تم دعم هذا العمل بمنح من مؤسسة العلوم الطبيعية في الصين (82070450 إلى CT و 82170466 إلى L.Z.) وزمالة مؤسسة علوم ما بعد الدكتوراه الصينية (7121102223 إلى F.L.).

تمت الموافقة على جميع الإجراءات الحيوانية الموضحة أدناه من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام بجامعة سوشو.
1. الكواشف وإعداد المواد
<ol><li>استخدم 1x PBS بدون الكالسيوم والمغنيسيوم و 2.5 وحدة / مل من ملح الصوديوم الهيبارين لتحضير محلول التروية. يحفظ في درجة حرارة 4 درجات مئوية، ويبرد مسبقا على الثلج عند استخدامه.</li>
	<li>تحضير كاشف التفكك A الذي يحتوي على 125 CDU / mL كولاجيناز II و 60 U / mL DNase I عن طريق تخفيف 1250 CDU / mL كولاجيناز II و 3000 U / mL DNase I مع HBSS. يحفظ على حرارة 4 درجة مئوية حتى الاستخدام.</li>
	<li>تحضير كاشف التفكك B الذي يحتوي على تركيز نهائي قدره 0.12٪ تربسين عن طريق تخفيف 1 مل من التربسين الخالي من EDTA بنسبة 0.25٪ (بدون الفينول الأحمر) إلى 1 مل من 1x PBS. يحفظ على حرارة 4 درجة مئوية حتى الاستخدام.</li>
	<li>تحضير 10 مل من 1.5٪ FBS و 10 مل من 5٪ FBS في 1x PBS. استخدم 1.5٪ FBS لتجميع الشرايين السباتية والاحتفاظ بها على الثلج قبل الاستخدام. استخدم 5٪ FBS لتحييد الهضم وتخزينه في درجة حرارة الغرفة (RT).</li>
	<li>احصل على المواد التجريبية ، بما في ذلك محاقن 1 مل ، ومحاقن 20 مل مع إبر 26-G ، وألواح زراعة الخلايا الستة ، وأنابيب الطرد المركزي 1.5 مل ، ومصافي الخلايا المعقمة 40 ميكرومتر ، وحاويات الثلج.</li>
</ol>2. إعداد المعدات
<ol><li>تعقيم جميع المعدات الجراحية ، بما في ذلك المجهر المجسم ، ومقص التشريح ، ومقص التشريح الدقيق ، والملقط ذي الأطراف الدقيقة.</li>
	<li>قم بتشغيل عداد الخلايا الآلي واحتفظ به في RT.</li>
	<li>قم بتشغيل الحمام المائي إلى 37 درجة مئوية مقدما.</li>
	<li>قم بتبريد جهاز الطرد المركزي الدقيق إلى 4 درجات مئوية قبل الاستخدام.</li>
</ol>3. عزل الشريان السباتي الفأر
<ol><li>تخدير الفأر باستخدام 1.25٪ ثلاثي برومو إيثانول عن طريق الحقن داخل الصفاق (0.24 مل لكل 10 جم من وزن الجسم) واقلب الماوس للتحقق مما إذا كان هناك رد فعل تصحيح بعد 3 دقائق. ثم ، القتل الرحيم للفأر عن طريق خلع عنق الرحم ووضعه على ظهره. رش جلد الفأر بنسبة 75٪ كحول.</li>
	<li>استخدم مقص تشريح معقم لفتح الجلد وكشف تجويف الصدر. قطع فتح الحجاب الحاجز.</li>
	<li>استمر في القطع لأعلى إلى الفك السفلي وقم بإزالة الأنسجة الضامة الزائدة والدهون بعناية ، مما يعرض الشريان السباتي.</li>
	<li>قطع الوريد الأجوف السفلي للفأر لجعل الدم يتدفق من الدورة الدموية المغلقة.</li>
	<li>حقن 20 مل من محلول التروية المبرد مسبقا في البطين الأيسر باستخدام حقنة ببطء وبشكل مستمر. ملاحظة: إذا نجح التروية ، فإن الأعضاء الغنية بالدم مثل الكبد والطحال والكلى ستتحول إلى اللون الرمادي والأبيض.</li>
	<li>انزع جميع الأنسجة الدهنية والأنسجة الضامة حول الشريان السباتي بمقص تشريح دقيق تحت مجهر مجسم. ملاحظة: يجب أن تتم هذه الخطوة ببطء وحذر لمنع تلف الشريان السباتي.</li>
	<li>اعزل الشريان السباتي عن الفأر ، واغسله باستخدام 1x PBS لطرد الدم مرة أخرى ، وانقله إلى ستة ألواح تحتوي على 1.5٪ FBS على الجليد.</li>
</ol>4. هضم الشريان السباتي في تعليق خلية واحدة
<ol><li>استخدم مقص التشريح الدقيق لتشريح الشريان السباتي طوليا ووضعه بشكل مسطح في لوحة أخرى لزراعة الخلايا مكونة من 6 آبار تحتوي على 1 مل من 1.5٪ FBS على الجليد.</li>
	<li>اغسل البطانة بعناية باستخدام 1.5٪ FBS لإزالة الدم المتبقي. ملاحظة: يجب أن يكون التنظيف لطيفا وبطيئا لتجنب إصابة الخلايا البطانية.</li>
