قبل البدء في عملية الفحص ، ونحن بحاجة للتأكد من أن يتم إعداد بشكل صحيح الكواشف التالية : <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وفوسفات البوتاسيوم 50 ملي العازلة ، ودرجة الحموضة 7.5. يعد استخدام 11.4 ملغ / مل من ثنائي القاعدة phospate البوتاسيوم ، هيدرات في تنقية المياه وتعديل درجة الحموضة مع حمض الهيدروكلوريك 1M. يتم وضع هذا الحل في 37 درجة مئوية قبل الاستخدام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> A 0.65 ٪ حل الكازين الوزن / الحجم ، التي أعدها خلط 6،5 ملغ / مل من الكازين في المنطقة العازلة 50 مم فوسفات البوتاسيوم. زيادة درجة الحرارة تدريجيا مع التحريك حل لطيف 80-85 درجة مئوية لمدة 10 دقائق تقريبا حتى يتم التوصل إلى تشتت متجانسة. فمن المهم جدا ألا يغلي الحل. ثم يتم تعديل درجة الحموضة إذا لزم الأمر مع هيدروكسيد الصوديوم وحمض الهيدروكلوريك. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> A 110 ملي حل حمض حمض التريكلوروسيتيك ، التي أعدها تمييع a 1:55 الأسهم 6.1N مع تنقية المياه. حمض التريكلوروسيتيك حمض هو حمض قوي ، وينبغي التعامل معها بحذر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 0.5 مم و فولين Ciolcaltea ، أو الكاشف فولين الفينول ، والذي هو الحل الذي سوف تتفاعل مع التيروزين لتوليد تغيير لون قياسها التي من شأنها أن تكون ذات صلة مباشرة الى نشاط البروتياز. الكاشف فولين هو حمض الفينول ، وينبغي التعامل معها بحذر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> والصوديوم 500 مم حل كربونات ، أعدت باستخدام 53 ملغم / لتر من كربونات الصوديوم في المياه النقية anyhydrous. حلا مخفف الانزيم الذي يتكون من 10 ملي خلات الصوديوم العازلة مع خلات الكالسيوم 5mm ، و 7.5 درجة الحموضة ، في 37 درجة مئوية. هذا الحل هو ما نستخدمه لإذابة العينات البروتيني صلبة أو تمييع حلول الانزيم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> L - 1.1 ملم التيروزين محلول المخزون قياسي. أعدت باستخدام 0.2 ملغ / مل L - التيروزين في تنقية المياه وتسخينها برفق حتى يذوب التيروزين. كما هو الحال مع الكازين ، لا تغلي هذا الحل. يسمح المعيار L - التيروزين لتبرد إلى درجة حرارة الغرفة. وسوف تضعف هذا الحل أخرى لجعل منحنى لدينا القياسية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> البروتيني الحل. على الفور قبل استخدامه ، ويحل في محلول مخفف البروتيني الانزيم أعد في الخطوة 6. </li></ol> إذا كان ذلك ضروريا ، واستخدام عينة صلبة من نشاط الأنزيم البروتيني محددة سلفا ، والتي حلت به مخفف لانزيم 0،1-0،2 وحدة / مل. هذا الحل بمثابة مراقبة إيجابية على جودة الفحص والرقابة والتحقق من صحة الحسابات ونحن سوف تؤدي إلى تحديد نشاط انزيم. إعداد الفحص البروتياز والمنحنيات القياسية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لنبدأ هذا الاختبار ، والعثور على قنينة المناسبة التي ستعقد حوالي 15 مليليتر. لكل الانزيم الذي سيتم اختباره ، وهناك حاجة إلى 4 قوارير. وسيتم استخدام قارورة واحدة باعتبارها فارغة ، وسيتم استخدام ثلاثة آخرين لفحص النشاط ثلاثة من التخفيفات البروتيني. التخفيفات ثلاثة مفيدة عند فحص الحسابات النهائية ضد بعضها البعض. