الهاتف الذكي

Our research focuses on understanding at the biochemical level how animals adapt to extreme environmental conditions. We explore questions about their response to lack of oxygen and suppression of metabolic rate. Specifically, we investigate endogenous antioxidants, oxidative stress, and cellularity stress response animals employ in a adverse environment.And to do so, we often quantify protein levels in our samples. This protocol addresses the need for an alternative method to obtain protein quantification data when resource are limited, making it a valuable tool in both educational and research contexts. The RG Bradford Assay offers a practical and reliable solution for protein concentration measurement that is accessible, simple, and accurate in scenarios where conventional equipment such as a microplate reader may be unavailable.

الشكل 4 عبارة عن صورة لصفيحة دقيقة تم استخراج بيانات اللون منها ، وتم تسجيل الامتصاص عند 450 نانومتر و 590 نانومتر. تم الحصول على بيانات ألوان RGB المبلغ عنها هنا كممثل تلقائيا كما هو موضح في القسم 5. النمط النموذجي لبيانات الألوان هو زيادة في القيم الزرقاء وانخفاض في القيم الحمر...

Watch this Scientific Journal Video about An Alternative Approach to Protein Quantification by Bradford Assay Using a Smartphone at JoVE.com

توفر هذه الورقة بروتوكولا لقياس كمية البروتين باستخدام مقايسة برادفورد والهاتف الذكي كجهاز تحليلي. يمكن قياس مستويات البروتين في العينات باستخدام بيانات الألوان المستخرجة من صورة صفيحة دقيقة تم التقاطها باستخدام هاتف ذكي.

Protein quantitation is an essential procedure in life sciences research. Amongst several other methods, the Bradford assay is one of the most used. ...

يركز بحثنا على فهم كيفية تكيف مع الظروف البيئية القاسية على المستوى الكيميائي الحيوي. نستكشف أسئلة حول استجابتهم لنقص الأكسجين وقمع معدل الأيض. على وجه التحديد ، نقوم بالتحقيق في مضادات الأكسدة الداخلية ، والإجهاد التأكسدي ، والاستجابة للإجهاد الخلوي التي تستخدمها في بيئة معاكسة.وللقيام بذلك، غالبا ما نحدد مستويات البروتين في عيناتنا. يعالج هذا البروتوكول الحاجة إلى طريقة بديلة للحصول على بيانات القياس الكمي للبروتين عندما تكون الموارد محدودة ، مما يجعلها أداة قيمة في كل من السياقات التعليمية والبحثية. يوفر RG Bradford Assay حلا عمليا وموثوقا لقياس تركيز البروتين يمكن الوصول إليه وبسيطا ودقيقا في السيناريوهات التي قد لا تتوفر فيها المعدات التقليدية مثل قارئ الألواح الدقيقة.

rgbradford-protein-quantitation-with-a-smartphone-camera

Research

JoVE Journal

Biochemistry

RGBradford: Protein Quantitation with a Smartphone Camera

1.8K Views.  University of Brasilia. يركز بحثنا على فهم كيفية تكيف مع الظروف البيئية القاسية على المستوى الكيميائي الحيوي. نستكشف أسئلة حول استجابتهم لنقص الأكسجين وقمع معدل الأيض. على وجه التحديد ، نقوم بالتحقيق في مضادات الأكسدة الداخلية ، والإجهاد التأكسدي ، والاستجابة للإجهاد الخلوي التي تستخدمها في بيئ...

Video: تسليط الضوء على المؤلف: نهج بديل لقياس كمية البروتين بواسطة مقايسة برادفورد باستخدام الهاتف الذكي 

Protein quantitation is an essential procedure in life sciences research. Amongst several other methods, the Bradford assay is one of the most used. Because of its widespread, the limitations and advantages of the Bradford assay have been exhaustively reported, including several modifications of the original method to improve its performance. One of the alterations of the original method is the use of a smartphone camera as an analytical instrument. Taking advantage of the three forms of the Coomassie Brilliant Blue dye that exist in the conditions of the Bradford assay, this paper describes how to accurately quantify protein in samples using color data extracted from a single picture of a microplate. After performing the assay in a microplate, a picture is taken using a smartphone camera, and RGB color data is extracted from the picture using a free and open-source image analysis software application. Then, the ratio of blue to green intensity (in the RGB scale) of samples with unknown concentrations of protein is used to calculate the protein content based on a standard curve. No significant difference is observed between values calculated using RGB color data and those calculated using conventional absorbance data.