	<li>قطع كل الشريان السباتي إلى ما يقرب من 2 مم2 قطعة الأنسجة باستخدام مقص التشريح المجهري في 1.5٪ FBS.</li>
	<li>انقل قطع الأنسجة هذه إلى أنبوب طرد مركزي سعة 1.5 مل مع أطراف تجويف عريضة سعة 1 مل ، وأجهزة طرد مركزي عند 400 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية لإغراق الأنسجة في القاع.</li>
	<li>تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الأنسجة في 500 ميكرولتر من كاشف التفكك A.</li>
	<li>ضع الأنبوب في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة. ماصة بلطف مع ماصة 1 مل كل 10 دقائق.</li>
	<li>أضف 500 ميكرولتر من 5٪ FBS في الأنبوب واخلطه جيدا مع ماصة 1 مل.</li>
	<li>قم بتصفية تعليق الخلية من خلال مصفاة خلية معقمة 40 ميكرومتر في أنبوب طرد مركزي جديد سعة 1.5 مل وجهاز طرد مركزي عند 400 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.</li>
	<li>قم بإزالة المادة الطافية بعناية وأعد تعليق حبيبات الخلية في 200 ميكرولتر من كاشف التفكك B.</li>
	<li>ضعيها في حمام مائي على حرارة 37 درجة مئوية واخلطيها لمدة 5 دقائق إضافية. ماصة بلطف كل 2 دقيقة أثناء الهضم لتنفصل تماما إلى تعليق خلية واحدة.</li>
	<li>استخدم 200 ميكرولتر من 5٪ FBS لإنهاء تفاعل الهضم ، وأجهزة الطرد المركزي عند 400 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.</li>
	<li>تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق حبيبات الخلية في 100 ميكرولتر من 1x PBS على الجليد.</li>
</ol>5. فحص تعليق الخلية وتسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية
<ol><li>أضف 10 ميكرولتر من محلول AO / PI إلى 10 ميكرولتر من التعليق أحادي الخلية واخلطه برفق باستخدام ماصة 20 ميكرولتر.</li>
	<li>ماصة 20 ميكرولتر من الخليط في شريحة الغرفة وانتظر لمدة 1 دقيقة.</li>
	<li>قم بتحميل الشريحة في أداة عداد الخلايا الآلية.</li>
	<li>حدد مقايسة جدوى AO / PI ، ثم انتظر تقرير الجودة.</li>
	<li>استخدم مجموعة كاشف أحادية الخلية 3 بوصة لتوليد حبات هلام أحادية الخلية في المستحلب على وحدة تحكم أحادية الخلية وتضخيم cDNA المشفر في دورة حرارية وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. ملاحظة: هنا ، تم استخدام مجموعات كاشف الكروم أحادي الخلية 3ʹ v3.</li>
	<li>قم بإجراء التسلسل على جهاز التسلسل باستخدام إستراتيجية قراءة مزدوجة النهاية 150 bp (PE150). استخدم تطبيقا برمجيا (Cell Ranger) لتحويل ملفات المكالمات الأساسية الأولية إلى ملفات fastq باستخدام خط أنابيب mkfastq . بعد ذلك ، استخدم خط أنابيب العد ل Cell Ranger لإجراء المحاذاة والتصفية وعد الباركود وعد المعرف الجزيئي الفريد (UMI) لإنشاء مصفوفات الباركود للمعالم13.</li>
	<li>قم بإجراء تقليل أبعاد البيانات والتصور باستخدام حزمة R Seurat14.<ol><li>أولا ، تقرأ الدالة Read10X () ل Seurat في إخراج خط أنابيب Cell Ranger ثم تستخدم مصفوفة العد لإنشاء كائن Seurat. بعد ذلك ، قم بتصفية الخلايا التي تحتوي على تعبير عن <200 أو >4000 جين أو نسبة جين الميتوكوندريا التي كانت أكثر من 10٪ بواسطة وظيفة subset () ل Seurat.</li>
		<li>استخدم NormalizeData () و FindVariableFeatures() لتسوية البيانات وتحديد 2000 معلم متغير للغاية، على التوالي.</li>
		<li>قم بإجراء تحليل المكون الرئيسي (PCA) على البيانات المقاسة ، وقم بتجميع الخلايا ذات الخافتات = 30 والدقة = 0.5. أخيرا ، استخدم الدالة RunUMAP () لتصور مجموعات البيانات أحادية الخلية و FindAllMarkers () للعثور على كل علامة حيوية للمجموعة.</li>
	</ol></li>
</ol>