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> على كل مجموعة من أربع قوارير ، إضافة 5mls من حلنا الكازين 0.65 ٪. دعوهم توازن في حمام مائي عند 37 لمدة 5 دقائق درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة أحجام متفاوتة حل الانزيم الذي سيتم اختبار لثلاث من قوارير عينة الاختبار ، ولكن ليس فارغا. مزيج من قبل دوامات واحتضان لمدة 37 درجة مئوية لمدة عشر دقائق بالضبط. نشاط الأنزيم البروتيني والتحرر من التبعية التيروزين خلال هذه الفترة الحضانة هو ما سيتم قياس ومقارنة بين عينات الاختبار. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد هذا الاحتضان 10 دقيقة ، إضافة ملل 5 من كاشف TCA إلى كل أنبوب لمنع رد الفعل. ثم ، إضافة حجم مناسب لانزيم حل لكل أنبوب ، حتى فارغة ، بحيث الحجم النهائي من الحل الانزيم في كل أنبوب 1 مل. يتم ذلك لحساب قيمة الامتصاصية للانزيم نفسها ، لضمان أن حجم النهائي في كل أنبوب هو على قدم المساواة. احتضان الحلول في 37 دقيقة لمدة 30 درجة مئوية. خلال هذه الحضانة لمدة 30 دقيقة ، قد تحتاج لإعداد المعيار الخاص التخفيفات التيروزين. 6 الدرام استخدام قوارير (يمكن استبداله قارورة الدرام مع أنابيب البولي بروبلين) التي يمكن أن تعقد بسهولة 8 ملل. الى قارورة ستة إضافة 1.1 ملم التيروزين الحلول الأسهم القياسية مع وحدات التخزين التالية في ملل : 0.05 ، 0.10 ، 0.20 ، 0.40 ، 0.50. لا تضف أي معيار التيروزين إلى فارغة. قد تكون هناك حاجة لخفض معايير اختبار عينات من النجاسة التي سوف تسفر قليلا تغيير اللون. مرة واحدة تم إضافة حل التيروزين القياسية ، إضافة حجم مناسب من الماء النقي الى كل من معايير لتحقيق وحدة التخزين إلى 2 ملل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد حضانة لمدة 30 دقيقة ، كل مرشح للحلول اختبار فارغة وباستخدام حقنة 0.45 ميكرون polyethersulfone التصفية. مطلوب الترشيح لإزالة أي insolubles من العينات. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة ترشيح 2 ملل من عينات الاختبار والترشيح للقوارير فارغة الدرام 4 التي يمكن أن تعقد ما لا يقل عن 8 ملل. ويمكن استخدام نفس النوع من القنينة التي أعدت المعايير. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إلى كل من قوارير تحتوي على المعايير القياسية ، وفارغة ، إضافة 5mls من كربونات الصوديوم. للحصول على أفضل النتائج ، إضافة 1 مل من كاشف فولين بعد ذلك على الفور. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة كربونات الصوديوم لتنظيم أي انخفاض الرقم الهيدروجيني إنشاؤها بواسطة إضافة كاشف للفولين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة كربونات الصوديوم للعينات الاختبار والاحصائيينر فارغة. هذه الحلول يصبح غائما بعد إضافة كربونات الصوديوم. إضافة كاشف للفولين ، والتي سترد في المقام الأول مع التيروزين الحرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مزيج قارورة الدرام التي تدور في احتضان و37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. </li></ol> بعد هذه الحضانة ، يجب أن تلاحظ أن معايير لها تدرج اللون رابطا مع مبلغ من التيروزين المضافة ؛ أعلى تركيزات التيروزين أحلك الظهور. يمكنك تلاحظ أيضا تغيير لون ملموس في عينات الاختبار. 