This paper provides a protocol for protein quantification using the Bradford assay and a smartphone as an analytical device. Protein levels in samples can be quantified using color data extracted from a picture of a microplate taken with a smartphone.

Recording Bradford Protein Assay Results Using a Smartphone Camera

To begin sample preparation for the Bradford protein assay, dilute the protein samples to obtain protein concentrations within the standard curve range of 0.025 to 1.0 milligrams per milliliter. Create multiple sample dilutions per sample within this range. For the zero protein point, add 10 microliters of the buffer or medium used to prepare the standard solutions to the designated wells.Then add 10 microliters of each protein standard solution into a set of three wells serving as triplicates in a 96-well microplate. In a separate set of wells on the same 96-well microplate, add 10 microliters of each sample dilution in triplicates. Next, add 250 microliters of Bradford protein assay reagent to all wells.A layout of the final microplate setup is displayed on the screen. Proceed to record the results in a well illuminated room within 5 to 15 minutes of adding the assay reagent. Using one hand, hold the microplate against a uniform white background, ensuring it is parallel to the work bench.While using the other hand, hold a smartphone parallel to the bench and the microplate. Proceed to capture several pictures of the entire microplate. For iOS devices, enable the grid option in camera settings to turn on the camera level indicator.For Android devices, activate grid lines in camera settings to achieve the same. Although no special lighting apparatus is required, maintain caution while capturing the images properly. Avoid shading the plate or the background and prevent excessive reflection.Also, ensure not to tilt the plate. Inspect the picture for background, uniformity, shadows, and reflections. Also check the angle of the wells:The center of each well should be directly visible If desired, read the microplate in a microplate reader to compare the picture color data with the microplate absorbance readings.

تسجيل نتائج فحص بروتين برادفورد باستخدام كاميرا الهاتف الذكي

Automatically Extracting the Bradford Assay Data Recorded with a Smartphone

To extract the Bradford Assay data from the images of the microplate recorded using the smartphone camera, download the software image J and the ReadPlate plugin available as a text file. After opening image J, click on Plugins followed by Install, and select the downloaded ReadPlate plugin text file. Set the measurement parameters by clicking on Analyze, and then Set Measurements and checking the options:Area, Standard deviation, Minimum and maximum gray value, Mean gray value, Modal gray value.On the bottom of the window, set Redirect to as None and Decimal place as zero to 9 as 3. Go to File. Click Open and select the picture of the microplate taken using the smartphone.Go to Plugins followed by ReadPlate. Read the instructions and then click OK.Select the Number of wells as 96. Using the rectangular selection tool automatically loaded by the plugin, make a rectangle beginning in the center of the A1 well and ending in the center of the H12 well, then click OK.Select the Blue channel and click OK.Then confirm the default parameters by clicking on OK.Check if the software delineated an area inside each well, and if the selected areas are not covering areas with abnormal shadows or reflection.Once checked, click OK.Save the results before repeating the same for the Green channel. Calculate the Blue to-Green ratio using the mode for each color. The RGB color data obtained automatically from the picture of a microplate showed the typical increase in the blue values and a decrease in the red and green values for the BSA standard.Further, the color data extracted from the picture accurately reflected absorbance readings recorded at 450 and 590 nanometers. The standard curve obtained with the extracted color data depicting the signal versus BSA concentration was found to be linear as expected. A linear relationship between sample dilution and the signal was obtained for both absorbance readings as well as the extracted color data in two different protein samples.For both protein samples, some of the dilutions were not within the linear range of the standard curve. However, after ignoring those points, protein levels calculated using RGB data for both samples matched those calculated using the absorbance readings.

استخراج بيانات فحص برادفورد المسجلة تلقائيا باستخدام هاتف ذكي

Manually Extracting the Bradford Assay Data Recorded with a Smartphone

To manually extract the Bradford Assay data from the images of the microplate recorded using the smartphone camera, download Inkscape, a free and open source graphics editor. Open Inkscape, go to file, and click open"to select the picture of the microplate taken using the smartphone. Pick the select and transform objects S tool, which is depicted as an arrow on the top left side, and click on the picture.A dashed line border will indicate the selection. Then select the pick colors from Image D tool, which is depicted as an eyedropper on the left side. Next, click in the center of a well.The color on the bottom panel, fill, will change accordingly. Click on the color and a fill and stroke tab will pop up on the right side. Change the flat color dropdown menu to RGB.Record the values shown for the blue and green channels for each well. Calculate the blue to green ratio using the recorded values.