هضم الخلايا من خطوتين للشريان السباتي للفأر

<ol>
	<li>Lee, D. -. Y., Chiu, J. -. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atherosclerosis+and+flow:+roles+of+epigenetic+modulation+in+vascular+endothelium.">Atherosclerosis and flow: roles of epigenetic modulation in vascular endothelium.</a> Journal of Biomedical Science. 26 (1), 56 (2019).</li><li>Libby, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atherosclerosis.">Atherosclerosis.</a> Nature Reviews Disease Primers. 5 (1), 56 (2019).</li><li>Jovic, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+RNA+sequencing+technologies+and+applications:+A+brief+overview.">Single-cell RNA sequencing technologies and applications: A brief overview.</a> Clinical and Translational Medicine. 12 (3), e694 (2022).</li><li>Li, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+RNA-seq+reveals+cellular+heterogeneity+of+mouse+carotid+artery+under+disturbed+flow.">Single-cell RNA-seq reveals cellular heterogeneity of mouse carotid artery under disturbed flow.</a> Cell Death Discovery. 7 (1), 180 (2021).</li><li>Rohlenova, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+RNA+sequencing+maps+endothelial+metabolic+plasticity+in+pathological+angiogenesis.">Single-cell RNA sequencing maps endothelial metabolic plasticity in pathological angiogenesis.</a> Cell Metabolism. 31 (4), 862.e14-877.e14 (2020).</li><li>Ren, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+gained+from+single-cell+analysis+of+immune+cells+in+the+tumor+microenvironment.">Insights gained from single-cell analysis of immune cells in the tumor microenvironment.</a> Annual Review of Immunology. 39, 583-609 (2021).</li><li>Sun, H., Xu, X., Deng, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+single+epithelial+cells+suspension+from+mouse+mammary+glands.">Preparation of single epithelial cells suspension from mouse mammary glands.</a> Bio-Protocol. 10 (4), e3530 (2020).</li><li>Korin, B., Chung, J. -. J., Avraham, S., Shaw, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+single-cell+suspensions+of+mouse+glomeruli+for+high-throughput+analysis.">Preparation of single-cell suspensions of mouse glomeruli for high-throughput analysis.</a> Nature Protocols. 16 (8), 4068-4083 (2021).</li><li>Thomson, B., Quaggin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+a+single+cell+suspension+from+the+murine+iridocorneal+angle.">Preparation of a single cell suspension from the murine iridocorneal angle.</a> Bio-Protocol. 12 (10), e4426 (2022).</li><li>Leale, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+two-stage+digestion+of+whole+murine+knee+joints+for+single-cell+RNA+sequencing.">A two-stage digestion of whole murine knee joints for single-cell RNA sequencing.</a> Osteoarthritis and Cartilage Open. 4 (4), 100321 (2022).</li><li>Hu, D., Yin, C., Mohanta, S. K., Weber, C., Habenicht, A. J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+single-cell+suspensions+from+mouse+aorta.">Preparation of single-cell suspensions from mouse aorta.</a> Bio-Protocol. 6 (11), e1832 (2016).</li><li>Jungblut, M., Oeltze, K., Zehnter, I., Hasselmann, D., Bosio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardized+preparation+of+single-cell+suspensions+from+mouse+lung+tissue+using+the+gentleMACS+dissociator.">Standardized preparation of single-cell suspensions from mouse lung tissue using the gentleMACS dissociator.</a> Journal of Visualized Experiments. 29, e1266 (2009).</li><li>You, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Benchmarking+UMI-based+single-cell+RNA-seq+preprocessing+workflows.">Benchmarking UMI-based single-cell RNA-seq preprocessing workflows.</a> Genome Biology. 22 (1), 339 (2021).</li><li>Stuart, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+integration+of+single-cell+data.">Comprehensive integration of single-cell data.</a> Cell. 177 (7), 1888-1902 (2019).</li><li>Depuydt, M. A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microanatomy+of+the+human+atherosclerotic+plaque+by+single-cell+transcriptomics.">Microanatomy of the human atherosclerotic plaque by single-cell transcriptomics.</a> Circulation Research. 127 (11), 1437-1455 (2020).</li><li>Gao, X. -. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+RNA+sequencing+of+the+rat+carotid+arteries+uncovers+potential+cellular+targets+of+neointimal+hyperplasia.">Single-cell RNA sequencing of the rat carotid arteries uncovers potential cellular targets of neointimal hyperplasia.</a> Frontiers in Cardiovascular Medicine. 8, 75152 (2021).</li><li>Kumar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+endothelial+cells+from+the+lumen+of+mouse+carotid+arteries+for+single-cell+multi-omics+experiments.">Isolation of endothelial cells from the lumen of mouse carotid arteries for single-cell multi-omics experiments.</a> Journal of Visualized Experiments. 176, e63128 (2021).</li></ol>

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للكشف عنه.

نقدم هنا بروتوكولا مفصلا لإعداد معلق أحادي الخلية عالي الجودة من الشريان السباتي للفئران البرية ، حيث تم إنشاء طريقة هضم من خطوتين تدمج عملية هضم كولاجيناز / DNase والتربسين. بعد فحص جودة التعليق أحادي الخلية ، وجدنا أنه يفي بمتطلبات تسلسل الخلية الواحدة ، مع صلاحية الخلايا أكثر من 85٪ وتركيز...