2mls يتم تصفيتها من هذه الحلول باستخدام حقنة 0.45 polyethersulfone أم تصفية في cuvettes مناسبة. والآن بعد أن يتم تنفيذ الفحص ، يمكنك الشروع في معمل لتسجيل القيم الامتصاصية لدينا. </li></ol> قياس وحساب امتصاص نشاط انزيم <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم قياس الامتصاصية للعينات من قبل معمل باستخدام الطول الموجي 660nm. يتم تعيين مسار الضوء ل1cm. سجل القيم الامتصاصية للمعايير وفارغ القياسية ، واختبار عينات مختلفة ، واختبار فارغة. مرة واحدة وقد تم جمع كافة البيانات ، يمكن إنشاء منحنى القياسية. يجب أن تكون محسوبة من أجل توليد المنحنى ، الاختلاف في الامتصاصية بين فارغة القياسية والمعايير. هذه هي القيمة التي تعزى إلى امتصاص كمية التيروزين في الحلول القياسية. بعد هذه العملية الحسابية البسيطة ، وخلق منحنى قياسي باستخدام برنامج الرسوم البيانية لرسم التغير في الامتصاصية من معاييرنا على المحور Y ، مقابل المبلغ المذكور في micromoles لكل من المعايير لدينا 5 على المحور X. <table style="width: 416px; height: 118px;;text-align:right;direction:rtl" border="0"><tbody><tr><th style="text-align:center"> حجم قياسي التيروسين </th><th style="text-align:center"> uMoles التيروسين </th></tr><tr><td style="text-align:center"> 0.05 </td><td style="text-align:center"> 0،055 </td></tr><tr><td style="text-align:center"> 0.10 </td><td style="text-align:center"> 0،111 </td></tr><tr><td style="text-align:center"> 0.20 </td><td style="text-align:center"> 0،221 </td></tr><tr><td style="text-align:center"> 0.40 </td><td style="text-align:center"> 0،442 </td></tr><tr><td style="text-align:center"> 0.50 </td><td style="text-align:center"> 0،553 </td></tr></tbody></table></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد أن تم إدخال نقاط البيانات ، إنشاء خط لأفضل لائقا والمناظرة المعادلة المنحدر. العثور على التغير في الامتصاصية في اختبار العينات عن طريق حساب الفرق بين عينة اختبار الامتصاصية والامتصاصية لاختبار فارغة. وإدراج قيمة الامتصاصية لأحد عينات اختبار في المعادلة المنحدر وحل النتيجة في micromoles المحررة من خلال هذا التفاعل التيروزين بروتين معين. للحصول على نشاط انزيم في وحدة في / مل ، وإجراء العملية الحسابية التالية : (المعادل التيروزين umole أفرج) × (11) وحدة / مل = أنزيم _________________________ (1) × (10) × (2) 11 = الحجم الكلي (في مل) من مقايسة 10 = وقت مقايسة (بالدقائق) وفقا لتعريف وحدة 1 = حجم استخدام انزيم (في مل) من أنزيم 2 = المجلد (في ملليلتر) المستخدمة في تحديد اللونية اتخاذ عدد من مكافئات micromoles التيروزين سراح الحصول عليها من معادلة الانحدار واضربها في الحجم الكلي للمقايسة في ملل ، والذي هو في حالتنا 11mls. تقسيم هذه القيمة من قبل ثلاثة كميات أخرى : الوقت للمقايسة ، والتي ركضنا لمدة 10 دقيقة ، وحجم انزيم المستخدمة في فحص ، الذي كان المتنوعة (دعونا نستخدم 1ml) ، وحجم ملليلتر المستخدمة في الكشف عن اللونية ، والتي قد تختلف استنادا كفيت الخاص. كنا 2 ملل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Micromoles من التيروزين مقسوما الوقت في قياس عوائد دقيقة من النشاط البروتيني يسمى &quot;الوحدات الخاصة&quot;. يمكننا أن يلغي وحدة لقياس الحجم في البسط والمقام ، وترك قيس من نشاط انزيم من حيث وحدة / مل. من أجل تحديد نشاط الأنزيم البروتيني في عينة صلبة مخففة في انزيم مخفف ، نقسم نشاطنا في وحدة / مل من تركيز المواد الصلبة المستخدمة في هذا الاختبار في الأصل ملغ / مل. ، وترك لنا مع النشاط من حيث وحدة / ملغ . وحدة / مل انزيم الوحدات / الصلبة ملغ = _____________________ ملغ الصلبة / انزيم مل </li></ol>