تصلب الشرايين هو مرض التهابي مزمن يرتبط بعوامل الخطر مثل ارتفاع ضغط الدم وفرط شحميات الدم وديناميكا الدم1. تشعبات الشريان السباتي عرضة للتغيرات الديناميكية الدموية وتؤدي إلى تكوين اللويحات السباتية. يمكن أن يكون العرض السريري لتصلب الشرايين السباتي حادا مثل السكتة الدماغية ونقص التروية الدماغية العابرة ، أو مزمنا مثل نقص التروية الدماغية العابر المتكرر والخرف الوعائي2. ميكانيكيا ، اللويحة السباتية هي نتيجة التفاعل بين خلايا جدار الأوعية الدموية المختلفة وخلايا الدم المختلفة في ظل الظروف المرضية. لذلك ، فإن الكشف عن أطلس الخلية الواحدة للأوعية السباتية في ظل الظروف الفسيولوجية والمرضية مهم بشكل خاص لمنع وعلاج تطور البلاك السباتي.
يعد تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية أحد أقوى تقنيات البحث البيولوجي بسبب دقته الفائقة والكشف عن عدم تجانس الخلية من نفس نوع الخلية من الكائنات الحية 3,4. استخدم الباحثون تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية لإجراء البحوث في العديد من المجالات ، مثل أمراض القلب والأوعية الدموية5 والسرطان6. ومع ذلك ، لا يزال فصل الأنسجة بسرعة ودقة إلى خلايا مفردة أحد التحديات الرئيسية. التفكك الأنزيمي هو طريقة شائعة الاستخدام تشمل في الغالب كولاجيناز ، غراء ، تربسين ، DNase ، وهيالورونيداز. على وجه التحديد ، الكولاجين هي أنواع الإنزيمات الرئيسية لعملية الهضم أحادية الخلية ، وخاصة مكونات الكولاجين المائية في الأنسجة الضامة. أنواع مختلفة من الكولاجين قابلة للتطبيق لتفكك الأنسجة المختلفة ، مثل الغدة الثديية7 ، الكبيبة8 ، زاوية القزحيةالقرنية 9 ، مفصل الركبة 10 ، الشريان الأورطي11 ، والرئة12. نظرا للخصائص الفسيولوجية الفريدة للأنسجة المختلفة ، قد يسبب التفكك باستخدام نفس الطريقة العديد من المشاكل في الحصول على خلايا مفردة ، مثل انخفاض صلاحية الخلية ، وانخفاض عدد الخلايا ، وحطام الخلايا الكبيرة. لذلك ، فإن اختراع طرق الهضم للأنسجة المختلفة أمر ضروري لإعداد معلقات أحادية الخلية عالية الجودة.
يهدف هذا البروتوكول إلى تطوير طريقة هضم خلوية من خطوتين لإعداد معلق أحادي الخلية للشريان السباتي للفئران البرية. وفقا لخصائص الشريان السباتي ، قمنا بدمج كولاجيناز / إنزيم مع التربسين للحصول على معلق أحادي الخلية عالي الجودة للشريان السباتي للفأر لأن كولاجيناز يمكن أن يتحلل الكولاجين في الأنسجة السباتية ، والذي تم هضمه بواسطة التربسين في معلق أحادي الخلية. تم استخدام حساب التألق المزدوج لأكريدين أورانج / بروبيديوم يوديد (AO / PI) للكشف عن صلاحية الخلية وتركيزها ، ووجد أن التعليق أحادي الخلية يفي بمتطلبات تسلسل الخلية الواحدة ، مع صلاحية الخلايا أكثر من 85٪ وتركيز عال للخلية. بعد معالجة البيانات أحادية الخلية ، تم تحديد أربعة أنواع من الخلايا ، بما في ذلك خلايا العضلات الملساء الوعائية (VSMCs) ، والخلايا الليفية ، والخلايا البطانية (ECs) ، والبلاعم والخلايا المتغصنة (Mφ / DCs) ، في الشرايين السباتية الطبيعية للفأر بعد الهضم. مزايا هذا البروتوكول هي: 1) يمكن تحديد أنواع متعددة من الخلايا في الشريان السباتي ، 2) يتم الحفاظ على صلاحية الخلية بشكل جيد ، و 3) يمكن تكرارها بسهولة بدون معدات خاصة. هذا البروتوكول مناسب للباحثين المهتمين بدراسة تعدد الخلايا أحادية الخلية للشرايين السباتية للفأر. قد يكون هذا البروتوكول مفيدا أيضا في تفكك الأوعية الدموية الأخرى مع التعديلات المناسبة.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.25% EDTA-free trypsin</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>C0205</td>
			<td>Dilute 1 mL of 0.25% EDTA-free trypsin into 1 mL of 1x PBS.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.9% NaCl saline solution</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>ST341</td>
			<td>Dilute the heparin sodium solution into a final concentration of 10 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL syringes</td>
			<td>&#160;SKJYLEAN</td>
			<td>sk-r009</td>
			<td>To perform cardiac perfusion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL centrifuge tubes</td>
			<td>KIRGEN</td>
			<td>KG2211W</td>
			<td>To centrifuge the tissue piece and cell suspension</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 mL syringes</td>
			<td>SKJYLEAN</td>
			<td>sk-r013</td>
			<td>To perform cardiac perfusion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 &#181;m cell strainer</td>
			<td>JETBIOFIL</td>
			<td>css010040</td>
			<td>To filter undigested tissue fragments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AO/PI kit</td>
			<td>Hengrui Biological</td>
			<td>RE010212</td>
			<td>To identify whether the cell is alive or dead</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated cell counter</td>
			<td>Countstar</td>
			<td>Mira FL</td>
			<td>To analyze the cell morphology and cell viability of digested carotid vascular cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Ranger software</td>
			<td>10&#215; Genomics</td>
			<td>3.0.2</td>
			<td>To process Chromium single-cell RNA-seq output and perform clustering and gene expression analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromium Single Cell 3&#39;Reagent Kits v3</td>
			<td>10&#215; Genomics</td>
			<td>1000075</td>
			<td>To prepare single-cell RNA-seq libraries of single-cell suspension</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase II</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C6885</td>
			<td>Dilute with HBSS to a final concentration of 125 CDU/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxyribonuclease I</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS002140</td>
			<td>Dilute with HBSS to a final concentration of 60 U/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum&#160;</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30088.03</td>
			<td>Termination of the digestion reaction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s balanced salt solution&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14175095</td>
			<td>Store at the room temperture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin sodium salt</td>
			<td>Solarbio Life Science</td>
			<td>H8060</td>
			<td>Dilute with 0.9% NaCl to a final concentration of 10 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>75002560</td>
			<td>Applied for spining down the tissues and cell pellets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NovaSeq 6000&#160;</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Sequencer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline</td>
			<td>Solarbio Life Science</td>
			<td>P1000</td>
			<td>Used for cardiac perfusion and resuspension of cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seurat package- R</td>
			<td>Satija Lab</td>
			<td>3.1.2</td>
			<td>To performed dimensionality reduction, visualization, and analysis of scRNA-sequencing data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Six-well cell culture plates</td>
			<td>NEST</td>
			<td>703002</td>
			<td>Place the vascular tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>Jinghong</td>
			<td>DK-S22</td>
			<td>Keep the digestion temperature at 37 &#176;C</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of a single-cell suspension from mouse carotid arteries for single-cell sequencing