<ol>
	<li>Anson, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> J. Gen. Physiol. 22, 79-89 (1938).</li><li>Folin, O., Ciocalteau, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> J. Biol. Chem. 73, 627 (1929).</li></ol>

لقد أظهرنا لكم فقط كيفية تحليل نشاط الأنزيم البروتيني باستخدام سيغما نشاط الأنزيم البروتيني مقايسة عالمية. بالإضافة إلى ذلك ، هذا الاختبار هو مفيد للتأكد من أن لدينا البروتياز تحدد بدقة النشاط قبل الحصول عليها عن تجاربك. كما رأيتم ، عند القيام بهذا الإجراء ، فإنه من الأهمية بمكان أن نتذكر أن كلا من الحرارة الكازين والحلول التيروزين ببطء وعدم سلقها. أيضا ، من المهم جدا لإعداد الفراغات المختلفة لكل من المعايير الخاصة بك ولكل عينة الاختبار التي لديك.

<table><tbody><tr><td>Protease</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4630</td><td></td></tr><tr><td>Potassium Phosphate, Dibasic, Trihydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5504</td><td></td></tr><tr><td>Casein</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7078</td><td></td></tr><tr><td>Trichloroacetic Acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T0699</td><td></td></tr><tr><td>Folin &amp;amp; Ciocalteu&#039;s Phenol Reagent</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F9252</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Carbonate, Anhydrous</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2127</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Acetate, Trihydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8625</td><td></td></tr><tr><td>Calcium Acetate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1000</td><td></td></tr><tr><td>L-Tyrosine, Free Base</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T3754</td><td></td></tr><tr><td>Protease Profiler Kit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>PP0500</td><td></td></tr><tr><td>Protease Fluorescent Detection Kit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>PF0100</td><td></td></tr></tbody></table>

sigma's non-specific protease activity assay - casein as a substrate

البروتياز كسر سندات ببتيد. في المختبر ، فإنه غالبا ما يكون ضروريا لقياس و / أو مقارنة نشاط البروتياز. ويمكن استخدام سيجما نشاط الأنزيم البروتيني غير محددة مقايسة وإجراءات موحدة لتحديد نشاط البروتياز ، وهو ما نقوم به خلال إجراءات مراقبة الجودة لدينا. في هذا الاختبار ، الكازين بمثابة الركيزة. عندما البروتيني نحن اختبار الكازين هضم ، والأحماض الأمينية التيروسين يتحرر جنبا إلى جنب مع غيرها من الأحماض الأمينية وشظايا الببتيد. كاشف فولين وCiocalteus الفينول ، أو في المقام الأول فولين يتفاعل مع التيروزين مجانا لإنتاج حامل اللون الأزرق اللون ، الذي هو قياس الكمي وكقيمة الامتصاصية على معمل. أكثر التيروزين التي يتم تحريرها من الكازين ، وأكثر يتم إنشاء chromophores وأقوى من نشاط الأنزيم البروتيني. تتم مقارنة القيم الامتصاصية التي تم إنشاؤها بواسطة نشاط الأنزيم البروتيني إلى منحنى القياسية ، التي تم إنشاؤها بواسطة تفاعل كميات معروفة من التيروزين مع كاشف FC لربط التغيرات في الامتصاصية مع مبلغ من التيروزين في micromoles. ويمكن من المنحنى القياسي يحدد نشاط الأنزيم البروتيني عينات من حيث الوحدات ، وهو المبلغ الذي micromoles في المعادلة التيروزين أفرج عنه من الكازين في الدقيقة الواحدة. لعرض هذه المادة باللغة الصينية ، <a href="http://jove.com/index/details.stp?ID=910">انقر هنا</a>

Watch this Scientific Journal Video about Sigma's Non-specific Protease Activity Assay - Casein as a Substrate at JoVE.com

Sigma's Non-specific Protease Activity Assay - Casein as a Substrate

البروتياز كسر سندات ببتيد. في المختبر ، فإنه غالبا ما يكون ضروريا لقياس و / أو مقارنة نشاط البروتياز. ويمكن استخدام سيجما نشاط الأنزيم البروتيني غير محددة مقايسة وإجراءات موحدة لتحديد نشاط البروتياز.

سيجما للنشاط غير محددة البروتياز الفحص -- باعتباره الركيزة الكازين

Proteases break peptide bonds. In the lab, it is often necessary to measure and/or compare the activity of proteases.  Sigma's non-specific protease ...