الشرايين السباتية هي أوعية دموية رئيسية في الرقبة تمد الدماغ بالدم والأكسجين، ولكن يحدث تضيق الشريان السباتي عندما تكون الشرايين السباتية مسدودة باللويحات. يعد الكشف عن التركيب الخلوي للشريان السباتي على مستوى الخلية الواحدة أمرا ضروريا لعلاج تصلب الشرايين السباتي. ومع ذلك ، لا يوجد بروتوكول جاهز للاستخدام لإعداد معلقات أحادية الخلية من الشرايين السباتية. للحصول على بروتوكول مناسب لتفكك الشرايين السباتية الطبيعية على مستوى الخلية الواحدة مع ضرر أقل للخلايا ، قمنا بتصميم طريقة هضم من خطوتين من خلال دمج عملية هضم كولاجيناز / DNase والتريبسين. تم استخدام حساب التألق المزدوج لأكريدين أورانج / بروبيديوم يوديد (AO / PI) للكشف عن صلاحية الخلية وتركيزها ، ووجد أن التعليق أحادي الخلية يفي بمتطلبات تسلسل الخلية الواحدة ، مع صلاحية الخلايا أكثر من 85٪ وتركيز عال للخلية. بعد معالجة البيانات أحادية الخلية ، تم الكشف عن متوسط ~ 2500 نسخة لكل خلية في كل خلية شريان سباتي. والجدير بالذكر أن مجموعة متنوعة من أنواع الخلايا في الشريان السباتي الطبيعي ، بما في ذلك خلايا العضلات الملساء الوعائية (VSMCs) ، والخلايا الليفية ، والخلايا البطانية (ECs) ، والبلاعم والخلايا المتغصنة (Mφ / DCs) ، كانت قابلة للاكتشاف في وقت واحد. يمكن تطبيق هذا البروتوكول لإعداد تعليق خلية واحدة للأوعية الدموية من الأنسجة الأخرى مع التعديلات المناسبة.