<a class="grey_button" href="/video/910">
ChineseVersion
</a>

sigma-s-non-specific-protease-activity-assay-casein-as-a-substrate

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Organic Chemistry

Biology

Unit 1

Alcohols and Phenols

SCIENTISTS IN ACTION

76.3K Views.  Sigma Aldrich.  ChineseVersion 

Video: Sigma's Non-specific Protease Activity Assay - Casein as a Substrate

The Determination of Protease Specificity in Mouse Tissue Extracts by MALDI-TOF Mass Spectrometry: Manipulating PH to Cause Specificity Changes

Proteases have several biological functions, including protein activation/inactivation and food digestion. Identifying protease specificity is important for revealing protease function. The method proposed in this study determines protease specificity by measuring the molecular weight of unique substrates using Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-Flight (MALDI-TOF) mass spectrometry. The substrates contain iminobiotin, while the cleaved site consists of amino acids, and the spacer consists of polyethylene glycol. The cleaved substrate will generate a unique molecular weight using a cleaved amino acid. One of the merits of this method is that it may be carried out in one pot using crude samples, and it is also suitable for assessing multiple samples. In this article, we describe a simple experimental method optimized with samples extracted from mouse lung tissue, including tissue extraction, placement of digestive substrates into samples, purification of digestive substrates under different pH conditions, and measurement of the substrates&#39; molecular weight using MALDI-TOF mass spectrometry. In summary, this technique allows for the identification of protease specificity in crude samples derived from tissue extracts using MALDI-TOF mass spectrometry, which may easily be scaled up for multiple sample processing.

Here, we present a protocol to determine protease specificity in crude mouse tissue extracts using MALDI-TOF spectrometry.

مقتطفات البت في حوزتي خصوصية في الأنسجة الماوس باستخدام TOF الكتلي: التلاعب بدرجة الحموضة تسبب التغييرات النوعية

Proteases have several biological functions, including protein activation/inactivation and food digestion. Identifying protease specificity is important ...

Biochemistry

Detection of Protease Activity by Fluorescent Peptide Zymography

The purpose of this method is to measure the proteolytic activity of complex biological samples. The samples are separated by molecular weight using electrophoresis through a resolving gel embedded with a degradable substrate. This method differs from traditional gel zymography in that a quenched fluorogenic peptide is covalently incorporated into the resolving gel instead of full length proteins, such as gelatin or casein. Use of the fluorogenic peptides enables direct detection of proteolytic activity without additional staining steps. Enzymes within the biological samples cleave the quenched fluorogenic peptide, resulting in an increase in fluorescence. The fluorescent signal in the gels is then imaged with a standard fluorescent gel scanner and quantified using densitometry. The use of peptides as the degradable substrate greatly expands the possible proteases detectable with zymographic techniques.

Here, we present a detailed protocol for a modified zymographic technique in which fluorescent peptides are used as the degradable substrate in place of native proteins. Electrophoresis of biological samples in fluorescent peptide zymograms enables detection of a wider range of proteases than previous zymographic techniques.

الكشف عن نشاط البروتياز الببتيد نيون زيموجرافي

The purpose of this method is to measure the proteolytic activity of complex biological samples. The samples are separated by molecular weight using ...

Cancer Research

A Fluorogenic Peptide Cleavage Assay to Screen for Proteolytic Activity: Applications for coronavirus spike protein activation

Enveloped viruses such as coronaviruses or influenza virus require proteolytic cleavage of their fusion protein to be able to infect the host cell. Often viruses exhibit cell and tissue tropism and are adapted to specific cell or tissue proteases. Moreover, these viruses can introduce mutations or insertions into their genome during replication that may affect the cleavage, and thus can contribute to adaptations to a new host. Here, we present a fluorogenic peptide cleavage assay that allows a rapid screening of peptides mimicking the cleavage site of viral fusion proteins. The technique is very flexible and can be used to investigate the proteolytic activity of a single protease on many different substrates, and in addition, it also allows exploration of the activity of multiple proteases on one or more peptide substrates. In this study, we used peptides mimicking the cleavage site motifs of the coronavirus spike protein. We tested human and camel derived Middle East Respiratory Syndrome coronaviruses (MERS-CoV) to demonstrate that single and double substitutions in the cleavage site can alter the activity of furin and dramatically change cleavage efficiency. We also used this method in combination with bioinformatics to test furin cleavage activity of feline coronavirus spike proteins from different serotypes and strains. This peptide-based method is less labor- and time intensive than conventional methods used for the analysis of proteolytic activity for viruses, and results can be obtained within a single day.