Atherosclerosis is a chronic inflammatory disease associated with risk factors such as high blood pressure, hyperlipidemia, and hemodynamics1. Carotid artery bifurcations are prone to hemodynamic changes and lead to carotid plaque formation. The clinical presentation of carotid atherosclerosis can be acute such as stroke and transient cerebral ischemia, or chronic such as recurrent transient cerebral ischemia and vascular dementia2. Mechanically, carotid plaque is the outcome of the interaction between different vessel wall cells and various blood cells under pathological conditions. Therefore, revealing the single-cell atlas of carotid vessels under physiological and pathological conditions is particularly important for preventing and treating carotid plaque development.
Single-cell RNA sequencing is one of the most powerful technologies of biological research because of its ultrahigh resolution and detection of cell heterogeneity from the same cell type of organisms3,4. Researchers have used single-cell RNA sequencing to conduct research in many fields, such as cardiovascular disease5 and cancer6. However, quickly and accurately separating tissues into single cells is still one of the main challenges. Enzymatic dissociation is a commonly used method that dominantly includes collagenase, papain, trypsin, DNase, and hyaluronidase. Specifically, collagenases are the major enzyme species for single-cell digestion, mainly hydrolyzing collagen components in connective tissues. Different collagenase types are applicable for the dissociation of different tissues, such as the mammary gland7, glomerulus8, iridocorneal angle9, knee joint10, aorta11, and lung12. Due to the unique physiological properties of different tissues, dissociation using the same method may cause many troubles in acquiring single cells, such as low cell viability, low cell number, and large cell debris. Therefore, the invention of digestion methods for different tissues is essential for preparing high-quality single-cell suspensions.
This protocol aims to develop a two-step cell digestion method to prepare a single-cell suspension of the carotid artery of wild-type mice. According to the characteristics of the carotid artery, we combined collagenase/DNase with trypsin to obtain a high-quality single-cell suspension of the mouse carotid artery because collagenase can hydrolyze collagen of the carotid tissues, which was further digested by trypsin into a single-cell suspension. Acridine orange/propidium iodide (AO/PI) dual-fluorescence counting was used to detect cell viability and concentration, and it was found that the single-cell suspension satisfied the requirements for single-cell sequencing, with the viability of cells over 85% and a high cell concentration. After single-cell data processing, four cell types, including vascular smooth muscle cells (VSMCs), fibroblasts, endothelial cells (ECs), and macrophages and dendritic cells (M&#966;/DCs), were identified in normal mouse carotid arteries after digestion. The advantages of this protocol are that: 1) multiple cell types in the carotid artery can be identified, 2) cell viability is well preserved, and 3) it can be easily repeated without special equipment. This protocol is suitable for researchers who are interested in studying single-cell multiomics of the mouse carotid arteries. This protocol may also be helpful in the dissociation of other blood vessels with appropriate modifications.

تسليط الضوء على المؤلف: تفكك أنسجة الأوعية الدموية واستكشاف المجموعات الفرعية أحادية الخلية للعلاج الموجه 

تحضير معلق أحادي الخلية من الشرايين السباتية للفأر لتسلسل الخلية الواحدة

Low solubility and the larger cell debrief are the main difficulties of vascular tissue dissociation. Our two steps or digestion method is very suitable for carotid tissue dissociation and may be used to prepare single cell suspicions for other vessels with minor modifications, making it very helpful in cardiovascular research. This protocol is suitable for obtaining multiple cell types in the carotid artery, and it can be easily repeated without special equipment.In the future, we aim to use cell subclasses discovered by single cell ion sequencing for targeted therapy of cardiovascular disease.