We present a fluorogenic peptide cleavage assay that allows a rapid screening of the proteolytic activity of proteases on peptides representing the cleavage site of viral fusion peptides. This method can also be used on any other amino acid motif within a protein sequence to test for the protease activity.

"مقايسة الانقسام الببتيد فلوروجينيك" على الشاشة "النشاط بروتيوليتيك": تطبيقات للفيروس التاجي المسبّب لارتفاع البروتين التنشيط

Enveloped viruses such as coronaviruses or influenza virus require proteolytic cleavage of their fusion protein to be able to infect the host cell. Often ...

Use of the Protease Fluorescent Detection Kit to Determine Protease Activity

The Protease Fluorescent Detection Kit provides ready-to-use reagents for detecting the presence of protease activity. This simple assay to detect protease activity uses casein labeled with fluorescein isothiocyanate (FITC) as the substrate.
Protease activity results in the cleavage of the FITC-labeled casein substrate into smaller fragments, which do not precipitate under acidic conditions. After incubation of the protease sample and substrate, the reaction is acidified with the addition of trichloroacetic acid (TCA). The mixture is then centrifuged with the undigested substrate forming a pellet and the smaller, acid soluble fragments remaining in solution. The supernatant is neutralized and the fluorescence of the FITC-labeled fragments is measured.
The described kit procedure detects the trypsin protease control at a concentration of approximately 0.5 &mu;g/ml (5 ng of trypsin added to the assay). This sensitivity can be increased with a longer incubation time, up to 24 hours. The assay is performed in microcentrifuge tubes and procedures are provided for fluorescence detection using either cuvettes or multiwell plates.

The Protease Fluorescent Detection Kit is designed for the measurement of protease activity using fluorometry. It is also suitable for detection of trace amounts of protease contamination. The method is based on the proteolytic hydroysis of a proprietary formulation of a FITC-labeled casein substrate.

استخدام أدوات الكشف البروتياز نيون تحديد نشاط الأنزيم البروتيني

The Protease Fluorescent Detection Kit provides ready-to-use reagents for detecting the presence of protease activity. This simple assay to detect ...

The Importance of Correct Protein Concentration for Kinetics and Affinity Determination in Structure-function Analysis 

In this study, we explore the interaction between the bovine cysteine protease inhibitor cystatin B and a catalytically inactive form of papain (Fig. 1), a plant cysteine protease, by real-time label-free analysis using Biacore X100. Several cystatin B variants with point mutations in areas of interaction with papain, are produced. For each cystatin B variant we determine its specific binding concentration using calibration-free concentration analysis (CFCA) and compare the values obtained with total protein concentration as determined by A280. After that, the kinetics of each cystatin B variant binding to papain is measured using single-cycle kinetics (SCK). We show that one of the four cystatin B variants we examine is only partially active for binding. This partial activity, revealed by CFCA, translates to a significant difference in the association rate constant (ka) and affinity (KD), compared to the values calculated using total protein concentration. Using CFCA in combination with kinetic analysis in a structure-function study contributes to obtaining reliable results, and helps to make the right interpretation of the interaction mechanism.

The Importance of Correct Protein Concentration for Kinetics and Affinity Determination in Structure-function Analysis

We apply label-free protein interaction analysis using Biacore X100 for structure-function analysis of the binding of several cystatin B mutants to papain through kinetic characterization. Calibration-free concentration analysis (CFCA) measures the concentration of protein with retained binding activity without the need for a standard curve. We show that confirmation of concentrations using CFCA increases the reliability of the kinetic analysis and that kinetic constants can reliably be determined even if the activity of a recombinant protein is reduced.

على أهمية تركيز البروتين الصحيح لحركية وتقارب في تحديد هيكل وظيفة التحليل

In this study, we explore the interaction between the bovine cysteine protease inhibitor cystatin B and a catalytically inactive form of papain (Fig. 1), ...

Qualitative and Quantitative Assays for Detection and Characterization of Protein Antimicrobials

Initial evaluations of large microbial libraries for potential producers of novel antimicrobial proteins require both qualitative and quantitative methods to screen for target enzymes prior to investing greater research effort and resources. The goal of this protocol is to demonstrate two complementary assays for conducting these initial evaluations. The microslide diffusion assay provides an initial or simple detection screen to enable the qualitative and rapid assessment of proteolytic activity against an array of both viable and heat-killed bacterial target substrates. As a counterpart, the increased sensitivity and reproducibility of the dye-release assay provides a quantitative platform for evaluating and comparing environmental influences affecting the hydrolytic activity of protein antimicrobials. The ability to label specific heat-killed cell culture substrates with Remazol brilliant blue R dye expands this capability to tailor the dye-release assay to characterize enzymatic activity of interest.

Here, we present protocols to rapidly screen and characterize enzymes for antimicrobial activity. The microslide diffusion assay and the dye-release assay utilize target bacterial substrates for qualitative and quantitative enzymatic activity evaluation.

فحوصات النوعية والكمية للكشف وتوصيف مضادات الميكروبات البروتين

Initial evaluations of large microbial libraries for potential producers of novel antimicrobial proteins require both qualitative and quantitative methods ...

Immunology and Infection

Concanavalin A-Based Sedimentation Assay to Measure Substrate Binding of Glucan Phosphatases

Glucan phosphatases belong to the larger family of dual specificity phosphatases (DSP) that dephosphorylate glucan substrates, such as glycogen in animals and starch in plants. The crystal structures of glucan phosphatase with model glucan substrates reveal distinct glucan-binding interfaces made of DSP and carbohydrate-binding domains. However, quantitative measurements of glucan-glucan phosphatase interactions with physiologically relevant substrates are fundamental to the biological understanding of the glucan phosphatase family of enzymes and the regulation of energy metabolism. This manuscript reports a Concanavalin A (ConA)-based in vitro sedimentation assay designed to detect the substrate binding affinity of glucan phosphatases against different glucan substrates.&#160;As a proof of concept, the dissociation constant (KD) of glucan phosphatase Arabidopsis thaliana Starch Excess4 (SEX4) and amylopectin was determined. The characterization of SEX4 mutants and other members of the glucan phosphatase family of enzymes further demonstrates the utility of this assay to assess the differential binding of protein- carbohydrate interactions. These data demonstrate the suitability of this assay to characterize a wide range of starch and glycogen interacting proteins.

This method describes a lectin-based in vitro sedimentation assay to quantify the binding affinity of glucan phosphatase and amylopectin. This co-sedimentation assay is reliable for measuring glucan phosphatase substrate binding and can be applied to various solubilized glucan substrates.

مقايسة الترسيب القائمة على Concanavalin A لقياس ارتباط الركيزة لفوسفاتاز الجلوكان

Glucan phosphatases belong to the larger family of dual specificity phosphatases (DSP) that dephosphorylate glucan substrates, such as glycogen in animals ...

Detection of Functional Matrix Metalloproteinases by Zymography

Matrix metalloproteinases (MMPs) are zinc-containing endopeptidases. They degrade proteins by cleavage of peptide bonds. More than twenty MMPs have been identified and are separated into six groups based on their structure and substrate specificity (collagenases, gelatinases, membrane type [MT-MMP], stromelysins, matrilysins, and others). MMPs play a critical role in cell invasion, cartilage degradation, tissue remodeling, wound healing, and embryogenesis. They therefore participate in both normal processes and in the pathogenesis of many diseases, such as rheumatoid arthritis, cancer, or chronic obstructive pulmonary disease1-6. Here, we will focus on MMP-2 (gelatinase A, type IV collagenase), a widely expressed MMP. We will demonstrate how to detect MMP-2 in cell culture supernatants by zymography, a commonly used, simple, and yet very sensitive technique first described in 1980 by C. Heussen and E.B. Dowdle7-10. This technique is semi-quantitative, it can therefore be used to determine MMP levels in test samples when known concentrations of recombinant MMP are loaded on the same gel11.
Solutions containing MMPs (e.g. cell culture supernatants, urine, or serum) are loaded onto a polyacrylamide gel containing sodium dodecyl sulfate (SDS; to linearize the proteins) and gelatin (substrate for MMP-2). The sample buffer is designed to increase sample viscosity (to facilitate gel loading), provide a tracking dye (bromophenol blue; to monitor sample migration), provide denaturing molecules (to linearize proteins), and control the pH of the sample. Proteins are then allowed to migrate under an electric current in a running buffer designed to provide a constant migration rate. The distance of migration is inversely correlated with the molecular weight of the protein (small proteins move faster through the gel than large proteins do and therefore migrate further down the gel). After migration, the gel is placed in a renaturing buffer to allow proteins to regain their tertiary structure, necessary for enzymatic activity. The gel is then placed in a developing buffer designed to allow the protease to digest its substrate. The developing buffer also contains p-aminophenylmercuric acetate (APMA) to activate the non-proteolytic pro-MMPs into active MMPs. The next step consists of staining the substrate (gelatin in our example). After washing the excess dye off the gel, areas of protease digestion appear as clear bands. The clearer the band, the more concentrated the protease it contains. Band staining intensity can then be determined by densitometry, using a software such as ImageJ, allowing for sample comparison.