يصف هذا البروتوكول طريقة هضم الخلايا المكونة من خطوتين لإعداد معلق أحادي الخلية للشرايين السباتية للفأر (الشكل 1). تجمع طريقة هضم الخلايا المكونة من خطوتين بين كولاجيناز / DNase مع التربسين لفصل جدار الأوعية الدموية السباتي للفأر بشكل فعال للحصول على معلقات أحادية الخلية عال...

Watch this Scientific Journal Video about Vascular Tissue Dissociation and Exploring Single-Cell Subclusters for Targeted Therapy at JoVE.com

نصف هنا بروتوكول هضم الخلايا المكون من خطوتين لإعداد تعليق أحادي الخلية للشرايين السباتية للفأر.

Carotid arteries are major blood vessels in the neck that supply blood and oxygen to the brain, but carotid stenosis occurs when carotid arteries are ...

انخفاض الذوبان واستخلاص المعلومات من الخلايا الأكبر هي الصعوبات الرئيسية لتفكك الأنسجة الوعائية. خطواتنا أو طريقة الهضم لدينا مناسبة جدا لتفكك الأنسجة السباتية ويمكن استخدامها لإعداد شكوك خلية واحدة للأوعية الأخرى مع تعديلات طفيفة ، مما يجعلها مفيدة جدا في أبحاث القلب والأوعية الدموية. هذا البروتوكول مناسب للحصول على أنواع متعددة من الخلايا في الشريان السباتي ، ويمكن تكراره بسهولة بدون معدات خاصة.في المستقبل ، نهدف إلى استخدام فئات فرعية للخلايا تم اكتشافها عن طريق تسلسل أيون خلية واحدة للعلاج الموجه لأمراض القلب والأوعية الدموية.

preparation-single-cell-suspension-from-mouse-carotid-arteries-for

Research

JoVE Journal

Biology

Preparation of a Single-Cell Suspension from Mouse Carotid Arteries for Single-Cell Sequencing

2.0K Views.  Soochow University. انخفاض الذوبان واستخلاص المعلومات من الخلايا الأكبر هي الصعوبات الرئيسية لتفكك الأنسجة الوعائية. خطواتنا أو طريقة الهضم لدينا مناسبة جدا لتفكك الأنسجة السباتية ويمكن استخدامها لإعداد شكوك خلية واحدة للأوعية الأخرى مع تعديلات طفيفة ، مما يجعلها مفيدة جدا في أبحاث القلب و...

Video: تسليط الضوء على المؤلف: تفكك أنسجة الأوعية الدموية واستكشاف المجموعات الفرعية أحادية الخلية للعلاج الموجه 

Carotid arteries are major blood vessels in the neck that supply blood and oxygen to the brain, but carotid stenosis occurs when carotid arteries are clogged by plaque. Revealing the cellular composition of the carotid artery at the single-cell level is essential for treating carotid atherosclerosis. However, there is no ready-to-use protocol for the preparation of single-cell suspensions from carotid arteries. To obtain a suitable protocol for the dissociation of normal carotid arteries at the single-cell level with less damage to cells, we designed a two-step digestion method by integrating the digestion process of collagenase/DNase and trypsin. Acridine orange/propidium iodide (AO/PI) dual-fluorescence counting was used to detect cell viability and concentration, and it was found that the single-cell suspension satisfied the requirements for single-cell sequencing, with the viability of cells over 85% and a high cell concentration. After single-cell data processing, a median of ~2500 transcripts per cell were detected in each carotid artery cell. Notably, a variety of cell types of the normal carotid artery, including vascular smooth muscle cells (VSMCs), fibroblasts, endothelial cells (ECs), and macrophages and dendritic cells (M&#966;/DCs), were concurrently detectable. This protocol may be applied to prepare a single-cell suspension of blood vessels from other tissues with appropriate modifications.

Here we describe a two-step cell digestion protocol for preparing a single-cell suspension of mouse carotid arteries.