This protocol describes an activity-based assay for detecting matrix metalloproteinases in culture supernatants or body fluids.

الكشف عن مصفوفة Metalloproteinases الوظيفية التي Zymography

Matrix metalloproteinases (MMPs) are zinc-containing endopeptidases. They degrade proteins by cleavage of peptide bonds. More than twenty MMPs have been ...

Direct Detection of Isolevuglandins in Tissues Using a D11 scFv-Alkaline Phosphatase Fusion Protein and Immunofluorescence

Isolevuglandins (IsoLGs) are highly reactive gamma ketoaldehydes formed from H2-isoprostanes through lipid peroxidation and crosslink proteins leading to inflammation and various diseases including hypertension. Detection of IsoLG accumulation in tissues is crucial in shedding light on their involvement in the disease processes. However, measurement of IsoLGs in tissues is extremely difficult, and currently available tools, including mass spectrometry analysis, are laborious and extremely expensive. Here we describe a novel method for in situ detection of IsoLGs in tissues using alkaline phosphatase-conjugated D11 ScFv and a recombinant phage-display antibody produced in E. coli by immunofluorescent microscopy. Four controls were used for validating the staining: (1) staining with and without D11, (2) staining with bacterial periplasmic extract with the alkaline phosphatase linker, (3) irrelevant scFV antibody staining, and (4) competitive control with IsoLG prior to the staining. We demonstrate the effectiveness of the alkaline phosphatase-conjugated D11 in both human and mouse tissues with or without hypertension. This method will likely serve as an important tool to study the role of IsoLGs in a wide variety of disease processes.

This article provides a detailed methodology for the measurement of isolevuglandins in tissues by immunofluorescence using alkaline phosphatase-conjugated ScFv D11 antibody. Hypertension models in both mice and humans are used to explain the step-by-step procedures and fundamental principles associated with isolevuglandin measurement in tissue samples.

الكشف المباشر عن الأيزوليفوغلاندين في الأنسجة باستخدام بروتين اندماج الفوسفاتيز القلوي D11 scFv والتألق المناعي

Isolevuglandins (IsoLGs) are highly reactive gamma ketoaldehydes formed from H2-isoprostanes through lipid peroxidation and crosslink proteins leading to ...

A Fluorogenic Peptide Cleavage Assay to Screen the Proteolytic Activity of Proteases

Source: Jaimes, J. A., et al. <a href="https://app.jove.com/v/58892">A Fluorogenic Peptide Cleavage Assay to Screen for Proteolytic Activity: Applications for coronavirus spike protein activation.</a> J. Vis. Exp. (2019).
This video demonstrates an assay to screen for the proteolytic activity of proteases using fluorogenic peptides. The protease recognizes its cleavage site on the peptide, cleaving it and separating the quencher from the fluorophore, enabling its fluorescence emission. The fluorescence signal is detected and analyzed to check for the cleavage efficiency of different peptide variants.

سيجما للنشاط غير محددة البروتياز الفحص -- باعتباره الركيزة الكازين

Transcript

Summary

Explore More Videos

PLAYLIST